李繼洋 雷建峰 代培紅 姚 瑞 曲延英 陳全家 李 月 劉曉東

新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 / 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 新疆烏魯木齊 830052

棉花是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物和紡織工業(yè)原料。隨著我國(guó)科技水平的飛速發(fā)展, 棉花種植業(yè)經(jīng)歷了近20年的蓬勃成長(zhǎng), 棉花的總產(chǎn)量及單位面積產(chǎn)量得到了成倍的增長(zhǎng), 目前已進(jìn)入世界棉花高產(chǎn)國(guó)行列[1]。盡管棉花產(chǎn)業(yè)飛速發(fā)展, 但棉花生產(chǎn)中依然面臨諸多急需解決的問(wèn)題, 如干旱和鹽脅迫是影響我國(guó)作物生產(chǎn)最主要的非生物脅迫因子[2-3]; 枯、黃萎病是世界級(jí)的植物病害, 對(duì)棉花生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失;造成生產(chǎn)的棉花纖維品質(zhì)較低, 生產(chǎn)成本居高不下[4-5]植棉效益日益降低, 嚴(yán)重影響了我國(guó)棉花的生產(chǎn)安全[6]。要從根本上解決這些問(wèn)題就需要培育出抗病抗逆優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)高效的棉花新種質(zhì), 而創(chuàng)制出這些新種質(zhì)最終需要棉花生物學(xué)作為理論基礎(chǔ), 需要棉花功能基因組學(xué)來(lái)解析農(nóng)藝性狀調(diào)控的基因網(wǎng)絡(luò)[7-9]。近幾年新的基因組編輯技術(shù)的誕生和發(fā)展, 為挖掘棉花農(nóng)藝性狀關(guān)鍵調(diào)控功能基因提供了強(qiáng)大的技術(shù)工具, 不僅如此, 基因組編輯技術(shù)還有助于用來(lái)創(chuàng)造更多優(yōu)異的育種材料[10]。

CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated nuclease 9, Cas9)基因組編輯技術(shù)是2013年在國(guó)際上興起的一種可以針對(duì)基因組靶向修飾的技術(shù)[11]。該技術(shù)起源于細(xì)菌長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中產(chǎn)生的一套免疫機(jī)制[12],包括 2個(gè)主要部分即小片段單鏈向?qū)?RNA (single guide RNA, sgRNA)和具有靶向識(shí)別sgRNA的核酸酶Cas9。通過(guò)帶有靶向序列的sgRNA引導(dǎo)Cas9核酸酶在基因組特異性位點(diǎn)(PAM)附近切割, 最終由細(xì)胞啟動(dòng)基因組同源重組修復(fù)(HR)或非同源末端連接(NHEJ)導(dǎo)致基因組序列可逆或不可逆突變[13-14]。由于基因組編輯過(guò)程必須依賴(lài)內(nèi)切核酸酶對(duì)基因組的切割, 因此, 理論上, 當(dāng)基因組雙鏈斷裂修復(fù)時(shí),在其修復(fù)位點(diǎn)可以進(jìn)行基因組定向插入、缺失、置換等類(lèi)型的核苷酸修飾[14-15], 由于sgRNA可以根據(jù)基因組不同位點(diǎn)單獨(dú)設(shè)計(jì)靶向序列而無(wú)需考慮Cas9核酸酶的特異性, 因此相比鋅指核酸酶(zinc-finger nuclease, ZFN)和類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease, TALEN)等基因組編輯技術(shù), CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)操作更加簡(jiǎn)便, 成本更低, 編輯效率更高, 基因編輯更加精準(zhǔn), 脫靶效應(yīng)更低[15-17], 目前已在多種植物中被成功應(yīng)用[18-22], 在作物功能基因組學(xué)研究中展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景[9,22-24]。CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)體系中U6或U3啟動(dòng)子是驅(qū)動(dòng)sgRNA轉(zhuǎn)錄的重要元件, 最近利用擬南芥 U6啟動(dòng)子在棉花(Gossypium hirsutum Linn, 陸地棉)中已成功建立了CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)體系[25-26]。然而利用海島棉內(nèi)源U6啟動(dòng)子在海島棉中建立CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)體系的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

