王志剛，汪 珊

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州510405）

前列腺癌作為泌尿外科常見(jiàn)的惡性腫瘤疾病，近年來(lái)在我國(guó)的發(fā)病率逐年上升，且大多數(shù)患者確診前列腺癌時(shí)往往已錯(cuò)過(guò)手術(shù)治療的最佳時(shí)機(jī)。根據(jù)腫瘤分期，往往采用以藥物去勢(shì)作為主要手段的內(nèi)分泌治療方法。但隨著治療的不斷深入，很多患者發(fā)展為去勢(shì)抵抗性前列腺癌（CRPC）。目前CRPC治療在國(guó)內(nèi)外均沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)和方案，而中醫(yī)藥的優(yōu)勢(shì)日漸凸顯。

PC3細(xì)胞是從人前列腺癌骨轉(zhuǎn)移腫瘤中分離出來(lái)的，被廣泛用于雄激素抵抗型的前列腺癌的研究。目前我們對(duì)晚期前列腺癌和雄激素非依賴階段的前列腺癌相關(guān)的發(fā)病機(jī)制知之甚少，尚無(wú)有效的治療方法，相關(guān)研究仍然處于摸索階段［1］，PC3細(xì)胞也是目前常用的前列腺癌細(xì)胞之一。

消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑是我院的經(jīng)驗(yàn)方，在前列腺癌的臨床治療中應(yīng)用廣泛。本研究以人前列腺癌裸鼠移植瘤模型為對(duì)象，通過(guò)對(duì)裸鼠皮下注射體外培養(yǎng)的人前列腺癌PC3細(xì)胞懸液進(jìn)行接種造模，成功建立人前列腺癌移植瘤模型，從裸鼠體質(zhì)量、攝食量變化、腫瘤體積、抑瘤率等方面系統(tǒng)觀察不同劑量下消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑對(duì)人前列腺癌裸鼠皮下移植瘤的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 PF級(jí)BALB/C（nu/nu）裸鼠59只（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)藥SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室），4 w 齡，16～20 g，雄性。合格證號(hào)：粵監(jiān)證字2008C067號(hào)。

1.1.2 儀器與試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、青鏈霉素混合液（雙抗）、二甲基亞砜（DMSO）（美國(guó)Gibco公司）；PBS磷酸鹽緩沖液、臺(tái)盼藍(lán)溶液（Hyclone）；胎牛血清（FBS）（杭州四季青公司）；Trizol Reagent（Invitrogen Life Technologies）；三氯甲烷、異丙醇、無(wú)水乙醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；β-actin單克隆抗體（Abcam公司批號(hào)Ab8227）；PTEN鼠單克隆抗體（Abcam公司 批號(hào) Ab79156）；HRP標(biāo)記的山羊抗鼠二抗（CST公司批號(hào) #7076）；RIPA裂解液、蛋白上樣緩沖液、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（博士德）；PMSF、Tris、甘氨酸、SDS（Sigma）；-80℃低溫冰箱（SANYO）；超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；電熱恒溫水溫箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；一次性細(xì)胞塑料培養(yǎng)瓶、一次性移液管、凍存管、離心管（Corning）等。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)藥物 消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑由山慈菇30 g，夏枯草 30 g，莪術(shù) 30 g，虎杖 30 g，吳茱萸 15 g組成（相當(dāng)于中劑量組0.87 g/mL），購(gòu)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房。將中藥用蒸餾水煎煮濃縮后制成高、中、低3個(gè)濃度水煎劑，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將59只荷瘤裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組，消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑低、中、高劑量組4組。人前列腺癌PC-3細(xì)胞培養(yǎng)完成后保存細(xì)胞懸液，對(duì)裸鼠進(jìn)行細(xì)胞接種，在非麻醉狀態(tài)下，腹臥位固定裸鼠，用75%酒精棉球?qū)π∈笥叶髠?cè)及頸背部皮膚進(jìn)行消毒處理，后用鑷子提起裸鼠頸部皮膚，用注射器注入PC3細(xì)胞懸液0.2 mL，并用鑷子輕輕夾住針刺部位數(shù)秒鐘后再次對(duì)注射部位消毒即完成。前列腺癌裸鼠模型完成后，于細(xì)胞接種后第10天開(kāi)始灌腸，灌腸前對(duì)各組裸鼠禁食6 h。消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑按照人和小鼠間等效劑量比率換算小鼠的等效劑量，按照低劑量組0.44 g/mL、中劑量組0.87 g/mL、高劑量組1.74 g/mL進(jìn)行給藥，對(duì)照組給予等劑量生理鹽水，灌腸劑量按照每只0.02 g/mL，隔天1次，共30 d。

1.3 觀察指標(biāo)

