徐海瑛， 郝紅英， 陳青閣， 趙優(yōu)琴， 李玉魁， 周小漫， 馬 欣， 丁燕偉

(黃河科技學(xué)院醫(yī)學(xué)院，河南鄭州 450063)

魚腥草(Houttuyniacordata)為三白草科蕺菜屬植物，主要產(chǎn)于浙江、江蘇、安徽、福建、河南等省，作為藥食兩用的植物，魚腥草具有清熱解毒、消癰排膿、利尿通淋等功能[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，魚腥草具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎癥、抗腫瘤和提高免疫力等生理功效[2]。此外，魚腥草含有多種活性物質(zhì)成分，主要活性物質(zhì)有揮發(fā)油和黃酮類化合物，如魚腥草素、槲皮素、槲皮苷等[3]。槲皮素是植物界分布最廣的黃酮類化合物，有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等多種生物活性[4-6]。由于槲皮素的水溶性較差，人們通常對槲皮素進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾。槲皮素對金屬離子有很強(qiáng)的螯合作用，可以產(chǎn)生穩(wěn)定的環(huán)狀化合物，因此，近年來人們對槲皮素配合物的研究逐漸增多，成為開發(fā)利用槲皮素的新途徑。

近年來，國內(nèi)外研究者已經(jīng)合成了30多種槲皮素金屬配合物，有些金屬配合物具有顯著的抗氧化、抗炎、抗菌活性[7]。關(guān)于魚腥草有效成分單體及其金屬配合物對耐藥菌株抗菌活性的研究較少。在提取魚腥草中槲皮素及合成槲皮素金屬配合物的試驗(yàn)基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)選擇臨床上常見的致病菌——金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，簡稱SA)和銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，簡稱PA)的標(biāo)準(zhǔn)菌株和耐藥菌株研究槲皮素單體及其金屬配合物的抗菌活性，以期為開發(fā)槲皮素提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 藥品 魚腥草活性成分槲皮素單體，槲皮素-Zn(鋅)、槲皮素-Mn(錳)、槲皮素-Cu(銅)、槲皮素-Fe(鐵)、槲皮素-Mg(鎂)等金屬配合物，均由黃河科技學(xué)院化學(xué)實(shí)驗(yàn)室郝紅英副教授所在課題組提供。

1.1.2 菌種 銅綠假單胞菌[美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)保藏編號(hào)：ATCC27853]、金黃色葡萄球菌(ATCC25923)由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。銅綠假單胞菌耐藥菌株、金黃色葡萄球菌耐藥菌株由黃河科技學(xué)院醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院提供。

1.1.3 試劑與儀器 M-H(A)培養(yǎng)基(即水解酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基)、M-H(B)培養(yǎng)基(即水解酪蛋白肉湯培養(yǎng)基)、LB培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)、二甲基亞砜(DMSO)，均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)，上海錦昱科學(xué)儀器有限公司；GH-500BC隔水恒溫培養(yǎng)箱，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；DRAGONLAB微量移液槍，深圳良誼實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司。

1.2 方法

采用WHO(世界衛(wèi)生組織)推薦的瓊脂稀釋法，通過測定最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，簡稱MIC)，評價(jià)槲皮素單體及其金屬配合物的抗菌活性[8-10]。

1.2.1 藥液制備 分別稱取槲皮素單體及其金屬配合物各100 mg，置于EP(eppendorf)管中，再加入二甲基亞砜(DMSO)2 mL，輕輕振搖，使得藥物充分溶解，配制成濃度為 50 mg/mL 的原液，將原液分別用DMSO等倍稀釋成濃度為25、12.5、6.25、3.125、1.562 5、0.781 25 mg/mL的藥液。放入4 ℃冰箱中備用。

1.2.2 菌液制備 分別將SA和PA的標(biāo)準(zhǔn)菌株、耐藥菌株接種在LB培養(yǎng)基上，于37 ℃溫箱培養(yǎng)18～24 h。再將培養(yǎng)良好的上述細(xì)菌在無菌條件下接種至M-H肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃溫箱培養(yǎng)4～6 h，將增菌后的菌液用生理鹽水校正濃度至1.5×108CFU/mL，再用MH肉湯將菌懸液進(jìn)行 1 ∶1 000 稀釋后備用，含菌量約為105CFU/mL。

