張 莉 薦紅舉 楊 博 張翱翔 張 超 楊 鴻 張立源劉列釗 徐新福 盧 坤 李加納

西南大學農(nóng)學與生物科技學院, 重慶 400715

蔗糖是高等植物光合作用的主要產(chǎn)物, 也是碳從源器官到庫器官的移動形式, 蔗糖在作物生長和產(chǎn)量形成過程中起著重要作用[1]。蔗糖磷酸合酶(sucrose phosphate synthase, SPS)催化 UDPG (尿苷二磷酸葡糖)和F6P (果糖-6-磷酸)反應生成S6P (蔗糖-6-磷酸), S6P再進一步被SPP (磷酸蔗糖磷酸化酶)催化水解產(chǎn)生蔗糖[2], 而SPS和SPP以復合體形式存在于植物中, 因此生成蔗糖這一過程不可逆[3]。一般認為, SPS-Spase (蔗糖磷酸合酶-蔗糖磷酸化酶)系統(tǒng)是蔗糖合成主要途徑, 在此途徑中 SPS是關鍵限速酶[4]。SPS作為糖基轉移酶超家族成員, 是由2個或4個亞基構成的二聚體或者四聚體[5]。目前, 在植物中共發(fā)現(xiàn)了4個SPS基因亞家族, 雙子葉植物有A、B、C共3個基因亞家族[6-7], D家族為單子葉植物獨有[8-9], 每個基因家族中至少有1個基因。在擬南芥中有 4個 SPS基因[10], 分別是 SPSA1(AT5G20280)、SPSA2 (AT5G11110)、SPSB(AT1G04920)和 SPSC (AT4G10120)。SPSA1在擬南芥光合作用合成蔗糖中起主要作用[10], SPSA2參與擬南芥花粉發(fā)育后期蔗糖代謝[11], SPSA1和 SPSA2在擬南芥成熟蜜腺中高度表達, 是花蜜分泌必不可少的基因[12]; SPSB在煙草花藥和子房中大量表達,為花粉粒萌發(fā)提供碳源[13]; SPSC是參與擬南芥和煙草夜間蔗糖合成的主要基因, 同時能夠維持淀粉正常運輸[14]。

SPS作為蔗糖合成催化劑, 其活力大小與蔗糖積累量成正比[3,15], SPS在蔗糖代謝中主要影響源強和庫強, 調(diào)節(jié)光合產(chǎn)物在蔗糖和淀粉的分配, 參與細胞分化與纖維細胞壁合成[16]。Park等[14]在煙草中轉入 AtSPSA1基因, 導致轉基因煙草庫器官蔗糖濃度提高, 而源器官蔗糖濃度不變, 所有轉基因植株高度增加、莖稈增粗、纖維增長、總干重增加。Baxter等[17]在煙草中轉入玉米 SPS基因, 導致轉基因煙草開花時間提前, 生物量有增加趨勢, 花的數(shù)量、蔗糖積累量和碳同化量都大幅提高。Ishimaru等[18]在土豆中轉入玉米SPS基因, 導致轉基因土豆中SPS活性增加, 光合產(chǎn)物從源到庫的轉移增加, 光合作用時間延長, 產(chǎn)量提高。

在許多作物中, SPS活性受晝夜循環(huán)調(diào)控[19], 受低溫[20]、滲透脅迫[21]和高CO2[22]的誘導。作為控制CO2同化形成蔗糖的一個關鍵點, SPS蛋白合成不僅受 SPS基因的轉錄調(diào)控[23-24], 同時還受包括氧化磷酸化蛋白翻譯后的修飾作用、G6P (葡萄糖-6-磷酸)的活化作用和無機正磷酸鹽的抑制作用在內(nèi)的多個機能多個層次結構控制[3,25]。

