秦麗霞 李 靜 張換樣 李 盛 竹夢婕 焦改麗 吳慎杰

山西省農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所, 山西運城 044000

糖基轉移酶(glycosyltransferase, GT, EC 2.4.x.y)廣泛存在于植物體內(nèi), 負責催化小分子化合物(激素、次級代謝物等)的糖基化, 將活性糖基從供體轉移到受體(小分子化合物), 從而改變這些化合物的生物化學性質(zhì)[1-2]。按照序列同源性及催化底物特性及糖苷鍵立體化學性質(zhì)將GTs分為94個不同的家族(http://www.cazy.org/fam/acc_GT.html)[3]。越來越多的證據(jù)顯示GTs在調(diào)節(jié)植物激素和植物抗逆反應中發(fā)揮重要作用。

在擬南芥中過量表達 UGT84B1導致轉基因植株表現(xiàn)出生長素缺陷表型, 植株矮化, 多分枝, 葉片皺縮, 根系失去向地性生長[4-5]。UGT74E2在體外能糖基化生長素IBA, UGT74E2過量表達轉基因擬南芥植株表現(xiàn)出矮化、多分枝, 抗鹽、抗旱性增強[6]。在煙草中過量表達玉米素合成相關糖基轉移酶ZOG1, 導致轉基因比非轉基因材料需多添加 10倍的玉米素才能誘導愈傷組織形成芽[7]。擬南芥UGT76C1、UGT76C2、UGT85A1、UGT73C1 和UGT73C5參與調(diào)控植物對細胞分裂素的響應[8-9]。UGT73C5和 UGT73C6催化油菜素內(nèi)酯的糖基化,在擬南芥中過量表達 UGT73C5植株表現(xiàn)出油菜素內(nèi)酯缺陷表型, 同時伴隨著高水平的油菜素內(nèi)酯糖苷物的積累, 而在突變體株系中則未檢測到油菜素內(nèi)酯糖苷物[10-12]。從擬南芥分離出的葉片傷口處檢測到茉莉酸糖苷的富集, 表明 GTs在激素調(diào)節(jié)和病原菌防御之間也起重要作用[13]。UGT73B1、UGT73B2、UGT73B3和UGT71C1功能缺失突變體增強了植物對氧化脅迫的抗性[14-16]。在擬南芥中過量表達水楊酸合成糖基轉移酶 AtSGTl導致植株體內(nèi)水楊酸及其糖苷水平降低, 進而增加對半活體營養(yǎng)侵染型病原菌假單胞菌的敏感性[17]。雖然以上研究已表明糖基轉移酶參與植物耐逆過程, 但對其具體作用機理尚不清楚, 糖基轉移酶參與植物耐逆過程的分子機制有待深入探索。

非生物脅迫(干旱、土壤鹽漬化、低溫冷害等)是限制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、威脅作物產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素,而傳統(tǒng)育種方法并不能精準有效地提高植物耐受逆境能力。因此, 通過植物基因工程技術結合傳統(tǒng)育種手段, 使抗逆基因在目標作物中特異表達, 以提高作物對逆境脅迫的抗性, 逐漸成為作物育種中的一個重要手段。啟動子作為啟動目標基因表達的關鍵調(diào)控元件, 主要有組成型啟動子、組織特異型啟動子和誘導型啟動子[18]。雖然組成型啟動子在啟動外源基因表達中具有高效、廣譜和穩(wěn)定性強等優(yōu)點,但是由于高效、持續(xù)表達目標基因容易造成一些負面影響(如植株生長異常等), 而誘導型啟動子是在特定條件下啟動目標基因的表達, 很大程度上緩解了由于大量異源蛋白的高表達對植物生長造成的傷害[19-20]。

棉花的生長和發(fā)育過程經(jīng)常受到高鹽、干旱等非生物脅迫因素的影響, 導致產(chǎn)量降低。到目前為止, 在棉花中參與調(diào)節(jié)激素平衡及抗逆脅迫方面的糖基轉移酶尚未見報道。我們之前從棉花cDNA文庫中分離了一個棉花糖基轉移酶 GhGalT1基因[21],為研究其在植物逆境應答中的功能, 本研究分離克隆了GhGalT1基因起始密碼子ATG上游539 bp的啟動子序列。通過PlantCARE軟件分析發(fā)現(xiàn)其包含許多與逆境、激素等相關的順式作用元件, 推測該啟動子受干旱、熱、脫水、激素等脅迫誘導表達, 為此我們構建了含有該啟動子的重組表達載體pBI121-pGhGalT1-GUS, 并通過浸花法轉化擬南芥對其功能進行了驗證, 以期豐富植物誘導型啟動子種類, 為植物抗逆遺傳育種改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