在擬南芥中, I型香葉酰基轉(zhuǎn)移酶 AtGGB蛋白通過(guò)對(duì)底物蛋白異戊二烯化的修飾[27-28], 調(diào)控了氣孔的關(guān)閉, 在擬南芥抗旱反應(yīng)中起負(fù)調(diào)控作用, ggb突變體的失水率明顯低于野生型, 其抗旱性高于對(duì)照[29]。在棉花二倍體基因組中有一個(gè)單拷貝的與AtGGB高度同源的基因(蛋白同源性為 59%)。本研究利用棉花內(nèi)源的 U6啟動(dòng)子[30], 在棉花中成功地建立了 CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)體系, 并驗(yàn)證了棉花基于GGB和ERA1基因在該技術(shù)體系中靶位點(diǎn)的有效性, 為后續(xù)研究棉花 GGB基因的抗旱功能、創(chuàng)制新的棉花抗旱種質(zhì)資源和進(jìn)行棉花功能基因組學(xué)研究奠定了重要的技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

原生質(zhì)體制備所用的供試材料為新海16胚性愈傷組織, 由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供, 由本實(shí)驗(yàn)室自行擴(kuò)繁獲得, 載體 GbU6-4P::GUS-sgRNA和 GbU6-5P::GUS-sgRNA由本實(shí)驗(yàn)室保存, 兩種不同密碼子優(yōu)化的 Cas9基因(Cas9-I和Cas9-II)分別由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院馮爭(zhēng)艷和中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所孟志剛惠贈(zèng),限制性?xún)?nèi)切酶和 DNA聚合酶均為 NEB和 Thermo公司產(chǎn)品, 纖維素酶和離析酶由IUZMI株式會(huì)社代理提供, 其余試劑及藥品均由國(guó)內(nèi)生物公司代銷(xiāo), 引物合成及測(cè)序由上海杰李生物科技有限公司完成。

1.2 載體構(gòu)建

以新海16基因組DNA為模板, 克隆GbGGB和GbERA1基因部分序列, 用于尋找合適的靶序列。靶序列的設(shè)計(jì)基于以下原則: (1)在四倍體棉花新海16中A組和D組的序列完全一樣; (2)具有合適的限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn); (3) GC含量在40%～60%之間。將經(jīng)過(guò)DNA復(fù)性反應(yīng)后的靶序列分別連接于以Bbs I酶切獲得的 GbU6-4P::GUS-sgRNA和 GbU6-5P::GUS-sgRN A線性化載體, 以不含靶序列的GbU6-4P-sgRNA和GbU6-5P-sgRNA載體作為陰性對(duì)照。反應(yīng)體系為 20 μL, 包括 10 μmol L–1的上下游靶序列(表 1)各 10 μL, 復(fù)性程序?yàn)?95～20°C, 每 5 s降低 0.5°C。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證獲得上述 GbU6-4P(5P)::GGB-sgRNA和GbU6-4P(5P)::ERA1-sgRNA質(zhì)粒正確后, 再將其以酶切連接方式(以 Kpn I、Hind III酶切 Cas9-I載體, 以 Kpn I、Xba I酶切 Cas9-II載體)分別連接在2種不同密碼子優(yōu)化的 Cas9基因表達(dá)載體上(圖 1), 分別命名為 GbU6-5P(4P)::GGB-sgRNA-Cas9I、GbU6-5P(4P)::ERA1-sgRNA-Cas9I和GbU6-5P(4P)::GGB-sgRNA-Cas9II、GbU6-5P(4P)::ERA1-sgRNA-Cas9II。

圖1 海島棉基因組編輯載體結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 1 Sketch map of genome editing structure of cotton (Gossypium barbadense L.)