1.2.3 抑菌試驗(yàn) 配制M-H(A)培養(yǎng)基，并分裝于試管中，將培養(yǎng)基進(jìn)行高壓蒸汽滅菌(121 ℃、20 min)，然后將培養(yǎng)基置于70 ℃恒溫水浴箱中備用。在超凈臺(tái)中將M-H(A)培養(yǎng)基倒入無菌塑料培養(yǎng)皿中，加入已制備好的各濃度藥液，充分混勻，靜置凝固成含藥平板，使藥物的終濃度為5、2.5、1.25、0.63、0.31、0.17、0.08 mg/mL，DMSO的體積分?jǐn)?shù)為10%。同時(shí)設(shè)空白對照和溶劑對照平板。每種濃度的藥物和對照均設(shè)3次重復(fù)。在超凈臺(tái)中，取2 μL已制備好的菌液，點(diǎn)接種于含藥平板上的相應(yīng)位置，標(biāo)記后置于37 ℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)18 h。然后通過無菌操作在細(xì)菌接種點(diǎn)處加10 μL 0.5% 2，3，5-三苯基氯化四氮唑，置于37 ℃溫箱中培養(yǎng)2～4 h后觀察結(jié)果。

1.2.4 結(jié)果判定和處理 觀察平板中細(xì)菌接種處的菌落顏色變化，細(xì)菌接種點(diǎn)顯示紅色，表示細(xì)菌生長，記錄為“+”；細(xì)菌接種點(diǎn)不顯示紅色，表示細(xì)菌未生長，記錄為“-”。細(xì)菌未生長時(shí)的最小藥物濃度即為該藥物對該細(xì)菌的最小抑菌濃度，計(jì)算重復(fù)試驗(yàn)MIC的平均值。數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析。

2 結(jié)果與分析

TTC是一種活菌染料，活細(xì)菌中的琥珀酸脫氫酶能將TTC還原成紅色的甲瓚(Formazan)，從而使培養(yǎng)物呈現(xiàn)紅色，而死細(xì)菌則為無色，因此細(xì)菌培養(yǎng)物顯示紅色表示有細(xì)菌生長，反之則表示無細(xì)菌生長。經(jīng)試驗(yàn)測定，空白對照和DMSO溶劑對照中的4種菌株接種點(diǎn)處均顯示紅色，說明空白對照平板和溶劑對照平板上4種菌株生長良好，10% DMSO對4種菌株生長無任何影響，藥物濃度是影響細(xì)菌生長的因素之一。MIC是細(xì)菌未生長時(shí)的最小藥物濃度，MIC值越小，說明藥物的抑菌作用越強(qiáng)。

2.1 對SA的抗菌活性

由表1、圖1可以看出，對于SA標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25923，槲皮素單體的MIC為1.88 mg/mL，槲皮素-Zn、槲皮素-Mn、槲皮素-Cu、槲皮素-Mg的MIC分別為0.31、3.75、5.00、5.00 mg/mL，而槲皮素-Fe的MIC大于 5.00 mg/mL。槲皮素-Zn的抑菌作用強(qiáng)于槲皮素單體(P<0.01)，而槲皮素-Mn(P<0.05)、槲皮素-Cu(P<0.01)、槲皮素-Mg(P<0.01)、槲皮素-Fe的抑菌活性弱于槲皮素單體。

表1 槲皮素及其金屬配合物的最小抑菌濃度

注：“*”表示與槲皮素組相比差異顯著(P<0.05)，“**”表示與槲皮素組相比差異極顯著(P<0.01)。

由表1、圖2可以看出，對于SA耐藥菌株，槲皮素單體的MIC為0.94 mg/mL，槲皮素-Zn、槲皮素-Mn、槲皮素-Cu、槲皮素-Mg的MIC分別為0.94、3.75、3.75、5.00 mg/mL，而槲皮素-Fe的MIC大于5 mg/mL。槲皮素-Zn和槲皮素單體的抑菌作用相當(dāng)，而槲皮素-Mn(P<0.01)、槲皮素-Cu(P<0.01)、槲皮素-Mg(P<0.01)、槲皮素-Fe的抑菌活性弱于槲皮素單體。

