牟 超

(撫順市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)及扶貧開發(fā)促進(jìn)中心，遼寧 撫順 113000)

香菇富含多種營養(yǎng)（包括維生素、蛋白質(zhì)、脂肪酸、氨基酸、礦物質(zhì)元素），同時具有宜人的香氣，食之味道鮮嫩，口感絕佳，食用價值較高。香菇又被稱為冬菇或香蕈，在分類學(xué)中屬于擔(dān)子菌綱，傘菌目，口蘑科，香菇屬，是一種為人們所喜愛的常見食用菌。

中國是香菇消費(fèi)和生產(chǎn)的大國，并且中國的香菇栽培規(guī)模也位列于世界的前端，然而在香菇的育種研究方面卻有些許落后。所以，當(dāng)務(wù)之急是香菇新品種研發(fā)以及原有品種的改良工作。目前較為常用的育種手段是原生質(zhì)體技術(shù)，這一技術(shù)能夠在一定程度上有效縮短食用菌的育種周期，但是，此項(xiàng)技術(shù)還未在全國范圍內(nèi)進(jìn)行推廣實(shí)施，目前由原生質(zhì)體技術(shù)所派生出的育種技術(shù)主要有以下4類，原生質(zhì)體誘變、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、原生質(zhì)體融合、原生質(zhì)體單核化。相對于其他育種方式而言，原生質(zhì)體育種具有育種周期短、效率高的特點(diǎn)，同時對于食用菌的品質(zhì)、產(chǎn)量以及抗性都有顯著的提升效果，進(jìn)而提高香菇的育種水平。這個過程里面原生質(zhì)體育種的基礎(chǔ)是原生質(zhì)體的制備和再生。所以，本文重點(diǎn)研究外部環(huán)境條件對于香菇原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響，以此作為食用菌類的原生質(zhì)體育種工作的參照。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試食用菌種： 香菇（Letinula Edodes）遼撫4號編號0912，由撫順市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供；母種培養(yǎng)基（克/升）：馬鈴薯200.0、蔗糖10.0、葡萄糖10.0、蛋白胨2.0、木屑150.0（煎汁過濾）、硫酸鎂0.5、磷酸二氫鉀1.0、水1000.0、瓊脂粉12.0，培養(yǎng)基的酸堿度調(diào)整至5.5；再生培養(yǎng)基：與母種相同，外加穩(wěn)滲劑進(jìn)行定容。

穩(wěn)滲劑配置：甘露醇、0.4摩爾/升的硫酸鎂、氯化鈉、氯化鉀，pH=5的蔗糖和葡萄糖液體。其他試驗(yàn)試劑：0.22微米微孔濾膜過濾除菌，該試劑需要現(xiàn)配現(xiàn)用，酶液用對應(yīng)穩(wěn)滲劑配制酶濃度（W/V，重量體積比）1.0%的蝸牛酶，纖維素酶與混合酶（蝸牛酶∶纖維素酶=1∶1）。Cellulase（MP Biomedical）及Snailase（Wolsen）等為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

原生質(zhì)體數(shù)量統(tǒng)計(jì)：利用血球板進(jìn)行計(jì)數(shù)，首先將原生質(zhì)體稀釋至108，涂至平板上，然后按照公式：原生質(zhì)體產(chǎn)量（個/毫升）=每格平均原生質(zhì)體數(shù)×400×稀釋倍數(shù)×104進(jìn)行計(jì)算。

原生質(zhì)體再生率（%）=[(再生平板菌落數(shù)-CK板菌落數(shù)）×稀釋倍數(shù)]/（涂布體積×原生質(zhì)體濃度）×100

方案設(shè)計(jì)：選取7個外部環(huán)境因素，考察這7 個外部環(huán)境因素對香菇原生質(zhì)體的產(chǎn)量以及再生率的具體影響。詳情見表1。

表1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種類裂解酶原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響

如圖1所示，混合酶的酶解效果要比單一酶所產(chǎn)生的酶解效果好一些，混合酶作為酶解介質(zhì)時，單位時間內(nèi)原生質(zhì)體的產(chǎn)量最高能達(dá)5.69×108個/毫升，此產(chǎn)量是蝸牛酶作為酶解介質(zhì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的1.42倍，是纖維素酶作為酶解介質(zhì)產(chǎn)量的4.15倍；混合酶作為酶解介質(zhì)時，原生質(zhì)體再生率是0.91%，蝸牛酶作為酶解介質(zhì)的原生質(zhì)體再生率為0.9%，達(dá)到了纖維素酶作為酶解介質(zhì)時原生質(zhì)體再生率的2.39倍。產(chǎn)生如此大差異的原因是，香菇自身的菌絲細(xì)胞壁組成成分比較復(fù)雜，因此，需要不同種類的酶共同作用，才能對其產(chǎn)生較好的降解作用。在此組試驗(yàn)中，蝸牛酶是包含了淀粉酶、蛋白酶等20多種不同種類的酶于一體。因此，其酶解效果與混合酶一樣能夠較好的刺激原生質(zhì)體的再生，但是纖維素酶成分比較單一，故而對原生質(zhì)體的酶解效果一般。綜上研究，在后續(xù)的多因素試驗(yàn)中會優(yōu)先選擇混合酶作為介質(zhì)。