表1 本研究使用的引物信息Table 1 Primers used in this study

1.3 富集高濃度PCR片段

將構(gòu)建的編輯載體酶切檢測(cè)正確后, 進(jìn)行80～200不等倍數(shù)稀釋, 利用富集引物(FJ, 表 1), 采用超保真pfu fast fly (北京全式金)擴(kuò)增編輯載體的核心系統(tǒng)區(qū)域, 參照說(shuō)明書(shū)推薦體系, PCR 產(chǎn)物加入等體積的酚、氯仿、異戊醇(1∶1∶1), 劇烈混勻后, 10 000×g離心 3 min; 取上清液至新離心管中,加入1/10上清液體積的醋酸鈉(3 mol L–1, pH 5.2)和2.5倍上清液體積的預(yù)冷(–20°C)的無(wú)水乙醇, 混勻于–20°C 放置 10 min后, 于 4°C 下 10 000×g離心 5 min; 棄上清液, 加入 1 mL 75%酒精潤(rùn)洗后,10 000×g離心2 min; 吸盡上清液, 室溫放置 5 min待酒精揮發(fā)完后, 加雙蒸水溶解并調(diào)整濃度至0.5～1.0 μg μL–1, –20°C 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 原生質(zhì)體的制備與轉(zhuǎn)化

選擇新海16擴(kuò)繁培養(yǎng)約15 d的胚性愈傷組織作為原生質(zhì)體制備材料, 采用纖維素酶和離析酶雙酶體系制備原生質(zhì)體, 以改良的 CPW (甘露醇濃度增至0.5 mol L–1, 額外添加 0.1% BSA)溶液[1]作為酶解反應(yīng)的母液, 20 mL酶解體系包括12 mL超純水、CPW 大量母液(10×) 2 mL、CPW 微量(1000×) 20 μL、0.5 mol L–1甘露醇、10 mmol L–1MES、2%纖維素酶、1%離析酶, 55°C孵育 10 min, 待溶液恢復(fù)至室溫,加入0.1% BSA, 再定容至20 mL, 使用前用0.22 μm濾膜抽濾制成酶解工作液, 取10 mL上述工作液轉(zhuǎn)移至70 mm無(wú)菌培養(yǎng)皿, 將顆粒大小約3 mm的棉花胚性愈傷組織均勻地鋪在酶解液表面, 輕微晃動(dòng)平皿, 使胚性愈傷組織與酶解液充分接觸, 于 28°C,50 r min–1避光酶解反應(yīng)14 h以上。取10 μg富集的PCR產(chǎn)物, 方法參照擬南芥原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法[31]直接轉(zhuǎn)化棉花原生質(zhì)體, 過(guò)程略有改進(jìn), 懸浮原生質(zhì)體不使用MMG溶液, 采取振蕩過(guò)夜孵育, 于28°C,50 r min–1避光過(guò)夜孵育轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體。

1.5 內(nèi)源靶基因編輯效應(yīng)的檢測(cè)

過(guò)夜孵育轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體經(jīng)鏡檢后, 采用12 000 r min–1離心1 min收集沉淀, 棄去上清液后,用于基因組 DNA提取, 方法參照 Trans Easypure plant Genomic DNA Kit操作要求, 將提取的DNA經(jīng)過(guò)濃度檢測(cè)后, 取等質(zhì)量提取的 DNA, 采用 guide RNA序列上選擇的檢測(cè)用限制性?xún)?nèi)切酶(GbERA1采用Nsi I、GbGGB采用Sca I酶切)進(jìn)行過(guò)夜酶切和不酶切2種處理, 分別以2種處理的原生質(zhì)體DNA為模板, 進(jìn)行PCR檢測(cè), PCR反應(yīng)體系參照NEB公司Phusion超保真 DNA聚合酶推薦反應(yīng)體系, 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.6 編輯靶序列的克隆測(cè)序

采用EasyPure Quick Gel Extraction Kit (北京全式金)回收上述 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,參照試劑盒說(shuō)明書(shū)方法, 取 4 μL 產(chǎn)物于 25°C, 5 min與 pEASY-Blunt Zero Cloning (北京全式金)載體連接, 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans T1, 37°C過(guò)夜培養(yǎng), 以M13測(cè)序引物進(jìn)行菌落PCR鑒定, 挑取陽(yáng)性單克隆于液體LB培養(yǎng)基中過(guò)夜活化, 用于測(cè)序,采用 DNAstar和DNAMAN軟件比對(duì)分析測(cè)序序列。

