朱 瑩 褚姍姍 張培培 程 浩 喻德躍 王 嬌,*南京農業(yè)大學大豆研究所 / 作物遺傳育種與種質創(chuàng)新國家重點實驗室 / 江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心 / 國家大豆改良中心,江蘇南京0095; 河南農業(yè)大學農學院 / 河南省糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心, 河南鄭州 45000

異黃酮是苯丙烷類次生代謝物, 主要含在豆科植物中, 尤其是大豆中[1]。它具有雌激素、抗癌、抗氧化、治療心血管病和預防骨質疏松等多種生理活性[2-3], 且在植物與微生物的相互作用中發(fā)揮重要作用, 如在大豆中, 異黃酮一方面可以作為信號物,參與大豆和根瘤菌的共生; 另一方面, 可以抵制病原菌的侵害, 保護植株正常生長[4]。大豆異黃酮除本身具有抗病原菌活性外[5], 還參與大豆抗毒素的合成。大豆抗毒素是大豆特異的植物抗毒素, 具有廣譜抗性, 可以保護大豆免受病原菌、食草動物等的侵害[6]。

大豆異黃酮通過植物共有的苯丙氨酸代謝途徑和豆科特異的異黃酮分支途徑被合成, 涉及苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸 4-羥化酶(C4H)、4-香豆酸:CoA連接酶(4CL)、查爾酮合成酶(CHS)、查爾酮還原酶(CHR)、異黃酮合酶(IFS)等多種酶。此外, 苯丙氨酸代謝途徑還可以通過其他分支途徑合成木質素、花青素、黃酮等物質[1]。

隨著對大豆異黃酮合成分子機制理解的深入,代謝工程成為大豆異黃酮品質改良的重要手段。調節(jié)與異黃酮合成相關基因的表達是研究大豆異黃酮代謝工程的主要策略之一。但是, 對大豆異黃酮遺傳控制的研究還存在很多問題。首先, 大豆異黃酮的合成受多基因控制, 這些基因間存在相互作用,形成一個代謝復合體, 調控大豆異黃酮含量[7-8]。另外, 苯丙氨酸代謝途徑還涉及許多其他物質的合成,與異黃酮代謝途徑存在微妙的互作關系。過表達大豆異黃酮代謝途徑中的單個或多個基因, 如 PAL、CHS和 IFS, 通常對提高大豆異黃酮的含量影響不顯著[9-10]。因此若要將代謝前體和中間產(chǎn)物有效導入異黃酮分支途徑, 調控途徑基因可能不是高效的方法。

除了途徑基因, 轉錄因子也受到關注。轉錄因子可以作為分子開關與結構基因啟動子特異結合,通過調控結構基因的表達, 可高效誘導或抑制目標代謝產(chǎn)物的積累[11-12]。因此, 可以尋找與異黃酮合成關鍵酶相互作用的轉錄因子, 通過轉錄因子調節(jié)異黃酮的合成。近年來鑒定了許多與黃酮、異黃酮代謝有關的不同類型的轉錄因子, 包括MYB、bHLH(堿性螺旋-環(huán)-螺旋)、bZIP (堿性亮氨酸拉鏈)等[13]。其中, MYB轉錄因子是高等植物最大的轉錄因子家族之一[14]。在擬南芥中報道了近 200個MYB轉錄因子[15], 其中絕大多數(shù)是 R2R3類型[16-17]; 大豆中大約有700個MYB轉錄因子, 其中244個是R2R3類型的 MYB轉錄因子[18]。目前已鑒定 3個R2R3-MYB轉錄因子與大豆異黃酮合成相關, 如GmMYB29能夠激活CHS8和IFS2的表達, 過表達和干擾該基因能夠分別提高和抑制異黃酮的合成[19]。GmMYB39能夠抑制CHS的表達活性, 過表達該轉錄因子可以降低PAL、C4H、CHS、4CL和CHR的轉錄水平, 進而抑制異黃酮的生物合成[20]。GmMYB100在異黃酮的積累中顯示了負調控的功能, 過表達該基因能夠降低大豆轉基因株系的異黃酮含量[21]。當然很可能還存在更多的R2R3-MYB轉錄因子參與異黃酮的調控, 而如何有效地搜尋并鑒定影響異黃酮積累的調控因子成為科學家們努力攻克的難點和方向。

