馮振宇，趙 杰，馬小娟，王虹娟，陳佳麗

（山西中醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，山西太原030013）

抑郁癥是一種嚴(yán)重危害人類身心健康的精神疾病，其終生患病率高達(dá)15%～20%，并且呈慢性及反復(fù)發(fā)作性等特點(diǎn)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［1-2］。目前，關(guān)于抑郁癥的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。大量研究證實(shí)，海馬神經(jīng)突觸結(jié)構(gòu)損傷和神經(jīng)元再生障礙等神經(jīng)可塑性的改變是抑郁癥發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）在神經(jīng)元的生長(zhǎng)與突觸的形成方面起到了重要作用，具有調(diào)控神經(jīng)突觸可塑性的效應(yīng)，在抑郁癥發(fā)生與病理過(guò)程中的作用已得到了廣泛關(guān)注。海馬內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cAMP）-cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）通路-腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）信號(hào)通路是BDNF調(diào)控海馬神經(jīng)元可塑性的重要胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制［3］。目前，調(diào)節(jié)誘導(dǎo)海馬BDNF及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，已經(jīng)成為抗抑郁藥物研究和開(kāi)發(fā)的一個(gè)熱點(diǎn)。

助陽(yáng)開(kāi)郁方由“甘麥大棗湯”合清末鄭欽安的“補(bǔ)坎益離丹”加減化裁而成，其作為臨床驗(yàn)方應(yīng)用于抑郁癥已有十余年，在前期的臨床療效評(píng)價(jià)研究中發(fā)現(xiàn)，本方可以通過(guò)調(diào)整抑郁癥患者5-羥色胺、去甲腎上腺素水平干預(yù)陽(yáng)虛型抑郁癥患者神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)發(fā)揮治療作用。課題組通過(guò)建立應(yīng)激抑郁動(dòng)物模型，觀察到本方能夠有效改善抑郁癥大鼠行為學(xué)表現(xiàn)，并對(duì)調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)可塑性具有一定的作用。本研究選擇BDNF及其關(guān)鍵的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路cAMP-CREB-BDNF通路進(jìn)行研究，以期進(jìn)一步探討助陽(yáng)開(kāi)郁方抗應(yīng)激抑郁的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 助陽(yáng)開(kāi)郁方由炮附子15 g，蛤粉 20 g，牡蠣 30 g，桂枝 15 g，砂仁 10 g，炒黃柏10 g，茯苓20 g，炙甘草10 g組成，飲片購(gòu)自山西中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥房。按原方比例稱取藥材，先浸泡30 min，附子單獨(dú)浸泡并先煎60 min再與其余藥物共煎20 min，反復(fù)煎煮3次，混合藥汁，至稠膏狀，60℃烘干制成干膏并粉碎成細(xì)粉，過(guò)80目篩。鹽酸氟西汀分散片（西班牙禮來(lái)公司，批號(hào)：A496002，規(guī)格20 mg/片），助陽(yáng)開(kāi)郁方各劑量與鹽酸氟西汀根據(jù)“人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比率表”計(jì)算配制成濃縮水溶液備用。

1.1.2 動(dòng)物 無(wú)特定病原體SPF級(jí)雄性Wistar大鼠共 36 只，初始體重（165±15）g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司［許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0024］。

1.1.3 主要試劑 cAMP ELISA檢測(cè)試劑盒（Elabscince 公司，批號(hào)：AK0015AUK18），組織 RNA 快速提取試劑盒（北京艾德萊生物有限公司，批號(hào)202366AX），DNA逆轉(zhuǎn)錄試劑（北京艾德萊生物有限公司，批號(hào)267258AH），PCR擴(kuò)增試劑（北京艾德萊生物有限公司，批號(hào)272632AX），內(nèi)參βactin、CREB、BDNFmRNA特異性引物（武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司設(shè)計(jì)）。