2.2 對PA的抗菌活性

對于PA標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25893，槲皮素單體的MIC為 0.94 mg/mL，槲皮素-Zn、槲皮素-Mn、槲皮素-Cu、槲皮素-Mg、槲皮素-Fe的MIC分別為0.47、5.00、1.88、1.88、0.94 mg/mL。槲皮素-Zn的抑菌作用強(qiáng)于槲皮素單體(P<0.05)，槲皮素-Mn(P<0.01)、槲皮素-Cu(P<0.05)、槲皮素-Mg(P<0.05)的抑菌活性弱于槲皮素單體，槲皮素-Fe和槲皮素單體的抑菌活性相當(dāng)(表1和圖3)。

對于PA耐藥菌株，槲皮素單體的MIC為 1.88 mg/mL，槲皮素-Zn、槲皮素-Mn、槲皮素-Cu、槲皮素-Mg、槲皮素-Fe的MIC分別為0.63、1.88、5.00、5.00、5.00 mg/mL。槲皮素-Zn的抑菌作用強(qiáng)于槲皮素單體(P<0.01)，槲皮素-Mn和槲皮素單體的抑菌活性相當(dāng)，槲皮素-Cu(P<0.01)、槲皮素-Mg(P<0.01)、槲皮素-Fe(P<0.01)的抑菌活性弱于槲皮素單體(表1和圖4)。

3 討論與結(jié)論

SA為革蘭氏陽性菌(G+)，是引起化膿性感染(如毛囊炎、肺炎、膿毒癥、敗血癥等)的常見致病菌之一[11]。PA為革蘭氏陰性菌(G-)，是引起醫(yī)院感染的重要條件致病菌之一。近年來，隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌的耐藥性問題愈加突出，如耐藥性SA、耐藥性PA，這些耐藥菌感染對人體健康都構(gòu)成了極大威脅[12-13]。中草藥因?yàn)榫哂胁涣挤磻?yīng)小、資源豐富、價(jià)格低廉、作用靶位多、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)而受到越來越多的關(guān)注。作為魚腥草有效成分之一的槲皮素，具有多種生物活性，其作為金屬離子螯合配體也一直倍受關(guān)注[7]。本試驗(yàn)研究了槲皮素單體及其5種金屬配合物對SA和PA的質(zhì)控菌株、耐藥菌株的抗菌活性。

通過研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素、槲皮素-Zn、槲皮素-Mn、槲皮素-Cu、槲皮素-Mg、槲皮素-Fe對SA、PA的標(biāo)準(zhǔn)菌株和耐藥菌株均有抗菌活性。其中，槲皮素-Zn的抗菌活性強(qiáng)于槲皮素單體，而其他金屬配合物的抗菌活性要弱于槲皮素。對于SA標(biāo)準(zhǔn)菌株，槲皮素-Zn的抗菌活性最強(qiáng)，其MIC為 0.31 mg/mL，其他抗菌活性強(qiáng)弱順序?yàn)殚纹に?、槲皮?Mn、槲皮素-Cu、槲皮素-Mg、槲皮素-Fe；對于PA標(biāo)準(zhǔn)菌株，槲皮素-Zn的抗菌活性最強(qiáng)，其MIC為0.47 mg/mL，其他抗菌活性強(qiáng)弱順序?yàn)殚纹に?、槲皮?Fe、槲皮素-Cu、槲皮素-Mg、槲皮素-Mn；對于SA耐藥菌株，槲皮素-Zn和槲皮素抑菌活性相當(dāng)，而其他金屬配合物要弱于槲皮素；對于PA耐藥菌株，槲皮素-Zn的抑菌活性要強(qiáng)于槲皮素，槲皮素-Mn和槲皮素的抑菌活性相當(dāng)，其他金屬配合物弱于槲皮素。本研究結(jié)果顯示，槲皮素及其金屬配合物可以抑制SA、PA的標(biāo)準(zhǔn)菌株和耐藥菌株生長，從而為臨床治療耐藥菌感染提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步開發(fā)利用槲皮素提供了理論依據(jù)。