谷胱甘肽(glutathione, GSH)可以影響生物脅迫相關基因的表達, 并誘導異黃酮的產(chǎn)生[22-23]。前人系統(tǒng)分析了百脈根中 39個主要的轉錄因子家族在GSH誘導后的表達情況, 發(fā)現(xiàn)R2R3-MYB轉錄因子亞家族 20在 GSH誘導下表達量顯著提高, 如LjMYB62在GSH脅迫處理后3 h上調表達86倍, 處理6 h后上調表達106倍。推測此亞家族可能存在與抗病抗逆和異黃酮調控相關的轉錄因子[23-24]。本研究利用生物信息學方法, 分析預測了一個與大豆異黃酮合成相關的轉錄因子GmMYB184, 并克隆該轉錄因子進行調控機制研究。首先, 分析該轉錄因子組織表達和誘導表達模式, 以探索它與大豆異黃酮合成關鍵基因之間的關系。其次, 采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析其對異黃酮合成途徑關鍵基因轉錄激活活性。最后通過發(fā)根農桿菌介導的轉化系統(tǒng), 找到該轉錄因子在異黃酮合成調控中的直接作用證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

用于基因克隆的大豆品種為已完成基因組測序的Williams 82。大腸桿菌菌株DH5α購自天根生化科技有限公司。組織表達和誘導表達分析使用的大豆材料是監(jiān)利牛毛黃品種。遺傳轉化分析使用的是大豆 Jack品種。原生質體的提取使用的是擬南芥Columbia-0生態(tài)型的葉片。以上材料均保存于南京農業(yè)大學國家大豆改良中心。

菌株載體包括發(fā)根農桿菌(Agrobacterium rhizogenes) K599、植物原生質體表達載體pAN580、入門載體pDONR221、表達載體pBA002、干擾載體pB7GWIWG2(II), 均由本實驗室保存提供。

KOD plus neo高保真聚合酶購自TOYOBO。限制性內切酶購自 New England Biolabs (NEB)。pMD19-Tsimple載體、T4連接酶購自TaKaRa公司。DNA標準分子量購自北京全式金生物技術有限公司。還原型谷胱甘肽(GSH)、MES和 Silwet購自Sigma公司。氨芐青霉素Amp、卡那霉素Kana、利福平Rif等抗生素試劑購自Roche公司。MS、White培養(yǎng)基購自南京壽德生物科技有限公司。

質粒小提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購自Axygen公司。RNA提取試劑盒購自北京天根公司。cDNA合成試劑盒購自TaKaRa公司。無內毒素質粒大提試劑盒購自北京天根公司。雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京普洛麥格(Promega)生物技術有限公司。

PCR引物合成由英濰捷基(上海)貿易有限公司完成。DNA測序由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

1.2 大豆GmMYB184基因的克隆

PCR擴增模板為大豆Williams 82品種的cDNA序列。分別使用RNA試劑盒和cDNA合成試劑盒提取 RNA序列和合成 cDNA序列。為了獲取GmMYB184的全長 cDNA 序列, 設計大豆GmMYB184的特異 PCR擴增引物, 上游引物GmMYB184-F: 5′-GTTTCAGTGAGTGAGAATAGC-3′; 下游引物 GmMYB184-R: 5′-AGAGTTTTGGAC TTTTGGT-3′。PCR 擴增體系(50 μL)含: cDNA 模板4 μL, dNTP 10 μL, 2×buffer 25 μL, KOD 酶 1 μL, 上游引物 1.5 μL, 下游引物 1.5 μL, ddH2O 7 μL。PCR條件為: 94°C 預變性 2 min; 98°C 變性 10 s, 51°C 退火30 s, 68°C延伸40 s, 33個循環(huán); 68°C延伸7 min。