油菜是我國播種面積最大, 地區(qū)分布最廣的油料作物。油菜中蔗糖主要在光合器官細胞質(zhì)基質(zhì)中合成, 通過韌皮組織向其他器官和組織運輸, 為油菜生長發(fā)育提供碳源和能量。SPS作為油菜蔗糖合成過程關鍵調(diào)控酶, 主要促進蔗糖合成。SPS的活性體現(xiàn)了籽粒對同化物的需求程度, 高活性 SPS有利于油菜籽油分累積[26]。本研究利用生物信息學分析方法, 基于已經(jīng)公布的油菜基因組全序列信息, 對油菜 SPS基因全部成員進行鑒定, 從基因組水平上分析了油菜SPS基因數(shù)目、基因進化和結構、在染色體上的分布、啟動子區(qū)域順式作用元件以及在不同組織器官中的表達情況, 為進一步研究該家族成員的生物學功能奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2015年9月至2016年5月在重慶市油菜工程技術研究中心歇馬實驗基地種植各甘藍型油菜品種。田間試驗按 3個重復隨機區(qū)組設計, 每個小區(qū)種植2行, 行距40 cm, 株距20 cm。分別于盛花期取甘藍型油菜“中雙 11”的根、莖、葉、蕾和花, 花后30 d種子和角果皮, 在液氮中速凍并存于–80℃,用于分析SPS基因在甘藍型油菜不同器官的表達水平。為分析SPS基因在高、低生物產(chǎn)量甘藍型油菜組織器官中表達差異情況, 從33個國內(nèi)甘藍型油菜自交系(見附表 1)中篩選出 3份高生物產(chǎn)量(生物產(chǎn)量分別為155、171和172 g 株-1)和2份低生物產(chǎn)量材料(生物產(chǎn)量分別為105 g 株-1和111 g 株-1)。這33份材料組成的群體生物產(chǎn)量性狀值符合正態(tài)分布(見附圖1)。分別于盛花期取其莖, 葉, 花后30 d種子和角果皮, 在液氮中速凍并存于–80℃待用。

1.2 甘藍型油菜、白菜和甘藍中SPS基因的鑒定

擬南芥SPS基因序列來源于TAIR (http://www.arabidopsis.org/), 利用擬南芥 SPS蛋白序列分別在甘藍型油菜基因組數(shù)據(jù)庫(http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/)和BRAD (http://brassicadb.org/brad/index.php)進行 BLASTP分析, 獲取甘藍型油菜、白菜及甘藍的SPS蛋白序列。

1.3 甘藍型油菜SPS基因的系統(tǒng)進化分析

利用ClustalW默認設置對SPS氨基酸序列進行多重序列比對, 并在 MEGA 6軟件中使用鄰接法(neighbour-joining, NJ)構建進化樹[27], 校驗參數(shù)bootstrap為重復1000次。

1.4 蛋白特性和序列分析

利用ExPASy Proteomics Sever (http://expasy.org/)預測甘藍型油菜SPS蛋白氨基酸序列分子量和等電點[28]。利用GSDS2.0 (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php)繪出甘藍型油菜 SPS基因結構[29]。通過MEME 網(wǎng)站(http://meme-suite.org/tools/meme)分析甘藍型油菜SPS蛋白的保守元件[30], 設置最大元件數(shù)量為 25個, 元件的最佳寬度 6～50。利用InterProScan網(wǎng)站(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)對元件進行注釋[31]。

1.5 甘藍型油菜 SPS基因啟動子順式作用元件分析

從甘藍型油菜基因組網(wǎng)站(http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/)獲得SPS基因啟動子序列(轉錄起始位點上游 1.5 kb), 并利用 PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)預測甘藍型油菜SPS基因啟動子順式作用元件[32-33]。

1.6 RNA提取和實時熒光定量PCR

使用 RNA提取試劑盒(Invitrogen)提取各組織樣品總RNA。首先利用DNase I去除受污染基因組DNA, 根據(jù)試劑盒說明, 利用反轉錄酶(TaKaRa)將1 μg RNA反轉錄形成cDNA。根據(jù)Wei等[34]描述的實時熒光定量PCR方法確定SPS基因在油菜不同組織的表達水平, 各樣品3個重復。引物序列見附表2。