①觀察體外培養(yǎng)的人前列腺癌PC3細(xì)胞株增長(zhǎng)狀態(tài)。②觀察各組裸鼠細(xì)胞接種后精神活動(dòng)狀態(tài)，進(jìn)食進(jìn)水情況，接種部位變化，體質(zhì)量外形變化。③觀察消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑對(duì)裸鼠前列腺癌移植瘤的抑瘤作用，包括抑瘤率和腫瘤體積變化。

于治療當(dāng)日和治療開(kāi)始后每5 d用游標(biāo)卡尺測(cè)量1次皮下移植瘤的長(zhǎng)徑a和短徑b，觀察記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。30 d后，將小鼠脫頸處死，取腫瘤瘤體，計(jì)算腫瘤體積（V）和腫瘤生長(zhǎng)抑制率（Y）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件系統(tǒng)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組樣本采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

圖1 裸鼠腫瘤外觀

細(xì)胞接種后，裸鼠右側(cè)頸背部見(jiàn)大約0.5 cm×0.5 cm的皮丘，無(wú)破潰，無(wú)滲出。小鼠在實(shí)驗(yàn)初期在精神和形態(tài)方面均與正常小鼠無(wú)異且攝食正常，約5～7 d于原腫瘤細(xì)胞接種部位出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)粒狀突起物，隨后腫物快速增長(zhǎng)，約10 d左右小鼠腫瘤體積均可達(dá)10 mm3以上，成瘤率100%（圖1）。隨著腫瘤體積變大，小鼠逐漸出現(xiàn)精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，攝食進(jìn)水量減少，行動(dòng)緩慢。4 w時(shí)，上述表現(xiàn)越發(fā)明顯，少數(shù)裸鼠體質(zhì)量開(kāi)始減輕，呈惡病質(zhì)表現(xiàn)。

2.2 消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑對(duì)裸鼠前列腺癌移植瘤的抑瘤作用

2.2.1 裸鼠30 d攝食和體質(zhì)量變化 用藥前消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑各劑量組與對(duì)照組體質(zhì)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。給藥完成后，消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑各劑量組與對(duì)照組裸鼠體質(zhì)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)表 1。

表1 兩組裸鼠灌腸前后體質(zhì)量變化 （±s）

表1 兩組裸鼠灌腸前后體質(zhì)量變化 （±s）

注：與對(duì)照組比較，P＜0.05，P＜0.01

組別 n 灌腸前(g) 灌腸后(g)對(duì)照組 15 19.49±1.16 17.67±.37消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑低劑量組 14 20.09±1.33 18.83±1.381）消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑中劑量組 15 20.31±1.24 23.58±2.372）消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑高劑量組 15 19.98±1.22 24.69±2.642）1）2）

2.2.2 荷瘤裸鼠腫瘤體積的變化 給藥前4組小鼠腫瘤體積大小比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），治療結(jié)束后，消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑中劑量組、高劑量組與對(duì)照組腫瘤體積比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑低劑量組腫瘤體積與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑低、中、高劑量組對(duì)腫瘤體積的抑制率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，可見(jiàn)不同劑量灌腸對(duì)荷瘤小鼠腫瘤抑制作用有一定的量效關(guān)系。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同劑量裸鼠腫瘤體積、抑瘤率比較 （±s）

表2 不同劑量裸鼠腫瘤體積、抑瘤率比較 （±s）

注：與對(duì)照組比較，1）P＜0.05

組別 腫瘤體積（cm3） 抑制率（%）治療前 治療后對(duì)照組 0.11±0.05 1.29±0.27 -消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑低劑量組 0.12±0.06 1.21±0.37 6.20消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑中劑量組 0.09±0.04 1.01±0.411） 21.71消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑高劑量組 0.10±0.05 0.99±0.381） 23.26

2.2.3 荷瘤小鼠30 d攝食量變化 各組荷瘤小鼠攝食量在接種4 w后，對(duì)照組裸鼠平均體質(zhì)量逐漸下降，消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑各劑量組裸鼠平均體質(zhì)量總體仍呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑低、中、高劑量組平均攝食量高于對(duì)照組，可見(jiàn)灌腸給藥在一定程度上提高了小鼠的生存質(zhì)量。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同劑量組荷瘤小鼠進(jìn)食量變化 （g）