1.7 靶基因內(nèi)不同區(qū)域突變頻率的計(jì)算

從轉(zhuǎn)化未酶切PCR產(chǎn)物的Trans T1過(guò)夜培養(yǎng)的平皿中, 隨機(jī)挑選100個(gè)長(zhǎng)勢(shì)均一的單菌落測(cè)序, 通過(guò)DNAstar軟件比對(duì)測(cè)序結(jié)果, 統(tǒng)計(jì)Test檢測(cè)區(qū)域與guide RNA結(jié)合的靶序列區(qū)30 bp及其前后各3個(gè)30 bp區(qū)域堿基突變個(gè)數(shù)并計(jì)算相應(yīng)區(qū)域堿基突變頻率,利用制圖軟件繪制Test區(qū)域堿基突變頻率折線圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 編輯載體構(gòu)建

采用酶切方式檢測(cè)上述構(gòu)建的載體, 酶切結(jié)果符合預(yù)期設(shè)計(jì), 證明連接 GbU6-5P、GbGGB和GbERA1不同靶序列、以及含有不同密碼子優(yōu)化的Cas9的編輯載體均構(gòu)建成功(圖 2)?；?GbU6-4P的編輯載體鑒定結(jié)果圖略。

圖2 基因編輯載體的酶切鑒定Fig. 2 Restriction enzyme digestion identification of gene editing vector

2.2 原生質(zhì)體制備與轉(zhuǎn)化

體系優(yōu)化獲得的原生質(zhì)體在顯微鏡下呈圓球狀,形態(tài)飽滿, 符合去壁細(xì)胞形態(tài), 經(jīng)計(jì)算其數(shù)量可達(dá)1×106個(gè) mL–1以上, 細(xì)胞活性染色劑抽樣鏡檢檢測(cè)顯示, 僅極少原生質(zhì)體為破碎或失活狀態(tài), 證明使用該體系制備的原生質(zhì)體可以滿足本研究的后續(xù)試驗(yàn)要求。經(jīng)轉(zhuǎn)化并過(guò)夜孵育后的原生質(zhì)體, 未出現(xiàn)細(xì)胞成簇聚集現(xiàn)象, 細(xì)胞均勻懸浮于轉(zhuǎn)化液中, 經(jīng)細(xì)胞活性和熒光檢測(cè), 細(xì)胞大部分呈現(xiàn)正?；钚誀顟B(tài),說(shuō)明該體系可以用于棉花原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化(圖3)。

圖3 棉花原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化前后形態(tài)圖Fig. 3 Morphological changes of cotton protoplasts before and after transformation