2 結果與分析

2.1 甘藍型油菜SPS基因鑒定和系統(tǒng)發(fā)生分析

通過BLASTP分析, 獲得11個甘藍型油菜、6個白菜和5個甘藍的SPS基因家族成員。這11個油菜SPS蛋白的氨基酸長度從473 (BnSPSC-1)到1065(BnSPSB-2), 平均 953; 相對分子質(zhì)量從 53.8 kD(BnSPSC-1)到119.6 kD (BnSPSB-2); 等電點從5.52(BnSPSA1-3)到8.06 (BnSPSC-1), 除1個成員外, 其余SPS蛋白成員的等電點均在7以下, 即呈酸性形式存在(表1)。

表1 甘藍型油菜SPS預測編碼蛋白信息Table 1 Information of predicted BnSPS proteins

對擬南芥、甘藍型油菜、白菜和甘藍的SPS氨基酸序列系統(tǒng)進化樹分析表明, SPS基因群被分成A、B和C 3個亞家族(圖1), 其中, A家族包括7個甘藍型油菜、2個擬南芥、4個白菜和3個甘藍SPS基因, B家族包括2個甘藍型油菜、1個擬南芥、1個白菜和1個甘藍SPS基因, C家族則由2個甘藍型油菜、1個擬南芥、1個白菜和1個甘藍SPS基因構成。

2.2 甘藍型油菜中SPS基因的染色體位置, 基因結構和保守結構域

6個白菜SPS基因分布在4條染色體上(圖2-a),5個甘藍SPS基因分布在4條染色體上(圖2-b), 11個甘藍型油菜SPS基因分布在9條染色體上(圖2-c),每條染色體上有 1～2個基因。根據(jù)染色體定位分布信息和序列比對分析, 發(fā)現(xiàn)該家族成員沒有串聯(lián)重復, BnSPSA1-1/A1-2/A1-3、BnSPSA2-1/A2-2/A2-4、BnSPSA2-3/A2-4、BnSPSB-1/B-2和 BnSPSC-1/C-2參與基因的片段復制。

圖1 擬南芥、甘藍、白菜和甘藍型油菜中SPS家族進化樹(鄰接法)Fig. 1 Phylogenetic tree of SPS proteins in A. thaliana, B. oleracea, B. rape, and B. napus (neighbor-joining method)

圖2 白菜(a)、甘藍(b)和甘藍型油菜(c)的SPS基因染色體分布Fig. 2 Chromosomal mapping of BrSPS (a), BoSPS (b), and BnSPS (c)

在同一類型基因中, 可以通過分析它們內(nèi)含子長度或者外顯子數(shù)目來判斷它們之間的緊密程度。例如, A家族基因有13～15個外顯子, 有3個基因含有 14個外顯子, 3個基因含有 15個外顯子, 只有SPSA2-1含有13個外顯子; B家族的基因都含有11個外顯子; C家族中 SPSC-1只有 5個外顯子, 而SPSC-2含有13個外顯子, 而且SPSC-2的長度明顯大于 SPSC-1 (圖 3-A)。

利用MEME軟件, 在甘藍型油菜SPS蛋白中預測出 25個保守元件。元件 1～4、8、11、12、16和18在所有SPS蛋白中都存在; 除SPSC-1之外, 其他10個 SPS蛋白均含有元件 5～7、9、10、13、15、17、19、20和23。元件24和25只在A家族中存在, 元件14和21同時在A、B家族中存在, 元件22在除SPSA2-4和 SPSC-1外的其他 SPS蛋白中存在(圖3-B)。根據(jù)InterProScan注釋, 元件1～8都是糖基轉移酶蛋白, 元件2～4、6和8是SPS相關蛋白。SPSC-1在基因結構和保守元件中具有較大特異性。

圖3 油菜SPS基因家族的結構(A)和保守元件(B)Fig. 3 Structures (A) and identified motifs (B) of BnSPS gene family

2.3 油菜SPS基因啟動子的順式調(diào)控元件

在油菜 SPS上除了有 TATA-box和 CAAT-box等一些基本的啟動子保守區(qū)以外, 還有許多與逆境和激素反應相關的重要順式作用元件(表 2), 如 23個抗氧化反應元件(ARE), 18個CGTCA-motif 和18個TGACG-motif茉莉酸甲酯響應元件, 17個赤霉素響應元件(GARE-motif), 17個脫落酸響應元件(ABRE), 11個干旱響應元件(MBS), 以及11個水楊酸響應元件(TCA-element)。