3 討論

消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑作為中藥復(fù)方制劑，在我院臨床已經(jīng)廣泛使用，是嚴(yán)格遵守中醫(yī)辨證理論，同時(shí)建立在臨床研究和藥理實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間臨床觀察驗(yàn)證的一組自擬經(jīng)驗(yàn)方，由山慈菇、夏枯草、莪術(shù)、虎杖、吳茱萸5味藥物組成，是我院前列腺癌治療中常用的經(jīng)典方。諸藥合用清熱散結(jié)，其組成符合前列腺癌氣血凝滯、痰濁結(jié)聚、邪毒壅積的病理基礎(chǔ)。君藥山慈菇清熱解毒、消癰散結(jié)，山慈菇多糖具有一定的抗腫瘤作用，其作用機(jī)制可能與免疫調(diào)節(jié)及相關(guān)蛋白表達(dá)存在一定的關(guān)聯(lián)［2］。臣藥夏枯草清火明目、散結(jié)消腫，其主要活性化學(xué)成分是三萜類、黃酮類、甾體類、香豆素類等，具有抗菌消炎、抗腫瘤、抗病毒、提高免疫力等藥理作用。莪術(shù)、虎杖行氣破血，消積止痛，莪術(shù)的藥用發(fā)現(xiàn)始載于《唐本草》，研究表明莪術(shù)油中主要的抗腫瘤活性單體成分是β-欖香烯，不僅對(duì)非瘤性的白血病細(xì)胞具有抑制其增殖，誘導(dǎo)其凋亡的作用，也可以使眾多的實(shí)體瘤細(xì)胞的凋亡率明顯提高，增殖率明顯下降［3］。呋喃二烯對(duì)10種人腫瘤細(xì)胞的體外增殖有抑制作用［4］，且抑制率隨藥物劑量的增加而增加，有顯著的劑量依賴性和較強(qiáng)的細(xì)胞毒性?；⒄戎泻械陌邹继J醇的多種藥理作用中最引人注目的是抗腫瘤作用，其抗腫瘤作用表現(xiàn)為對(duì)腫瘤的起始、促進(jìn)和發(fā)展3個(gè)階段均有抑制作用。白藜蘆醇可通過(guò)多種機(jī)制對(duì)多種腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生不同程度的拮抗作用［5］。吳茱萸溫中開(kāi)郁行氣，吳茱萸堿可對(duì)多種腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，具有抗腫瘤活性，如前列腺癌PC3細(xì)胞，相關(guān)機(jī)制可能與吳茱萸堿抑制腫瘤細(xì)胞增殖，阻斷細(xì)胞周期，通過(guò)Caspase 依賴途徑誘導(dǎo)凋亡有關(guān)［6］。

消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑在臨床中療效得到了認(rèn)可。有臨床觀察發(fā)現(xiàn)在最大限度雄激素阻斷治療（MAB）同時(shí)予以消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑灌腸2個(gè)月后，比單純MAB治療可明顯降低前列腺癌患者血清PSA，改善尿流率，一定程度上抑制或延緩腫瘤的轉(zhuǎn)移［7］。中藥復(fù)方配比、制作過(guò)程及流程相對(duì)簡(jiǎn)單，故用中藥灌腸治療疾病較為普遍，中藥制劑和化療藥物聯(lián)合灌腸在提高免疫功能以及對(duì)直腸癌局部癥狀的緩解上具有協(xié)同性，通過(guò)適當(dāng)直腸給藥，可避免肝臟首過(guò)效應(yīng)，直腸吸收比口服吸收慢，可以延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間，可起到局部和/或全身作用［8］。本實(shí)驗(yàn)用低、中、高劑量的消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑對(duì)腫瘤細(xì)胞株P(guān)C3接種成功的BALB/C（nu/nu）裸鼠進(jìn)行灌腸后，中、高劑量組裸鼠腫瘤體積與對(duì)照組比較明顯減小（P＜0.05），低劑量組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；低、中、高劑量組抑瘤率分別為6.20%、21.71%、23.26%，可見(jiàn)消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑可以抑制人前列腺癌裸鼠移植瘤的增長(zhǎng)，抑瘤率與藥物濃度成正比，高、中劑量組的抑瘤率比較接近，兩組荷瘤裸鼠攝食量也有所增加；給藥后低、中、高劑量組體質(zhì)量與對(duì)照組比較均出現(xiàn)緩慢增長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），說(shuō)明荷瘤小鼠的生存質(zhì)量得到改善。綜上分析，消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑可以提高荷瘤裸鼠的生存質(zhì)量，抑瘤率與藥物濃度成正相關(guān)。荷瘤裸鼠體質(zhì)量和攝食量變化同樣受到藥物劑量影響。

消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑是我院臨床使用較為成熟的經(jīng)驗(yàn)方之一，本次研究的體外移植瘤裸鼠模型并不能全面反映藥物在人體內(nèi)的抑瘤作用，實(shí)驗(yàn)對(duì)4個(gè)分組裸鼠的體質(zhì)量變化、攝食改變、抑瘤率和腫瘤體積進(jìn)行了比較研究，具有一定局限性。

實(shí)驗(yàn)中我們用輸尿管導(dǎo)管制作的灌腸器操作簡(jiǎn)便安全，并能根據(jù)裸鼠大小調(diào)整型號(hào)，有效防止了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的意外受傷和死亡，盡可能保證了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。低、中、高3個(gè)劑量組設(shè)計(jì)參考了臨床用藥劑量，豐富了不同劑量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，為臨床用藥提供了一定參考，其對(duì)前列腺癌的抑制作用機(jī)制將在下一步研究中繼續(xù)完善。