1.1.4 主要儀器 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司），Synergy 4多功能微孔板檢測(cè)儀（美國(guó)BioTek公司），Tc-xP基因擴(kuò)增儀（杭州博日科技有限公司），Scandrop 250超微量分光光度計(jì)（德國(guó)耶拿公司），JXFSTRP-24全自動(dòng)樣品快速研磨儀（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司），1316型生物安全柜（美國(guó)Thermo公司），MB-102恒溫金屬?。ê贾莶┤湛萍加邢薰荆?，F(xiàn)resco17高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司）。

1.2 方 法

1.2.1 動(dòng)物分組 將36只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，然后按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、助陽(yáng)開(kāi)郁方高、中、低劑量組，氟西汀組，每組6只。

1.2.2 造模及給藥 參照文獻(xiàn)方法［5］除正常組外，其余各組大鼠均給予慢性不可預(yù)知溫和刺激刺激（CUMS）結(jié)合孤養(yǎng)造模，具體方法為：選用夾尾（1 min）、閃光（1 h）、噪音（1 h）、冰水游泳（4 ℃，5 min）、傾斜籠具（30 °，24 h）、潮濕墊料（100 mL，24 h）、晝夜顛倒、禁水、禁食9種溫和刺激，于每日9：00和16：00隨機(jī)安排刺激2次，連續(xù)刺激28 d。在造模的同時(shí)，空白組和模型組大鼠給予0.9%氯化鈉溶液灌胃，助陽(yáng)開(kāi)郁方高、中、低劑量組分別灌胃助陽(yáng)開(kāi)郁方濃縮煎劑（劑量分別相當(dāng)于生藥11.7 g/kg、23.4 g/kg、46.8 g/kg），氟西汀組灌胃鹽酸氟西?。?.8 mg/kg），每只大鼠灌胃容量為0.2 mL/10 g，連續(xù)灌胃 28 d。

1.2.3 樣本采集 于實(shí)驗(yàn)第29 d，采用3%戊巴比妥鈉2 mL腹腔注射麻醉大鼠，然后斷頭處死，冰盤(pán)上迅速分離海馬組織并置于液氮保存。

1.2.4 ELISA法檢測(cè)大鼠海馬cAMP含量 將海馬組織于2℃～8℃復(fù)溫，加入2 mL預(yù)冷的PBS緩沖液（pH 7.4），用自動(dòng)研磨儀在液氮中研磨制作成勻漿，勻漿液以3 000 r/min低溫離心20 min，收集上清，采用ELISA方法檢測(cè)海馬cAMP含量，檢測(cè)過(guò)程中嚴(yán)格按照檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明操作。

1.2.5 RT-PCR法檢測(cè)海馬組織CREB與BDNF mRNA的表達(dá) 用自動(dòng)快速研磨儀將海馬組織在液氮中研磨制作成組織勻漿。采用EASY spin Plus組織RNA快速提取試劑盒，按照其說(shuō)明書(shū)提取總RNA并在液氮保存；采用紫外分光光度儀測(cè)定總RNA濃度與A 260/A280的比值，比值在1.8～2.0之間方可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)；每樣取總RNA 1.5 μg與 Oligo（dT）18引物溶液 1 μL、5RT Reaction Mix 4 μL、TRuE script H-R Tase/RI 1 μL 混合合成cDNA，加入RNase free water定容到總體積20 μL，混勻后離心，42℃孵育40 min，85℃孵育5 min以失活TRuE script H-R Tase，放入4℃冰箱待擴(kuò)增；建立以下擴(kuò)增反應(yīng)體系：2 SYBR qPCR Mix 12.5 μL、DNA Template 1 μL、Forward Primer（10 μmol/L）0.5 μL、Reverse Primer（10 μmol/L）0.5 μL，用 RNase free water定容到 25 μL；設(shè)置PCR 循環(huán)條件：94℃、3 min→94℃、10 s→60℃、34 s，共40個(gè)循環(huán)，以DEPC無(wú)菌水代替cDNA模板作為陰性對(duì)照，每樣品 3個(gè)復(fù)孔，在每個(gè)循環(huán)延伸階段收集熒光信號(hào)，分析融解曲線；制備1.5%的瓊脂糖凝膠（含EB 1 g/L），取擴(kuò)增后樣品5 μL加入 1 μL的 6×Loading buffer混勻，然后加入點(diǎn)樣孔，設(shè)定電泳條件為180 v，10 min開(kāi)始電泳，電泳結(jié)束后在紫外透射模式下觀察RNA電泳結(jié)果并拍照。熒光定量PCR結(jié)果首先分析溶解曲線，各樣本的峰值基本一致，無(wú)雜峰信號(hào)，表示產(chǎn)物特異度高，以β-actin為內(nèi)參，通過(guò)計(jì)算倍數(shù)變化2-ΔΔCt值，對(duì)目的基因進(jìn)行相對(duì)定量分析，比較各組差異。PCR引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差（One-way ANOVA）分析，多組間兩兩比較采用Student-Newman-Keuls（SNK）-q 檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 助陽(yáng)開(kāi)郁方對(duì)抑郁癥大鼠海馬組織cAMP含量的影響