2.4 SPS基因在甘藍型油菜不同組織器官中的表達分析

BnSPSA1-1、BnSPSA1-2和 BnSPSA1-3均在花中表達量最高, BnSPSA1-2和BnSPSA1-3在蕾和角果皮中也有較高表達; BnSPSA2-1、BnSPSA2-2、BnSPSA2-3和BnSPSA2-4在各部位均有不同程度表達, BnSPSA2-1和 BnSPSA2-2在花中表達量最高, BnSPSA2-3和BnSPSA2-4在蕾中表達量最高; BnSPSB-1和BnSPSB-2只在葉、蕾和花中表達, 且蕾中表達量最高; BnSPSC-1和 BnSPSC-2在葉中表達量最高, 在蕾和花中也有不同程度的表達, 在其他組織器官中基本不表達(圖4)。

2.5 SPS基因在高、低生物產(chǎn)量油菜不同組織器官中的表達分析

BnSPSA-1、BnSPSA-2和BnSPSA-3在葉片中的表達量基本上是高生物產(chǎn)量油菜高于低生物產(chǎn)量油菜; BnSPSB-1和BnSPSB-2只在葉片中表達, 且高生物產(chǎn)量油菜中的表達量極顯著低于低生物產(chǎn)量油菜;BnSPSC-1和BnSPSC-2主要在葉片中表達, 且低生物產(chǎn)量油菜高于高生物產(chǎn)量油菜(圖5)。

表2 甘藍型油菜SPS基因啟動子中順式作用元件的種類與數(shù)量Table 2 Types and quantities of cis-acting elements in BnSPS promoters

圖4 BnSPS基因在中雙11中的組織特異表達分析Fig. 4 Tissue-specific expression patterns of BnSPS genes in Zhongshuang 11

圖5 高、低生物產(chǎn)量甘藍型油菜SPS基因在不同器官中的差異表達Fig. 5 Differential expression of BnSPS genes in different organs between high-biomass and low-biomass rapeseed varieties

3 討論

隨著大規(guī)?；蚪M測序的發(fā)展, 比較基因組學在基因組分析和注釋方面的功能逐漸展露, 利用比較基因組學進行基因家族分析已經(jīng)成為現(xiàn)今基因功能研究得熱點。目前已經(jīng)在多種糧食作物和水果中進行了類似研究, 包括大豆 LEA基因家族[35], 番茄LBD基因家族[36]以及梨CBL基因家族[37]等, 為各基因家族功能研究奠定了理論基礎。甘藍型油菜作為重要的油料作物, 基因組測序完成后, 對 SUC和SWEET等[38], SnRK2等[39]及WRKY等[40]家族都進行了廣泛的生物信息學分析。SPS在作物生長和產(chǎn)量形成中起著重要的作用, 但是在油菜中有關 SPS基因的研究未見報道。本文分析了甘藍型油菜SPS基因的系統(tǒng)發(fā)育關系, 內(nèi)含子和外顯子結構, 染色體定位, 保守元件, 不同組織器官中的表達模式和在高、低生物產(chǎn)量油菜中的差異表達。

3.1 甘藍型油菜SPS基因的進化

多倍體化是真核生物進化的主要推動者[41]。蕓薹屬植物由擬南芥進化之后, 經(jīng)歷全基因組三倍化事件, 基因數(shù)目增多[42]。白菜和甘藍作為二倍體蕓薹屬植物, 理論上擬南芥的單個基因在其染色體上應該有3個拷貝[43-44]。甘藍型油菜(Brassica napus L.,2n = 4x = 38, AACC)是由白菜(B. rapa, 2n = 2x = 20,AA)和甘藍(B. oleracea, 2n = 2x = 18, CC)自然雜交形成的異源四倍體植物, 因此擬南芥的單個基因在其染色體上應該有 6個拷貝[45]。然而, 由于基因組的坍塌和丟失, 擬南芥的單個基因在白菜[43]和甘藍型油菜[45]中分別只有1.5～2.0和2.0～6.0個拷貝。本研究共鑒定出11個甘藍型油菜SPS基因, 分布在9條染色體上, 其中BnSPSA2-2定位在C03染色體上,結合白菜和甘藍中 SPS基因在染色體上的分布, 發(fā)現(xiàn)并沒有BoSPS基因定位在C03染色體上, 猜測這可能是甘藍型油菜在進化過程中染色體片段交換的結果。本研究還發(fā)現(xiàn)各BnSPS基因之間沒有串聯(lián)重復, 有 4組片段重復, 說明片段復制事件是 BnSPS在基因組內(nèi)擴增的主要方式。