圖1 不同酶種類對原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響

圖2 酶解時間對原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響

2.2 酶解時間對原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響

通過圖2可以看出，酶解時間在3小時之內(nèi)時，原生質(zhì)體再生率與時間呈正相關(guān)的關(guān)系，隨著時間的增加，原生質(zhì)體的產(chǎn)量也不斷增加。之后，原生質(zhì)體的再生率則會出現(xiàn)下降。在整個酶解過程中原生質(zhì)體產(chǎn)量從2小時后明顯上升，2.5小時后逐漸下降?；貧w分析后，可知酶解時間為2.82小時，原生質(zhì)體再生率達(dá)到頂點(diǎn)1.7%；酶解時間為3.44小時，原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)到最高2.27×108個/毫升。

2.3 酶解溫度對原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響

原生質(zhì)體的產(chǎn)量及再生率受溫度影響效果明顯，其中30℃是原生質(zhì)體產(chǎn)量變化的臨界點(diǎn)，在這之前原生質(zhì)體產(chǎn)量醉著溫度升高而增加，之后則出現(xiàn)明顯的下降。經(jīng)過回歸方程計(jì)算可以得出，原生質(zhì)體再生率在30℃達(dá)到最高，為1.08%，原生質(zhì)體產(chǎn)量在29℃達(dá)到最高，為4.06×108個/毫升。分析其他酶解介質(zhì)可以得出，蝸牛酶的最適酶解溫度范圍是30～37℃，纖維酶的最適酶解溫度為35℃左右，當(dāng)溫度處于最適酶解溫度時，其對于菌絲體細(xì)胞壁的酶解效果最好。因此，菌絲的細(xì)胞壁分解效率較高。而對于混合酶來說，雖然在35℃時酶活性較高，但是較高的溫度會擾亂菌絲的內(nèi)部代謝，影響細(xì)胞體內(nèi)部穩(wěn)定性，最終影響原生質(zhì)體的產(chǎn)生。因此，當(dāng)溫度高于30℃，原生質(zhì)體的再生率和產(chǎn)量均出現(xiàn)了明顯下降。

2.4 菌齡對原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響

試驗(yàn)結(jié)果如圖3，當(dāng)菌齡低于4天，隨著菌齡的增加，原生質(zhì)體的產(chǎn)量也會增加，當(dāng)菌齡高于4天時，隨著菌齡的增加，原生質(zhì)體的再生率逐步降低；當(dāng)菌齡大于6天時，原生質(zhì)體再生率急速下降。經(jīng)過回歸方程計(jì)算可以得出：原生質(zhì)體再生率在5.4天時達(dá)到最高，約為2.07%；原生質(zhì)體的產(chǎn)量在4.1天時達(dá)到頂點(diǎn)，為2.01×108個/毫升。

2.5 穩(wěn)滲劑種類對原生質(zhì)體制備產(chǎn)量與再生率的影響

圖4可以看出，當(dāng)選取甘露醇作為滲穩(wěn)劑時，原生質(zhì)體的產(chǎn)量最高但是再生率很低，當(dāng)使用硫酸鎂作為穩(wěn)滲劑時，原生質(zhì)體的產(chǎn)量排名第三，僅處于甘露醇和葡萄糖作為滲穩(wěn)劑之后；硫酸鎂的再生率為1.73%，葡萄糖的再生率為1.60%，此再生率僅次于用蔗糖當(dāng)作穩(wěn)滲劑的再生平板，蔗糖的再生率為1.94%。由于在制備原生質(zhì)體時，使用硫酸鎂當(dāng)作穩(wěn)滲劑，不但能夠較好的維持菌絲體細(xì)胞膜內(nèi)外滲透壓的穩(wěn)定性，同時滲穩(wěn)劑中的Mg2+也能夠通過交聯(lián)羧基和磷脂質(zhì)實(shí)現(xiàn)維持細(xì)胞膜穩(wěn)定的作用。但是Mg2+的供能能力較差，難以維持細(xì)胞壁再生所需要的能量，同理單糖也無法實(shí)現(xiàn)此項(xiàng)需求。因此，想要實(shí)現(xiàn)原生質(zhì)體再生率最大化，應(yīng)該選用硫酸鎂作為制備滲穩(wěn)劑，蔗糖作為再生滲穩(wěn)劑。