與正常組比較，模型組海馬cAMP含量顯著減低（P＜0.05）；與模型組比較，助陽(yáng)開(kāi)郁方高劑量組、氟西汀組海馬cAMP含量顯著增加（P＜0.05），助陽(yáng)開(kāi)郁方中劑量組和低劑量組海馬cAMP含量也呈下降趨勢(shì)且呈量效關(guān)系，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；助陽(yáng)開(kāi)郁方高劑量組海馬cAMP含量與氟西汀組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見(jiàn)表見(jiàn)2。

表2 助陽(yáng)開(kāi)郁方對(duì)抑郁癥大鼠海馬組織cAMP含量的影響 （±s）

表2 助陽(yáng)開(kāi)郁方對(duì)抑郁癥大鼠海馬組織cAMP含量的影響 （±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01

助陽(yáng)開(kāi)郁方組 6氟西汀組 6 11.7 2.65±1.26 23.4 5.52±1.42 46.8 6.46±2.862）3.33×10-3 6.79±3.372）F 7.26 P＜0.01

2.2 助陽(yáng)開(kāi)郁方對(duì)抑郁癥大鼠海馬組織CREB mRNA、BDNF mRNA表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組滑膜組織中CREB、BDNF mRNA 表達(dá)明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，助陽(yáng)開(kāi)郁方高劑量組和氟西汀組大鼠海馬組織CREB、BDNF mRNA表達(dá)明顯增高（P＜0.05）；與氟西汀組比較，助陽(yáng)開(kāi)郁方高劑量組CREB、BDNF mRNA表達(dá)較低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見(jiàn)表 3、圖1。

表3 助陽(yáng)開(kāi)郁方對(duì)抑郁癥大鼠海馬組織BDNF、CREB mRNA表達(dá)的影響 （±s）

表3 助陽(yáng)開(kāi)郁方對(duì)抑郁癥大鼠海馬組織BDNF、CREB mRNA表達(dá)的影響 （±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01；與模型組比較，3）P＜0.05

組別 n 給藥劑量（g/kg） CREB mRNA BDNF mRNA正常組 6 - 12.57±1.16 15.42±3.29模型組 6 - 6.03±1.462） 8.50±3.571）助陽(yáng)開(kāi)郁方組 6氟西汀組 6 11.7 7.99±2.03 10.52±3.32 23.4 9.18±2.74 11.27±6.60 46.8 10.96±3.023） 13.81±3.803）3.33×10-3 11.67±2.853） 14.72±2.633）F 6.76 2.64 P＜0.01 ＜0.05

圖1 助陽(yáng)開(kāi)郁方對(duì)抑郁癥大鼠海馬組織CREB、BDNF mRNA表達(dá)的影響

3 討論

抑郁癥是一種以心境低落為主要特征的綜合征［5］，有關(guān)抑郁癥的發(fā)病機(jī)理至今尚未闡明，隨著醫(yī)學(xué)研究的不斷深入，目前認(rèn)為長(zhǎng)期慢性應(yīng)激是促發(fā)抑郁的重要因素［6］，大腦海馬區(qū)是神經(jīng)發(fā)生的主要結(jié)構(gòu)，負(fù)責(zé)學(xué)習(xí)和記憶，慢性應(yīng)激是引起海馬結(jié)構(gòu)損害和功能變化的重要因素［7］，海馬神經(jīng)突觸結(jié)構(gòu)損傷和神經(jīng)元再生障礙等神經(jīng)可塑性的改變可能是抑郁癥發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一［8］。