油菜各 SPS分子特征有較大差異, 其分子量和等電點是根據(jù)油菜SPS基因家族的分類而變化的。外顯子結構差異對基因家族的進化起重要作用[46-47],本研究對SPS基因家族結構分析也解釋了基因結構的多樣性。A家族中外顯子數(shù)目略多于B、C家族, 同時 C家族中兩個基因的外顯子數(shù)目差異也較大, 這暗示各基因功能的差異。例如, 11個 SPS基因中,SPSC-1外顯子數(shù)目明顯低于其他基因, 且由該基因合成的蛋白質(zhì)其氨基酸平均長度最短, 等電點相對最高, 這可能是在進化過程中基因片段丟失、N端縮短等原因造成的[48]。外顯子結構和保守元件分析,也揭示了在不同物種中的SPS基因具有相同的起源和進化模式, 從整體上看, 具有相同保守元件組成的基因都聚集在同一家族中, 這暗示了同一家族內(nèi)部各基因的功能有相似性。

3.2 甘藍型油菜SPS基因的差異表達

11個SPS基因在甘藍型油菜不同組織器官中有差異表達, BnSPSA1-2、BnSPSA1-3、BnSPSC-1和BnSPSC-2在葉片中表達量較高, 這與擬南芥葉片中主要是SPSA1和SPSC表達的結果[49]一致。水稻中OsSPS1 (B家族)是花粉發(fā)育必不可少的基因[50], 煙草中 SPSB基因在花藥和子房中大量表達[51]。與此一致, 本研究中BnSPSB-1和BnSPSB-2均在油菜蕾中表達量最高。由此推測, BnSPSB在油菜花粉發(fā)育中可能起重要作用。據(jù)報道, SPSB基因在種子中的表達量較高[2,10,49]。然而, 本研究中 BnSPSB-1和BnSPSB-2在種子中基本不表達, 這可能是由于甘藍型油菜在進化過程中SPS基因功能發(fā)生分化。

以葉、莖和角果皮等光合器官作為研究材料,BnSPSA1和BnSPSC作為在葉片中主要表達的基因,其在高生物產(chǎn)量油菜葉片中的表達量高于低生物產(chǎn)量油菜, 這與前人報道一致。Park等[14]在煙草中轉入AtSPSA1基因, Baxter等[17]在煙草中轉入ZmSPS基因, Ishimaru等[18]在馬鈴薯中轉入ZmSPS基因, 均發(fā)現(xiàn)轉基因作物的產(chǎn)量或干重提高。由此推測,BnSPSA1和BnSPSC與甘藍型油菜生物產(chǎn)量的積累相關。BnSPSB在低生物產(chǎn)量油菜葉片中的表達量高于高生物產(chǎn)量油菜, 可能是由于低生物產(chǎn)量油菜的蔗糖合成不足, BnSPSB作為蔗糖合成候補基因發(fā)揮功能, 而高生物產(chǎn)量油菜蔗糖合成充足抑制了 BnSPSB在葉片中的表達。Lu等[52]通過全基因組關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)SPSA2-3是與甘藍型油菜生物產(chǎn)量相關的候選基因,而在本研究中SPSA2-3在高、低生物產(chǎn)量油菜光合器官中的表達沒有明顯規(guī)律, 需要進一步研究論證。

4 結論

通過對油菜 SPS基因家族全基因組鑒定, 共獲得11個基因, 分屬3個不同家族, 分布在9條染色體上, 具有較高的保守性, 大部分基因都含有與逆境和激素相關的順式作用元件, 基因的表達具有明顯的組織器官特異性, 與油菜生物產(chǎn)量密切相關。

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