PCR反應結束后, 將反應產(chǎn)物與Loading buffer混合, 用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶大小。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收后, 取適量進行加尾反應,隨后按照 pGM-T載體連接試劑盒說明, pMD19-Tsimple載體與目的基因連接反應, 連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細胞。挑取大而圓的單菌落進行菌液PCR。反應結束后將菌液PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。挑選電泳結果中與目的片段大小一致的產(chǎn)物結果送測序, 測序結果正確的重新接菌提取質粒。將質粒保存用于后續(xù)實驗及載體構建的模板(以下稱該質粒為8g-T)。

1.3 目的基因序列分析

使用 CLUSTALW 程序比對蛋白序列[25], 默認參數(shù)設置。使用 MEGA[26]繪制鄰接樹(neighborjoining tree), 每個節(jié)點的 bootstrap值重復次數(shù)為1000次。使用NCBI分析目標基因序列。

1.4 實時定量熒光PCR分析

1.4.1 組織表達樣品 分別取播種于南京農業(yè)大學江浦試驗站的大豆品種監(jiān)利牛毛黃的根、莖、葉、花、開花10 d后的莢和種子, 開花20、25、30、40、50 d后的種子和成熟種子, 經(jīng)液氮速凍并于–80°C保存。提取樣品的RNA, 反轉錄成cDNA。

1.4.2 谷胱甘肽誘導表達樣品 在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)大豆監(jiān)利牛毛黃材料4～7周。設置光照培養(yǎng)箱16 h光照, 8 h黑暗; 溫度為光照28°C, 黑暗23°C。培養(yǎng)過程中需避免其他生物脅迫。摘取健康的完全展開葉片,用10 mmol L–1GSH溶液(含0.005% Silwet植物表面活性劑)黑暗處理8 h。處理條件為室溫下(23～25°C),80 r min–1振蕩。對照僅用0.005% Silwet植物表面活性劑處理, 其他條件均相同。分別在0、3、6、7 h時取樣[22-23]。液氮速凍, 保存于–80°C冰箱備用。

1.4.3 實時熒光定量PCR 以大豆組成型表達的tubulin基因為內參, 設計基因特異引物, 引物序列如表1, 采用ABI 7500 system v1.4.0數(shù)據(jù)分析實驗獲得的數(shù)據(jù)。每個樣品重復測定3次。

目標基因表達水平進行相對定量采用2–ΔΔCT法[27]。設誘導表達0 h Δ值為1, 計算出3、6、7 h相較于0 h的表達倍數(shù)。

1.5 亞細胞定位

首先構建亞細胞定位所需的表達載體。以8g-T載體為模板, 選擇Xba I和Xma I酶切位點設計引物,PCR擴增得到 GmMYB184的完整開放閱讀框(open reading frame, ORF)序列。引物MYB184SUB正向序列為 5′-TGCTCTAGAATGTCTACTTCAAAGAGC-3′,反向序列為 5′-TCCCCCCGGGTTTTTGTAACTTGC TAAA-3′。獲得帶酶切位點的GmMYB184完整ORF序列的PCR產(chǎn)物, 對該產(chǎn)物進行酶切、回收酶切產(chǎn)物, 用T4連接酶連入pAN580載體。由此方法獲得表達 MYB184::GFP融合蛋白的重組質粒 pAN580-MYB184-GFP。重組質粒 pAN580-MYB184-GFP測序正確后, 與對照 pAN580-GFP質粒通過聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)法分別轉入擬南芥原生質體。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.6 構建雙熒光素酶報告系統(tǒng)

GmMYB184的表達載體是由亞細胞定位中所用的 pAN580表達載體改造的。首先用限制性內切酶BamH I和Not I對亞細胞定位中使用的pAN580表達載體進行雙酶切, 切除 GFP片段。用 Klenow酶平末端處理后用T4連接酶連接, 完成中間載體的構建。隨后將GmMYB184序列連入中間載體的多克隆位點區(qū)段, 構成 CaMV35S::MYB184重組質粒, 經(jīng)測序正確即完成效應載體Effector的構建。