BDNF作為一種具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用的蛋白質(zhì)，在神經(jīng)元生存、生長(zhǎng)以及突觸的形成等方面起到了重要的作用，具備調(diào)控神經(jīng)可塑性效應(yīng)，主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其中以海馬和皮質(zhì)中含量最高，BDNF的異常表達(dá)在抑郁癥發(fā)病中的作用已獲得廣泛關(guān)注，而B(niǎo)DNF表達(dá)的增加有利于神經(jīng)元的生存和形成，改善海馬神經(jīng)突觸可塑性，這一機(jī)制被認(rèn)為是各種抗抑郁劑治療的共同作用途徑［9］。BDNF調(diào)控海馬神經(jīng)元可塑性胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制為：AC將三磷酸腺苷轉(zhuǎn)化為cAMP，cAMP激活蛋白激酶，并將CREB磷酸化，CREB-CRE結(jié)合，BDNF的啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)含CRE序列，受到CREB的調(diào)控，CREB磷酸化可增加體內(nèi)BDNF的表達(dá)，BDNF與其受體TrkB結(jié)合后使細(xì)胞中的突觸囊空泡素（SYN）、突觸素Ⅰ、抗凋亡因子（BCL-2）及鈣結(jié)合蛋白表達(dá)上升，SYNA和突觸素Ⅰ可增強(qiáng)海馬神經(jīng)突觸成熟及可塑性，BCL-2可降低海馬神經(jīng)元萎縮和凋亡［13］。長(zhǎng)期的抗抑郁治療可以上調(diào)cAMP-CERB通路［10］，然后進(jìn)一步介導(dǎo)BDNF的功能增強(qiáng)［14］，通過(guò)給予cAMP降解酶磷酸二酯酶抑制劑2 w，可以使cAMP水平增加，調(diào)節(jié)cAMPCERB功能，增加海馬組織磷酸化CERB（p-CERB）水平及BDNF的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)元發(fā)生，此類藥物抗抑郁作用已經(jīng)得到廣泛的證實(shí)［12］。

抑郁癥主要表現(xiàn)為情緒低落、思維遲緩、主動(dòng)性下降等，中醫(yī)辨證機(jī)體陽(yáng)氣不足或陽(yáng)氣郁結(jié)，素體陽(yáng)虛，或心、肝、脾、腎諸臟陽(yáng)虛，陽(yáng)虛升之不及，抑郁由此而生，溫陽(yáng)法治療抑郁癥切合抑郁癥之病機(jī)，助陽(yáng)開(kāi)郁方可溫腎暖脾，助陽(yáng)舒肝，在治療抑郁癥方面有良效。本研究在前期研究成果的基礎(chǔ)上進(jìn)一步觀察了助陽(yáng)開(kāi)郁方對(duì)抑郁癥大鼠海馬BDNF及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)重要通路cAMP-CREB-BDNF通路的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CUMS大鼠海馬BDNF、CREB表達(dá)及cAMP含量顯著降低，中、高劑量助陽(yáng)開(kāi)郁方干預(yù)可顯著上調(diào)大鼠海馬組織BDNF、CREB mRNA表達(dá)水平，同時(shí)增高大鼠海馬組織cAMP含量，表明助陽(yáng)開(kāi)郁方調(diào)節(jié)海馬組織BDNF的表達(dá)及其cAMP-CREB-BDNF通路中信號(hào)分子的異常表達(dá)，這可能是改善抑郁大鼠的抑郁行為的重要機(jī)制之一。

抑郁癥的發(fā)生與社會(huì)、心理、遺傳等因素密切相關(guān)，病理生理變化多樣而復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制涉及神經(jīng)內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)等功能失調(diào)，但由于抑郁癥發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，而中藥復(fù)方往往可從多環(huán)節(jié)、多層次、多靶點(diǎn)調(diào)節(jié)，因此對(duì)于抗抑郁中藥方劑的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步深入探索。