2.6 穩(wěn)滲劑濃度對原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響

圖5可以看出，滲穩(wěn)劑濃度對于原生質(zhì)體的產(chǎn)量和再生率都能產(chǎn)生影響，當(dāng)使用純凈水作為參照時，目標(biāo)菌絲的原生質(zhì)體產(chǎn)量是4.2×107個/毫升，原生質(zhì)體的再生率為0。在此基礎(chǔ)上不斷加大滲穩(wěn)劑的濃度，可以看出原生質(zhì)體的產(chǎn)量和再生率均呈現(xiàn)先增大后減小的變化。通過觀察試驗(yàn)曲線可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)滲穩(wěn)劑濃度低于0.2摩爾/升時，隨著濃度增加，原生質(zhì)體再生率提升明顯，此后隨著濃度增加原生質(zhì)體再生率無明顯變化；經(jīng)過回歸方程計(jì)算：當(dāng)滲穩(wěn)劑濃度為0.51摩爾/升時，原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)到最高1.85×108個/毫升，當(dāng)穩(wěn)滲劑的濃度為0.33摩爾/升的時候，原生質(zhì)體的再生率會達(dá)到最大值為1.97%。

2.7 pH對原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響

圖3 菌齡對原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響

圖4 穩(wěn)滲劑種類對原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響

圖5 穩(wěn)滲劑濃度對原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響

圖6 pH對原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響

通過觀察下圖6，可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)滲穩(wěn)劑pH處于3～4時，原生質(zhì)體的產(chǎn)量基本上是穩(wěn)定沒有變化，原生質(zhì)體的再生率為0；當(dāng)處于4～5時，對于原生質(zhì)體的產(chǎn)量和再生率都有顯著的提升刺激；當(dāng)處于5～7時，原生質(zhì)體的產(chǎn)量與再生率都會出現(xiàn)不同程度的下降，回歸分析后得出，當(dāng)pH為5.10時，原生質(zhì)體的產(chǎn)量可達(dá)到最大值，為2.34×108個/毫升，當(dāng)pH為5.69時，原生質(zhì)體的再生率可達(dá)到最大值，為1.86%。

3 小結(jié)與討論

供給試驗(yàn)使用的幾種因素在固定限度之中時，都能夠提升原生質(zhì)體的產(chǎn)量以及再生率，并且具有明顯的效果。原生質(zhì)體的最佳制備條件為，在pH為5.0的條件下，使用0.5摩爾/升硫酸鎂作為穩(wěn)滲劑，在溫度達(dá)到28℃的時候?qū)?日齡菌絲進(jìn)行酶解3小時。最佳再生條件為，在pH為5.5的條件下，使用0.5摩爾/升蔗糖作為穩(wěn)滲劑，在溫度達(dá)到27.8℃的時候?qū)?.5日齡菌絲進(jìn)行酶解2.9小時。

酶活和酶解的反應(yīng)時間將會決定原生質(zhì)體的產(chǎn)量大小，各種因素對原生質(zhì)體的產(chǎn)量所造成的影響效果由小到大依次為，滲穩(wěn)劑、菌齡、酶解時間、酶解溫度。同時，酶活性受到酶解液pH和酶解溫度的影響，進(jìn)而影響原生質(zhì)體產(chǎn)量。當(dāng)pH為4.5～6.0范圍內(nèi)，則45～55℃為纖維素酶的最適宜溫度，30～37℃為蝸牛酶的最適宜溫度，酶促反應(yīng)的快慢與酶活性成正相關(guān)關(guān)系；同時混合酶的酶解效果要比單一酶效果顯著；在單位時間內(nèi)，混合酶產(chǎn)生的原生質(zhì)體的數(shù)量要大于單一酶所產(chǎn)生的原生質(zhì)體的數(shù)量。

原生質(zhì)體活性的大小可直接決定原生質(zhì)體再生率的大小，本次研究中選取的各項(xiàng)因素對于原生質(zhì)體再生率影響效果由小到大分別是，酶解溫度、菌齡、酶解時間、滲穩(wěn)劑濃度。滲穩(wěn)劑的濃度過大會導(dǎo)致原生質(zhì)體失水失活、滲穩(wěn)劑濃度過小會導(dǎo)致原生質(zhì)體脹破，這都會影響原生質(zhì)體的再生率。當(dāng)反應(yīng)酶處于其適宜反應(yīng)條件時，酶解的反應(yīng)比較快速，因?yàn)榛旌厦赶的軌驅(qū)Ω鞣N各樣的底物進(jìn)行酶解反應(yīng)，但是，隨著酶解時間不斷增加，原生質(zhì)體膜暴露時間過長會導(dǎo)致其細(xì)胞壁再生率下降。因此，原生再生率也將會減弱。溫度為（25±1）℃時，是香菇菌絲和原生質(zhì)體的最佳生長溫度，過高或者過低均會影響再生率。