利用本實驗室保存的陸地棉(Gossypium hirsutum L.)品種Coker 312克隆GhGalT1基因的啟動子,擬南芥(Arabidopsis thaliana, 哥倫比亞型)用于啟動子重組質(zhì)粒的轉化與功能驗證。

1.2 棉花基因組DNA的提取

選取飽滿的Coker 312棉花種子, 以70%乙醇處理1 min, 10%過氧化氫(H2O2)處理1.5 h, 無菌水沖洗 3～4次, 隨后加入適量無菌水浸泡至種子根尖露白。去掉種皮, 置1/2 MS培養(yǎng)基上萌發(fā), 28oC培養(yǎng)5～7 d后, 選取生長健壯的幼苗移栽至土壤中, 待幼苗長出2片真葉時, 取2 g左右幼嫩葉片利用CTAB法提取基因組DNA[22]。

1.3 GhGalT1基因啟動子的克隆及順式作用元件分析

以GhGalT1編碼區(qū)序列為探針, Blast搜索中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所網(wǎng)站的陸地棉(Gossypium hirsutum)基因組序列數(shù)據(jù)庫(http://cgp.genomics.org.cn/page/species/blast.jsp), 將該基因上游2 kb左右序列作為目標區(qū)域。

利用在線順式作用元件分析工具 PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalup.htm)和PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析啟動子序列, 預測順式作用元件。

以 Coker 312的基因組 DNA為模板, 使用PrimeSTAR HS DNA Polymerase高保真酶, PCR擴增 GhGalT1基因的啟動子目的片段, 命名為pGhGalT1, 瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增條帶大小。擴增體系為 5×Prime STAR 緩沖液 (Mg2+plus) 4 μL,dNTPs (各 2.5 mmol L–1) 4 μL, 模板 DNA (500 ng μL–1) 1 μL, 引物 pGhGalT1-F (10 μmol L–1) 1 μL,pGhGalT1-R (10 μmol L–1) 1 μL (表 1), PrimeSTAR HS DNA 聚合酶 (2.5 U μL–1) 0.2 μL, 用 ddH2O 補至20 μL。反應程序為 98oC 10 s, 55oC 15 s, 72oC 1 min,30個循環(huán); 72oC 10 min。將擴增得到的序列連接至pBluescript(pSK)載體上測序驗證, 與棉花基因組數(shù)據(jù)庫序列比對。

表1 本試驗中所用引物序列Table 1 Primers used in this study

1.4 GhGalT1啟動子載體構建、擬南芥轉化及陽性植株檢測

用 Sal I和 BamH I分別酶切植物表達載體pBI101和擴增的 GhGalT1基因啟動子目的片段pGhGalT1后, 進行連接, 獲得重組質(zhì)粒 pBI101-pGhGalT1-GUS (圖1), 轉化農(nóng)桿菌GV3101菌株。

采用農(nóng)桿菌介導的浸花法轉化擬南芥[23]。經(jīng)卡那霉素抗性篩選后獲得 T1代轉基因擬南芥。取 T1代轉基因植株幼苗葉片, 利用 SDS法提取基因組DNA, 并以此為模板通過 PCR擴增檢測陽性植株,擴增引物為 pGhGalT1-F和 pGhGalT1-R、GUS-F和GUS-R和抗性標記基因NPTII-F和NPTII-R (表1), 產(chǎn)物大小分別為539、1812和795 bp。選取PCR檢測呈陽性的單株收獲種子并加代, 再經(jīng)卡那霉素抗性篩選及PCR檢測得到T3代純合轉基因陽性株系。

圖1 pBI101-pGhGalT1-GUS表達載體構建示意圖Fig. 1 Map of construction of the pBI101-pGhGalT1-GUS expression vector