雙熒光素酶報告系統(tǒng)報告載體Reporter的構建,首先設計帶 Xba I和 Xma I酶切位點的引物, 以pGL3載體為模板通過 PCR擴增帶有酶切位點的LUC基因的完整ORF。對PCR產(chǎn)物進行酶切、回收后用T4連接酶將LUC序列連入中間載體的多克隆位點區(qū)段, 構成CaMV35S::LUC重組質粒。構建完成的CaMV35S::LUC重組質粒中的CaMV35S片段需用Sac I和Nhe I限制性內切酶雙酶切去除, 去除后的質粒片段用于構建最終報告載體。設計特異引物從大豆 Williams 82 DNA中擴增帶酶切位點的IFS2和CHS8啟動子片段, 引物序列如表1。對擴增而得的IFS2和CHS8啟動子片段PCR產(chǎn)物酶切、回收, 分別連入去除 CaMV35S片段后的質粒片段從而構成IFS2pro::LUC和CHS8pro::LUC載體, 經(jīng)測序正確即完成報告載體Reporter的構建。

使用海腎熒光素酶載體為內參載體。雙熒光素酶報告系統(tǒng)的報告載體、效應載體和內參載體示意圖如圖1。

將報告載體、內參載體和效應載體, 或報告載體和內參載體(作為對照)分別共轉染擬南芥原生質體, 每個轉染實驗重復 6次。參照熒光素酶雙報告基因檢測試劑盒使用手冊(Promega)的熒光素酶報告基因檢測步驟。

1.7 農桿菌介導的大豆毛狀根轉化系統(tǒng)的構建及遺傳轉化

RNA干涉載體是應用Gateway技術構建的。構建過程只需 BP和 LR兩個反應。選擇GmMYB184基因編碼區(qū)域321 bp的特異片段作為干涉區(qū)段。設計帶有 attB1和 attB2接頭序列的正向引物MYB184Ri-F和反向引物MYB184Ri-R進行PCR擴增, 在 5′端接入 attB1位點, 3′端接入 attB2位點。MYB184Ri-F 序列為 5′-GGGGACAAGTTTGTACAA AAAAGCAGGCTTCAGACATTTGAAAATTTACA C-3′; MYB184Ri-R 序列為 5′-GGGGACCACTTTGT ACAAGAAAGCTGGGTCAAAATGCTGAGGCACT TTTG-3′。

PCR產(chǎn)物切膠回收后進行BP反應和LR反應,將目的片段插入pB7GWIWG2(II)載體, 最終得到重組RNA干擾載體pBI-MYB184Ri。

過表達載體的構建, 設計帶有酶切位點Xho I和Mlu I的上下游引物, PCR擴增GmMYB184的全長序列。上游引物 MYB184OE-F序列為 5′-ATCCGCTC GAGATGTCTACTTCAAAGAGC-3′; 下 游 引 物MYB184 OE-R 序列為 5′-ATCGACGCGTTTATTTTT GTAACTTGCT-3′。

隨后經(jīng)酶切, 回收, 連接, 將 GmMYB184全長序列正向插入 pBA002載體的CaMV35S啟動子后,構建成過表達載體pBA002-MYB184。

農桿菌介導的大豆毛狀根轉化, 用濃 HCl和NaClO溶液反應產(chǎn)生的氯氣對成熟飽滿的大豆Jack品種的種子滅菌6～8 h, 放入滅菌的容器備用。用滅菌水浸泡滅菌的大豆種子, 于黑暗環(huán)境浸泡 10～12 h。接著在超凈工作臺中去除種皮后將種子接種于萌發(fā)培養(yǎng)基, 每皿約10粒豆子, 放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)(25°C,光照16 h, 黑暗 8 h)至剛長出真葉。

將干擾載體 pBI-MYB184Ri、過表達載體pBA002-MYB184以及對應的空載分別轉化發(fā)根農桿菌 K599, 挑取陽性單克隆至 YEB液體培養(yǎng)基中(含有 Kana 50 μg L–1), 28°C 振蕩培養(yǎng) 48 h, 3000 r min–1離心 10 min, 收集菌體。用 10 mmol L–1MgCl2溶液重懸菌體至終濃度OD600= 0.5。