2.3 CRISPR/Cas9基因組編輯效應(yīng)檢測(cè)

使用GbU6-5P啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)GbERA1和GbGGB各2條guide RNA的轉(zhuǎn)錄, 同時(shí)再與兩種Cas9基因組合構(gòu)建基因編輯載體。對(duì)這8種基因編輯載體轉(zhuǎn)化獲得的原生質(zhì)體基因組 DNA, 進(jìn)行酶切/PCR檢測(cè)(檢測(cè)原理見(jiàn)圖4)后發(fā)現(xiàn), 酶切前的樣品和對(duì)照都能擴(kuò)增出預(yù)期大小的條帶, 而且亮度基本相同。而酶切后對(duì)照幾乎沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物, 但樣品卻擴(kuò)增出與酶切前樣品同樣大小的條帶, 表明轉(zhuǎn)化基因編輯載體的原生質(zhì)體內(nèi), 目標(biāo)基因靶序列酶切位點(diǎn)處出現(xiàn)突變, 導(dǎo)致限制性?xún)?nèi)切酶不能切割 DNA, 維持了模板DNA的完整性, 所以擴(kuò)增出預(yù)期大小的條帶, 而對(duì)照未發(fā)現(xiàn)明顯的突變現(xiàn)象(圖 5)。對(duì)酶切/PCR片段克隆測(cè)序表明, 在GGB基因靶位點(diǎn)上, 位于PAM位點(diǎn)上游限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)區(qū)域堿基組成均出現(xiàn)不同類(lèi)型的突變(圖 6～圖 8), 其中以堿基替換為主(包括轉(zhuǎn)換和顛換), 僅在少數(shù)突變位點(diǎn)檢測(cè)到堿基缺失現(xiàn)象(圖8)。與此同時(shí)對(duì)于ERA1基因靶位點(diǎn)和使用GbU6-4啟動(dòng)子的樣品, 結(jié)果也基本相似(結(jié)果圖略)。為了排除PCR擴(kuò)增導(dǎo)致上述的堿基突變, 對(duì)于GbGGB-sgRNA2靶位點(diǎn), 我們對(duì)酶切前原生質(zhì)體基因組 DNA進(jìn)行同樣的 PCR擴(kuò)增, 其擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序。在 100個(gè)陽(yáng)性克隆測(cè)序結(jié)果中, 分別對(duì)在靶序列30個(gè)堿基區(qū)域內(nèi)和兩側(cè)相鄰各3個(gè)30 bp區(qū)域內(nèi)堿基的突變頻率進(jìn)行分析, 結(jié)果顯示靶序列30個(gè)堿基區(qū)域內(nèi)的堿基突變頻率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于兩側(cè)相鄰各3個(gè)30 bp區(qū)域內(nèi)堿基的突變頻率(圖9)。表明靶序列區(qū)堿基的突變確實(shí)是CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因編輯的結(jié)果。上述結(jié)果證明基于海島棉 GbU6-4和GbU6-5啟動(dòng)子的 CRISPR/Cas9基因編輯載體系統(tǒng)均能在海島棉中實(shí)現(xiàn)靶向基因編輯的功能。

圖4 酶切/PCR檢測(cè)CRISPR/Cas9基因組編輯效應(yīng)原理示意圖Fig. 4 Schematic diagram of digestion /PCR for editing effect of CRISPR/Cas9

圖5 酶切/PCR檢測(cè)CRISPR/Cas9基因組編輯效應(yīng)Fig. 5 Digestion /PCR for editing effect of CRISPR/Cas9

圖6 GbGGB-sgRNA2靶位點(diǎn)編輯效應(yīng)(堿基置換型)測(cè)序檢測(cè)結(jié)果Fig. 6 Sequencing of GbGGB-sgRNA2 target site that were edited (type of base substitution)

圖7 GbGGB-sgRNA2靶位點(diǎn)編輯效應(yīng)(堿基置換型)測(cè)序峰圖Fig. 7 Sequencing peaks figure of GbGGB-sgRNA2 target site that were edited (type of base substitution)

3 討論

3.1 原生質(zhì)體制備與轉(zhuǎn)化

CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)在植物中的研究已逐漸趨于成熟, 目前棉花的 CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)剛剛在陸地棉中成功建立[25-26], 但在海島棉中還未見(jiàn)報(bào)道。與陸地棉相比, 海島棉存在體細(xì)胞胚胎發(fā)生困難、轉(zhuǎn)化周期長(zhǎng)、效率低等問(wèn)題, 因此采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法來(lái)快速驗(yàn)證構(gòu)建的海島棉CRISPR/Cas9基因組編輯載體的有效性就成為唯一的方法。與模式植物不同, 棉花原生質(zhì)體制備與轉(zhuǎn)化受材料來(lái)源、酶解體系、反應(yīng)條件、轉(zhuǎn)化方式等因素顯著影響。本研究在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上, 嘗試海島棉多種組織, 但均未獲得符合要求的原生質(zhì)體,而利用再分化形成的胚性愈傷組織最終獲得了滿足試驗(yàn)要求的原生質(zhì)體(圖3)。在轉(zhuǎn)化過(guò)程中的孵育階段, 采用緩慢振蕩孵育方式, 可以避免原生質(zhì)體在PEG的作用下出現(xiàn)成簇聚集現(xiàn)象而影響轉(zhuǎn)化成功率。