1.5 GUS組織化學染色

取野生型和 T3代轉基因擬南芥植株種子, 經(jīng)10% NaClO溶液表面消毒后, 分別點播于MS培養(yǎng)基上, 4oC春化處理2 d, 于恒溫光照培養(yǎng)箱(16 h光照/8 h 黑暗, 22～24oC)培養(yǎng), 分別取生長 5、10 和 15 d幼苗、莖、花和角果、成熟葉片等組織進行GUS組織化學染色[24]。

選取長勢一致的幼苗浸入 GUS染液(含 10 mmol L–1EDTA, 100 mmol L–1NaH2PO4·H2O, 0.5%Triton X-100, 1 mmol L–1K3Fe(CN)6, 1 mmol L–1K4Fe(CN)6·3H2O, 0.1% X-Gluc)中, 于 37oC 染色 6～8 h, 除去染液。再用70%乙醇室溫脫色3～5 h, 其間更換 70%乙醇 2～3次, 直至各組織的色素完全退去。取樣品在Leica MZ16f體視顯微鏡下觀察, 照相。

取適量生長10 d的轉基因擬南芥幼苗分別移至含 150 mmol L–1NaCl、300 mmol L–1甘露醇、100 μmol L–16-BA、50 μmol L–1茉莉酸甲酯(MeJA)和500 nmol L–1油菜素內(nèi)酯(BL)的MS液體培養(yǎng)基中處理6 h后, 進行GUS染色分析, 本試驗重復3次。

1.6 GUS酶活測定

GUS活性的熒光檢測方法參照Jefferson[25]。將生長10 d幼苗分別用MS液體和添加有150 mmol L–1NaCl、300 mmol L–1甘露醇、100 μmol L–16-BA、50 μmol L–1MeJA 或 500 nmol L–1BL 的 MS 液體培養(yǎng)基誘導6 h。取0.1 g樣品于預冷的研缽中, 加0.5 mL預冷的研磨緩沖液(100 mmol L–1K3PO4, pH 7.8,1 mmol L–1EDTA, 1% Triton X-100), 迅速研磨成勻漿后轉入預冷的1.5 mL離心管中, 2130×g, 4oC離心10 min, 上清液即為GUS蛋白粗提取液。以4-MUG為作用底物進行酶促反應后, 反應產(chǎn)物在365 nm的激發(fā)光下測定455 nm的熒光強度(HITACHI F-2500),考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量。

1.7 GUS基因的表達分析

取適量生長10 d攜有啟動子序列的擬南芥幼苗分別移至含 150 mmol L–1NaCl、300 mmol L–1甘露醇、100 μmol L–16-BA、50 μmol L–1MeJA 或 500 nmol L–1BL的MS液體培養(yǎng)基中處理6 h后收取幼苗材料。用RNA-Solv Reagent (Omega)提取幼苗總RNA, 經(jīng)DNase (RQ1 RNase-Free DNase, Promega)消化后, 用逆轉錄酶(M-MLV Reverse Transcriptase,Promega)合成cDNA。應用實時熒光定量RT-PCR技術(MJ Research, Opticon 2), 以 cDNA 為模板, 用GUS基因特異性引物GUS-RTF和GUS-RTR (表1)和 Real-time PCR Master Mix (TOYOBO)進行 PCR反應。以擬南芥的 Actin2作為內(nèi)參基因, 目標基因每一個循環(huán)的擴增都被 SYBR-Green熒光檢測, 具體步驟及分析參照Li等[26]的方法, 重復3次, 統(tǒng)計分析試驗結果。

2 結果與分析

2.1 GhGalT1啟動子的克隆及順式作用元件分析

靠近GhGalT1編碼區(qū)開放閱讀框5′上游539 bp(圖2)區(qū)域序列具有TATA-box、CAAT-box等真核生物啟動子基本調(diào)控元件, 此外還包含多種逆境響應功能元件, 如干旱誘導的 MYB結合元件 MBS、脫水響應元件 MYCCONSE、熱應答元件 HSE、防御與脅迫應答元件 TC-rich repeats、MeJA響應元件CGTCA-motif、調(diào)控生物節(jié)律元件以及多種光響應相關元件等(圖3和表2)。