在超凈臺剪下培養(yǎng)好的大豆的子葉并在每個子葉的背面挖一個凹槽。將處理后的大豆子葉擺放在White培養(yǎng)基上(含有頭孢50 μg mL–1和羧芐霉素50μg mL–1)。將OD600為0.5的菌液滴在子葉的凹槽里,置于培養(yǎng)箱中生長18～20 d (25°C黑暗培養(yǎng))。毛狀根4～8 cm長時取樣, 進行后續(xù)實驗。

1.8 不同組織大豆異黃酮提取及含量檢測

稱取大豆不同組織粉末狀樣品0.015 g, 于2 mL離心管中。加入80%色譜級甲醇溶液1.5 mL (料液比 1∶100), 渦旋混勻 30s, 50°C超聲(頻率 40 kHz,功率300 W)輔助提取1 h, 超聲期間每隔10 min取出樣品上下顛倒混勻。12 000×g離心10 min。小心吸取上清液, 過 0.22 μm 有機相針式濾器, 注入Agilent 2 mL自動進樣專用瓶, –20°C保存待上機檢測。12種異黃酮標樣(Daidzein、Genistein、Glycitein、Daidzin、Genistin、Glycitin、6"-O-acetyldaidzin、6"-O-acetylgenistin、6"-O-acetylglycitin、6"-O-malonyldaidzin、6"-O-malonylgenistinhe和 6"-O-malonylglycitin)購自 Sigma-Aldrich公司。用 80%甲醇溶液將這12種標樣分別配制成0、5、10、20、50、100、500、1000 ng/進樣針, 制作 12條標準曲線用于12種異黃酮單體含量的計算。

使用 HPLC法檢測不同組織異黃酮含量, 采用ZorbaxSB-C18 柱(5 μm, 4.6 mm×150.0 mm), 柱溫保持在36°C, 檢測波長為254 nm (DAD), 進樣量為10 μL。流動相為0.1% (v/v)乙酸水溶液(A)和100%的甲醇(B), 梯度洗脫為 27% B (v/v), 0～2 min; 27%～38%B, 2～3 min; 38% B, 3～10 min; 38%～39% B, 10～12 min; 39% B, 12～14 min; 39%～27% B, 14～15 min, 柱后3 min, 流速為2 mL min–1。本研究異黃酮總含量指大豆12種異黃酮組分的總和, 單位為每克大豆組織干物質所含異黃酮的量(μg g–1)[28]。

對于大豆轉基因毛狀根系的異黃酮測定, 取過表達和沉默GmMYB184轉基因獨立株系各4個, 截取部分根毛, 置烘箱105°C殺青0.5 h, 70°C烘至恒重, 稱取干重 0.015 g, 測定根系中的異黃酮含量,每個轉基因株系重復3次。

2 結果與分析

2.1 GmMYB184基因的克隆及序列分析

前人研究發(fā)現(xiàn)LjMYB62可能與生物、非生物脅迫相關, 通過序列比對發(fā)現(xiàn) GmMYB184 (Glyma.08G042100)是 LjMYB62的同源基因(氨基酸序列相似度74%), 同屬于R2R3-MYB轉錄因子亞家族20,該家族中可能存在與抗病抗逆和異黃酮調控相關的轉錄因子[23-24]。根據(jù)以上結果以及前人對于大豆GmMYB184基因響應干旱、鹽害、冷害和 ABA(abscisic acid)處理的研究結果[29]推斷, GmMYB184可能參與植物非生物脅迫響應及異黃酮生物合成途徑調控。因此選擇GmMYB184作為調控異黃酮合成的候選基因, 進行進一步功能分析。