3.2 CRISPR/Cas9基因組編輯效應(yīng)檢測(cè)

CRISPR/Cas9基因組編輯突變位點(diǎn)檢測(cè)一般采用酶切和PCR相結(jié)合的方法[25]。以先PCR后酶切方式進(jìn)行編輯效率檢測(cè)時(shí), 雖然可以保證酶切反應(yīng)底物的濃度, 提高檢出率, 但由于 PCR過(guò)程中存在的偏擴(kuò)增現(xiàn)象, 可能造成突變產(chǎn)物擴(kuò)增過(guò)程中被遺漏。另外由于基因組發(fā)生編輯后序列在修復(fù)過(guò)程中堿基的突變可能造成DNA鏈不穩(wěn)定, 導(dǎo)致聚合酶延伸時(shí)滑落, 造成突變序列難以指數(shù)性擴(kuò)增, 最終造成產(chǎn)物累積量過(guò)少而無(wú)法準(zhǔn)確檢測(cè)編輯的效應(yīng)。因此采用先酶切后PCR方式編輯效應(yīng)檢測(cè)是一種有效可靠的方法。U6啟動(dòng)子作為CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)的重要元件之一, 目前已經(jīng)在棉花中克隆得到, 并且驗(yàn)證具有轉(zhuǎn)錄活性[30]。然而基于棉花U6啟動(dòng)子的CRISPR/Cas9基因編輯載體系統(tǒng)能否在棉花中實(shí)現(xiàn)基因定點(diǎn)編輯的效應(yīng), 目前并不清楚。我們采用先酶切后 PCR的方式檢測(cè)了基于海島棉GbU6-4和GbU6-5啟動(dòng)子的CRISPR/Cas9基因編輯載體系統(tǒng)的編輯效應(yīng), 成功地在海島棉原生質(zhì)體中檢測(cè)到靶序列的突變現(xiàn)象(圖5)。通過(guò)克隆測(cè)序分析顯示, 突變的類(lèi)型主要以堿基替換為主, 少數(shù)為堿基缺失, 這與陸地棉中的結(jié)果[25]相似, 試驗(yàn)中并未檢測(cè)到堿基的插入。為了驗(yàn)證單堿基的改變是否是PCR擴(kuò)增過(guò)程中隨機(jī)產(chǎn)生的突變, 我們對(duì)擴(kuò)增克隆的整個(gè)PCR片段序列進(jìn)行了分析, 結(jié)果顯示靶位點(diǎn)堿基的突變頻率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其兩側(cè)其他位點(diǎn)的突變頻率。

通過(guò)克隆測(cè)序, 我們沒(méi)有檢測(cè)到對(duì)照樣品中存在突變序列, 然而對(duì)照樣品基因組DNA酶切后PCR產(chǎn)物依然還有微量的條帶(圖5), 原因可能是棉花屬多酚高糖植物, 基因組在提取過(guò)程中殘留的多糖和酚類(lèi)物質(zhì)在酶切反應(yīng)時(shí)都可能抑制限制性?xún)?nèi)切酶活性, 導(dǎo)致靶序列模板酶切不徹底, 再經(jīng)PCR擴(kuò)增時(shí),就產(chǎn)生了微量的條帶。

在驗(yàn)證CRISPR/Cas9基因編輯載體系統(tǒng)的編輯效應(yīng)時(shí), 我們使用了兩種不同密碼子優(yōu)化的Cas9基因, 結(jié)果顯示這2種Cas9基因都能有效實(shí)現(xiàn)對(duì)靶位點(diǎn)雙鏈DNA的切割和編輯, 這也暗示著棉花蛋白質(zhì)合成體系中可能沒(méi)有明顯的密碼子使用偏好性。

圖9 GbGGB-sgRNA2靶位點(diǎn)區(qū)域(guide RNA)及其兩側(cè)位點(diǎn)的突變效率分析Fig. 9 Mutation efficiency of GbGGB-sgRNA2 target site (guide RNA) and its two flanking region

4 結(jié)論

采用高濃度CRISPR/Cas9核心DNA片段瞬時(shí)轉(zhuǎn)化棉花原生質(zhì)體, 成功檢測(cè)到海島棉內(nèi)源基因的突變。證明了基于棉花內(nèi)源 U6啟動(dòng)子的 CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)體系在海島棉中的有效性, 表明該體系可以用于定向創(chuàng)制棉花的突變體, 為棉花功能基因組學(xué)研究提供了重要的技術(shù)基礎(chǔ)。

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