圖2 棉花GhGalT1基因啟動子的克隆Fig. 2 Amplified fragment of GhGalT1 gene promoter in cotton

圖3 GhGalT1啟動子序列及預測的順式作用元件Fig. 3 Sequence and predicted cis-acting elements of GhGalT1 promoter

2.2 GhGalT1啟動子載體構建及擬南芥轉化與陽性植株的鑒定

為了研究GhGalT1啟動子的活性及其表達模式,將該啟動子擴增產(chǎn)物pGhGalT1 (圖2)及植物表達載體pBI101分別用Sal I和Bam HI雙酶切后連接, 經(jīng)PCR擴增和酶切檢測驗證獲得正確的重組質(zhì)粒(圖4-A和 B)。通過農(nóng)桿菌介導法轉化擬南芥, 獲得轉基因植株。經(jīng)卡那霉素抗性篩選和PCR檢測呈陽性的單株收獲種子并加代(圖5, 圖6-A～C), 獲得T3代純合轉基因陽性株系(圖6-D)。

表2 GhGalT1啟動子主要順式作用元件及預測的功能Table 2 The cis-acting elements and predicted functions in the GhGalT1 promoter sequence

圖4 GhGalT1啟動子載體的構建Fig. 4 Vector construction of GhGalT1 promoter

圖5 T1代轉基因擬南芥陽性植株的卡那霉素抗性篩選Fig. 5 Kanamycin resistance screening of T1 generation transgenic positive plants

圖6 轉基因擬南芥陽性植株的PCR檢測Fig. 6 Positive detection in transgenic Arabidopsis lines by PCR

2.3 GUS組織化學染色

圖7表明GUS信號主要在生長5、10和 15 d轉基因植株幼苗的主根及側根的根尖表達, 在 10 d以后的子葉及蓮座葉邊緣也有GUS表達, 而在莖、花、角果等部位未檢測到 GUS信號, 表明靠近GhGalT1編碼區(qū)開放閱讀框上游的 539 bp的GhGalT1啟動子區(qū)域可以驅動GUS基因表達, 是啟動子的活性區(qū)域。

圖7 GhGalT1啟動子轉基因擬南芥的GUS活性檢測Fig. 7 Histochemical assay of GUS activity in pGhGalT1:GUS transgenic Arabidopsis

2.4 不同脅迫條件下的GUS染色及定量分析

Genevestigator網(wǎng)站(https://genevestigator.com/gv/)分析顯示, 與 GhGalT1基因同源的擬南芥AtGalTs基因受鹽、干旱、激素(6-BA、MeJA、BL等)的誘導。將生長 10 d的幼苗移至分別添加 150 mmol L–1NaCl、300 mmol L–1甘露醇、100 μmol L–16-BA、50 μmol L–1MeJA 和 500 nmol L–1BL 的 MS液體培養(yǎng)基中處理6 h, 然后進行GUS染色分析。圖 8顯示, 與無脅迫對照相比, 經(jīng) NaCl、甘露醇和MeJA處理后, 轉基因株系根中GUS信號明顯減弱;用BL處理后, 根中GUS信號顯著增強; 而在6-BA處理的小苗根中GUS信號完全消失, 子葉和蓮座葉中的GUS信號卻明顯增強。

圖8 鹽、干旱和激素處理GhGalT1啟動子轉基因擬南芥的GUS活性檢測Fig. 8 Histochemical assay of GUS activity of GhGalT1 promoter in transgenic Arabidopsis under stresses

進一步定量確定啟動子的表達活性, 對鹽、干旱、激素(6-BA、MeJA、BL)處理過的 10 d幼苗進行GUS酶活測定, 同時提取總RNA后, 對GUS基因進行實時熒光定量 PCR分析其表達量。結果經(jīng)NaCl、甘露醇和MeJA處理后, GUS活性及GUS基因表達量顯著降低, 6-BA、BL處理后GUS活性及GUS基因表達量顯著升高(圖9), 表明GhGalT1基因的啟動子受鹽、滲透脅迫和激素(6-BA、MeJA、BL等)的誘導。

圖9 脅迫條件下轉基因擬南芥GUS定量分析Fig. 9 Quantification of GUS activity and GUS gene in transgenic Arabidopsis under different stresses