為了解轉錄因子 GmMYB184在大豆異黃酮合成中的分子機制, 根據(jù)Phytozome (https://phytozome.jgi.doe.gov/)上大豆GmMYB184基因序列, 以大豆葉片 cDNA序列為模板, 使用設計的特異擴增引物GmMYB184-F和GmMYB184-R進行PCR擴增, 得到包含部分 5′-UTR 和部分 3′-UTR 在內的GmMYB184全長 CDS (coding sequence)序列(圖 2),與數(shù)據(jù)庫中目的片段大小(1009 bp)基本一致。經(jīng)比對, 測序結果與大豆基因組數(shù)據(jù)庫的序列一致。非翻譯區(qū), 3′-非翻譯區(qū), 3個外顯子及2個內含子區(qū)域(圖2)。ORF (open reading frame)序列長度為939 bp,編碼蛋白分子量為31.15 kDa的312個氨基酸, 等電點(pI)為 7.15。經(jīng) Pfam 網(wǎng)站(http://pfam.xfam.org/)預測, GmMYB184屬于R2R3-MYB亞家族。

圖2 GmMYB184擴增結果Fig. 2 Amplification result for GmMYB184

將GmMYB184和其他物種如擬南芥、百脈根、苜蓿中已報道的脅迫響應相關的R2R3-MYB轉錄因子蛋白序列比對表明, 這些 MYB序列在 N端區(qū)域有著非常高的保守性, 正是R2R3型DNA結合結構域(圖3)。大豆GmMYB84與GmMYB184的氨基酸序列有著 92%的相似性, 表明 GmMYB84是GmMYB184的同源基因。

圖3 脅迫響應相關R2R3-MYB轉錄因子序列比對Fig. 3 Sequence alignment for stress responsive R2R3-MYB transcription factors

通過鄰接法構建這些序列的進化樹, 進行分子發(fā)育分析發(fā)現(xiàn), GmMYB184與已報道的擬南芥、百脈根和苜蓿中與苯丙烷代謝途徑相關的 MYB轉錄因子關系密切(圖4)。

圖4 脅迫響應相關R2R3-MYB轉錄因子系統(tǒng)發(fā)育分析Fig. 4 Phylogenetic analysis for stress responsive R2R3-MYB transcription factors

2.2 表達分析

實時熒光定量 PCR分析結果發(fā)現(xiàn) GmMYB184在不同組織中的表達量均較低, 主要在根和種子中表達(圖5-A)。在大豆種子的不同發(fā)育時期中, 隨著籽粒成熟, GmMYB184的表達量也逐漸增加(圖5-D)。

比較GmMYB184和IFS2的轉錄水平發(fā)現(xiàn), IFS2基因的表達與GmMYB184的表達模式相似, IFS2在根和種子中大量表達(圖 5-B), 并且隨著籽粒成熟,IFS2的表達量也逐漸增加(圖5-E)。又取大豆不同組織的材料提取異黃酮, 發(fā)現(xiàn)大豆不同組織和發(fā)育時期的異黃酮含量積累模式(圖 5-C, F)也與GmMYB184和IFS2的表達模式相同。因此, 異黃酮的積累與 GmMYB184和IFS2在大豆不同組織和種子發(fā)育時期的表達模式密切相關。

GSH處理3 h后, GmMYB184與對照相比增加了12倍, IFS2基因與對照相比增加4倍。相似地, 7 h后, GmMYB184比對照提高了64倍, IFS2的表達量也提高了 10倍(圖 6)。這些結果證實了 IFS2和GmMYB184在受到脅迫的大豆葉片中的強烈的共表達。此外, 處理期間的表達模式顯示, 大豆GmMYB184轉錄因子有很大的可能性與IFS2共同參與大豆應對脅迫的誘導表達活動, 以及其他相似的生物過程。

2.3 亞細胞定位

單獨的 GFP蛋白分布于整個細胞(圖 7-A), 而GmMYB184-GFP融合蛋白定位于細胞核(圖 7-B)。這與轉錄因子一般在核內進行轉錄調控活動相吻合。

2.4 GmMYB184對CHS8和IFS2的啟動子激活活性分析

運用擬南芥原生質體和雙熒光素酶報告系統(tǒng)瞬時表達分析發(fā)現(xiàn), GmMYB184能夠使IFS2和CHS8的啟動子活性分別提高5倍(圖8-A)和7倍(圖8-B),這表明 GmMYB184能夠顯著增強異黃酮合成途徑關鍵結構基因IFS2和CHS8的啟動子活性, 并在轉錄水平調控異黃酮的合成。