3 討論

真核生物基因表達受染色體水平上的基因活化調(diào)節(jié)、轉錄水平、轉錄后水平和翻譯水平的調(diào)控, 外源基因在受體內(nèi)的表達受到諸多因素的影響, 如插入位置、拷貝數(shù)、啟動子類型等, 但很大程度上依賴于外源基因的啟動子[27]。目前, 研究啟動子的方法主要有生物信息學分析及試驗分析兩種。利用生物信息學分析啟動子序列, 預測其中的順式作用元件種類、數(shù)目及位置, 可以為進一步確定啟動子的功能奠定基礎。試驗分析主要有瞬時表達、5′端片段缺失分析[28]、凝膠阻滯[29]、酵母單雜交[30]等方法。本研究采用生物信息學分析和啟動子融合GUS基因瞬時表達相結合的方法, 研究GhGalT1基因啟動子的重要順式作用元件和表達特性。

通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn), 在 GhGalT1啟動子區(qū)域存在多種重要的非生物脅迫應答元件, 例如響應干旱、防御與脅迫等逆境的元件。Genevestigator網(wǎng)站(https://genevestigator.com/gv/)分析也顯示與GhGalT1基因同源的擬南芥 AtGalTs基因受鹽、干旱、激素(6-BA、MeJA、BL等)的誘導。GUS組織化學染色表明鄰近GhGalT1基因開放閱讀框5′端上游的539 bp啟動子區(qū)段是其活性核心區(qū)域; 同時生物信息學分析結果也顯示該活性區(qū)域中包含了響應干旱和滲透脅迫的順式作用元件。我們對轉539 bp片段啟動子擬南芥進行脅迫處理, 結果發(fā)現(xiàn)在NaCl、甘露醇和 MeJA處理后, 轉基因株系中 GUS信號、GUS酶活性及GUS表達量明顯降低。在BL處理后, 其活性及表達量顯著增加, 而在6-BA處理后, GUS信號由根尖轉移至子葉及蓮座葉邊緣部位且GUS活性及表達量顯著升高。推測 GhGalT1基因的啟動子響應鹽、干旱和激素脅迫應答, 可能是通過結合干旱誘導型MYB結合元件MBS、熱應答元件 HSE、防御與脅迫應答元件 TC-rich repeats、MeJA響應元件CGTCA-motif來調(diào)節(jié)的。

利用誘導性啟動子在特定條件下驅動相應基因的高效表達, 增強植物對不良環(huán)境條件的抵抗性,近年來逐漸成為研究熱點。目前已有一些關于植物誘導型啟動子的研究報道, 如馬鈴薯損傷誘導型啟動子Wun1[31]、柑橘冷誘導型啟動子pPtcor8[32]、馬鈴薯光誘導型啟動子Sgt1p[33]、擬南芥冷誘導型啟動子CBF3[34]、擬南芥逆境誘導型啟動子rd29A[35]、棉花受多逆境誘導表達的GhWRKY64基因啟動子[36]、小麥干旱和滲透脅迫誘導型啟動子TaPP2AbB″-α[37]等。這些能夠同時受多種因素誘導表達的啟動子被稱為多元調(diào)控啟動子, 目前能夠廣泛應用于轉基因研究的多元調(diào)控啟動子仍然比較少, 而本研究所克隆的棉花GhGalT1啟動子受干旱和高鹽、激素誘導表達, 屬于多逆境誘導型啟動子, 為了將該啟動子更精確地用于棉花遺傳改良, 后續(xù)的工作將對該啟動子進行缺失片段分析, 確定對鹽、干旱及不同激素響應的順式作用元件及功能區(qū), 有望進一步應用于植物遺傳育種改良研究。

4 結論

從陸地棉品種Coker 312基因組DNA中克隆了GhGalT1基因的啟動子 pGhGalT1, 長度為 539 bp,該區(qū)域包含響應干旱、熱、脫水、防御與脅迫應答的順式作用元件MBS、HSE、MYCCONSE、TC-rich repeats和CGTCA-motif。NaCl、甘露醇或MeJA處理后, 轉基因株系中 GUS活性顯著降低, BL或6-BA處理后, GUS活性顯著升高, 驗證了啟動子活性區(qū)的功能。本研究結果為選用啟動子改良作物提供了依據(jù)。

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