2.5 在大豆毛狀根中過表達和干擾 GmMYB184對異黃酮積累的影響

使用大豆毛狀根轉化系統(tǒng), RNAi沉默和過表達GmMYB184基因, 沉默株系GmMYB184的表達水平與對照相比顯著降低 2～6倍; 過表達株系GmMYB184的表達與對照相比顯著上升 2～4倍(圖9)。并且, GmMYB184沉默株系的異黃酮含量與對照相比顯著降低, 為對照的 39%至 59%。但是,GmMYB184過表達株系的異黃酮含量與對照相比并沒有顯著提高(圖10)。

3 討論

大豆異黃酮的積累受多基因和復雜代謝網(wǎng)絡控制[7]。對代謝途徑中一個或兩個酶基因的修飾或改造不能顯著改變異黃酮含量[1]。轉錄因子可以同時調節(jié)多個基因共同表達, 通過轉錄調控因子的引入有望對整個代謝途徑協(xié)調控制。本研究鑒定了一個與大豆異黃酮合成相關的轉錄因子GmMYB184。通過亞細胞定位、表達分析、轉錄激活活性分析以及大豆根毛轉化等實驗, 驗證了該轉錄因子對異黃酮合成途徑關鍵基因的轉錄激活活性及其在異黃酮合成中的正向調控作用。本研究為大豆異黃酮合成調控的分子機制提供了理論依據(jù), 并為大豆異黃酮品質改良提供了新的靶標位點。

3.1 MYB轉錄因子對異黃酮合成的調控作用

高等植物中 MYB轉錄因子是最大的轉錄因子家族之一, 大豆中已鑒定了約700個MYB轉錄因子[18]。不同 MYB蛋白在不同植物中的功能已得到廣泛研究。它們的功能多種多樣, 比如參與細胞形態(tài)與模式建成[30-31], 植物生長發(fā)育[32-34], 生物和非生物脅迫的響應[35-36]以及苯丙烷代謝途徑的調控[37-39]。但是 MYB家族的大部分成員的功能仍不清楚。因此從這個大家族中鑒定出異黃酮合成的候選調控子,將使我們更好地剖析異黃酮合成的潛在機制, 從而最終為更有效地操控異黃酮的生物合成以滿足不同植物的特異需求奠定堅實的基礎。

圖5 大豆不同組織和不同發(fā)育時期的種子中GmMYB184、IFS2的相對表達量及異黃酮含量Fig. 5 Relative expression levels of GmMYB184 and IFS2, and isoflavone contents in different tissues at different developing stages of soybean seed

圖6 GmMYB184和IFS2的谷胱甘肽誘導表達模式Fig. 6 GSH induced expression pattern of GmMYB184 and IFS2

圖7 GmMYB184的亞細胞定位Fig. 7 Subcellular localization analysis of GmMYB184

圖8 GmMYB184對IFS2和CHS8的啟動子激活活性Fig. 8 GmMYB184 induce the promoter activity of IFS2 and CHS8

圖9 毛狀根中沉默和過表達GmMYB184的相對表達量Fig. 9 Relative expression levels of RNAi and over expression of GmMYB184 in hairy roots

圖10 沉默和過表達GmMYB184毛狀根相對異黃酮含量Fig. 10 Relative isoflavone contents of RNAi and over expression of GmMYB184 in hairy roots

在大豆內源調控異黃酮合成的轉錄因子發(fā)現(xiàn)之前, 人們通過引入外源轉錄因子調控大豆異黃酮合成, 如引入玉米的C1和R轉錄因子, 用于提高大豆籽粒中的異黃酮含量[40]。C1是一個 R2R3-MYB轉錄因子, 參與玉米花青素積累, 行使功能時需要一個含有R-MYC的bHLH輔助因子[41]。R插入C1的DNA結合和激活結構域, 形成一種嵌合蛋白(CRC),可以使異黃酮含量比野生型上升4倍。與此同時, 黃酮合成途徑的基因表達被抑制了, 代謝流和底物轉向了異黃酮途徑[40], 這也暗示了苯丙烷代謝途徑各分支之間對于代謝前體的競爭。

大豆內源轉錄因子的發(fā)現(xiàn)為利用大豆自身轉錄因子調控異黃酮合成提供了新的契機。目前已發(fā)現(xiàn)3個 R2R3-MYB轉錄因子與大豆異黃酮合成相關,其中GmMYB39和GmMYB100在異黃酮的積累中表現(xiàn)負調控的功能, 過表達目的基因抑制異黃酮的積累[20-21]。最近報道的GmMYB29轉錄因子在異黃酮合成中起正調控作用, 該轉錄因子能夠激活CHS8和 IFS2的表達, 過表達和干擾該基因能夠分別提高和抑制異黃酮的合成[19]。與GmMYB29類似,本研究鑒定的 GmMYB184也對異黃酮的生物合成起正調控作用。這些大豆內源轉錄因子的發(fā)現(xiàn)為調控異黃酮合成提供了新的靶向基因位點。

3.2 大豆GmMYB184對異黃酮合成的調控作用

GmMYB184的表達受干旱、鹽害、冷害和ABA脅迫響應, 暗示它可能在植物非生物脅迫中發(fā)揮重要作用[29]。同時, 此基因與豆科植物百脈根中的LjMYB62同源, 后者受GSH誘導, 因為GSH可以誘導異黃酮產(chǎn)生[22-23], 因此推測GmMYB184可能與異黃酮合成相關。表達分析發(fā)現(xiàn), GmMYB184的組織表達和誘導表達與異黃酮合成關鍵基因IFS2的表達模式一致, 暗示二者可能參與相同的代謝途徑。在GSH誘導表達中, 我們注意到6 h后, GmMYB184的誘導表達早于IFS2基因, 這與一般認為轉錄因子先于靶標基因的表達一致[42]。啟動子激活活性分析表明, GmMYB184與GmMYB29都可以激活異黃酮代謝途徑的 IFS2和 CHS8基因, 但激活活性GmMYB184低于 GmMYB29, 可能 GmMYB184還作用于其他靶標基因。另外, 盡管過表達GmMYB184能夠使自身轉錄水平提高, 但是, 異黃酮的含量并沒有顯著提高。對于這樣的結果, 可能的原因是 GmMYB184能夠在擬南芥原生質體中與CHS8和 IFS2的啟動子結合, 并激活基因的表達;但是毛狀根中GmMYB184的過表達是否造成異黃酮合成相關的結構基因的大量表達還有待檢測。即使這些異黃酮合成相關的結構基因表達量上升, 其中CHS8可能還會限制代謝流進入異黃酮合成途徑,導致異黃酮含量沒有顯著變化, 甚至降低[43]。此外,由于某一組織中的異黃酮是由該組織合成的或者由其他母體組織轉運而來的, 因此, 異黃酮合成相關

4 結論

基因以及其調控子的轉錄水平可能反映的是它們合成異黃酮的能力, 而不是在這個組織中積累異黃酮的能力。

這些研究表明轉錄因子對大豆異黃酮的積累存在復雜的調控機制。隨著基因組學和分子生物學技術的發(fā)展, 越來越多的大豆異黃酮合成相關的轉錄因子將被鑒定出來, 今后需要研究這些轉錄因子調控大豆異黃酮合成的分子機制, 并評估對大豆異黃酮含量的影響, 從而可以有效地利用轉錄因子操控異黃酮的生物合成。

克隆了一個與大豆異黃酮合成相關的 R2R3類型MYB轉錄因子GmMYB184。驗證了該轉錄因子對異黃酮合成途徑關鍵基因的轉錄激活活性及其在異黃酮合成中的正向調控作用。

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