高蕾蕾,李迎秋

(齊魯工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 濟南 250353)

大豆多肽屬于生物活性肽,是以大豆蛋白為主要原料,經(jīng)過提取分離、純化并精制而成的低聚肽的混合物(蛋白質(zhì)水解物),通常以由3～6個氨基酸組成的小分子肽為主,還含有少量游離氨基酸、糖類、水分和無機鹽等。大豆多肽具有較高的營養(yǎng)價值,其氨基酸組成與大豆蛋白完全一樣[1],是一種理想的新型大豆深加工產(chǎn)品。

1 大豆多肽的制備

大豆多肽的制備方法:一是利用各種分離提取技術(shù)提取生物體中存在的天然活性肽;二是用化學(xué)或酶解的方法將大豆蛋白水解成小分子肽,其工藝關(guān)鍵是控制大豆蛋白水解過程并盡量減少游離氨基酸的生成[2]。

1.1 酶水解法

酶水解法是目前工業(yè)化生產(chǎn)大豆多肽的主要方法,其中蛋白酶的選擇是制備大豆多肽的關(guān)鍵。常用的酶主要分為動物蛋白酶、植物蛋白酶和微生物蛋白酶,目前應(yīng)用較廣的主要是枯草桿菌1389、放線菌166、棲土曲霉3942、黑曲霉3350和地衣型芽孢桿菌2709等微生物蛋白酶[3]。

1.2 發(fā)酵法

用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)大豆多肽,主要是利用發(fā)酵菌株的產(chǎn)酶和酶解能力。通常是以大豆蛋白為底物,以能在生長代謝過程中分泌大量胞外蛋白酶的菌株為發(fā)酵菌株,水解大豆蛋白,便可得到相應(yīng)功能的大豆多肽。

1.2.1 固態(tài)發(fā)酵法

固態(tài)發(fā)酵法是一種或多種微生物在固態(tài)基質(zhì)上發(fā)酵的方法。其優(yōu)點是能耗低、絲狀真菌在固態(tài)發(fā)酵過程中不易受到細(xì)菌污染、成本低、操作簡便等,主要應(yīng)用在釀酒曲、醬油曲、豆腐乳和豆豉等的生產(chǎn)中。高曉梅等[4]以豆粕粉為原料、大豆多肽轉(zhuǎn)化率為指標(biāo),對固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)條件進行優(yōu)化,提高了大豆多肽的含量,表明固態(tài)發(fā)酵法可制備大豆多肽,并具有較好前景。

1.2.2 液態(tài)發(fā)酵法

液態(tài)發(fā)酵法是一種或多種微生物在液態(tài)基質(zhì)上發(fā)酵的方法。余勃等[5]以豆粕為原料,利用發(fā)酵菌株枯草芽孢桿菌(Bacillus. subtilis SHZ3)分泌的蛋白酶和羧肽酶水解大豆蛋白的方式制備具有生物活性的大豆多肽。與用純酶制劑制備大豆多肽相比,用發(fā)酵法制備大豆多肽具有明顯優(yōu)勢,可以很好地解決目前大豆多肽生產(chǎn)中成本居高不下、所得產(chǎn)品苦味難除等問題。

2 大豆多肽的純化

由于水解物中含有多種成分,很難用一種方法將其中所需的多肽分離出來,因此,要想獲得具有生物活性和較高純度的多肽,可以采用多種純化手段分離純化目標(biāo)肽。

2.1 膜分離法

2.1.1 超濾技術(shù)

超濾技術(shù)是利用超濾膜的選擇性對溶液中不同大小的分子進行分離。利用超濾技術(shù)實現(xiàn)大豆多肽的分離純化,不但可以提高大豆多肽的品質(zhì)、節(jié)約試劑,而且能夠?qū)崿F(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)。良好的操作條件和合適的膜材料是大豆多肽分離純化的關(guān)鍵。

田少君等[6]利用超濾技術(shù)分離純化大豆分離蛋白酶解液,優(yōu)化超濾條件并確定各超濾級分清除自由基的能力,結(jié)果表明以相對分子量小于3 kDa的短肽為主的大豆蛋白酶解液具有較高的自由基清除率。黃文凱等[7]利用超濾技術(shù)處理大豆肽,比較處理前后小鼠體外免疫功能的變化情況,結(jié)果表明大豆肽本身具有免疫增強作用,但經(jīng)過超濾處理的大豆肽能顯著提高小鼠的免疫能力。Rao等[8]研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)過超濾膜處理的大豆多肽,其功能特性與大豆粉沒有顯著區(qū)別,卻具有獨特的香氣。

2.1.2 納濾技術(shù)

納濾技術(shù)是一種介于反滲透和超濾之間的膜分離技術(shù)。它不但可以截留溶質(zhì),濃縮脫鹽,提高分離效率,而且能夠保持生物活性,降低污染,提高產(chǎn)品質(zhì)量,因此被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)。Martin-Orue等[9]探究了納濾膜在復(fù)雜溶液中對肽和帶電氨基酸納濾的作用機制,結(jié)果表明,在一定pH和離子強度下,膜和溶質(zhì)的特性及其相互作用是主要影響因素。Butylina等[10]使用超濾分離和納濾技術(shù)純化乳清蛋白,得到乳清衍生肽,表明這類肽的分離可以采用雜交膜方式。李猷等[11]利用超濾和納濾裝置對魚蛋白水解液進行除雜濃縮,得到魚多肽產(chǎn)品,結(jié)果表明新工藝能降低能耗且無污水排放,得到的多肽產(chǎn)品純度提高了9.0%。

2.1.3 微濾技術(shù)

微濾膜是一種高分子材料,可將液體中所有大于膜孔徑的微粒截留,其孔徑均勻,流速快,可得到高純度的濾液。李丹等[12]采用微濾膜對棉籽蛋白酶解液進行除雜,結(jié)果表明膜孔徑為100 nm的微濾膜更適合純化得到棉籽蛋白多肽。楊萬根等[13]在對豬血紅蛋白水解液除雜濃縮時發(fā)現(xiàn),利用0.2 μm的微濾膜和截留量為3.5 kDa的超濾膜可獲得富含多肽和血紅素的濃縮物。

膜技術(shù)作為大豆多肽分離的新型技術(shù),在生產(chǎn)應(yīng)用中往往與其他技術(shù)協(xié)同作用,以弱化膜污染帶來的問題,最大限度地提高分離純化的效率。膜技術(shù)在食品工業(yè)中的應(yīng)用將會越來越廣泛。

2.2 色譜分離法

色譜分離法是根據(jù)待分離物質(zhì)與固定相和流動相之間作用力的差別,當(dāng)流動相中的待分離物質(zhì)與固定相發(fā)生作用時,在一定推力作用下,不同組分在固定相中因滯留時間不同而依次流出,從而達到分離純化的目的。

2.2.1 反相高效液相色譜法

高效液相色譜法是以液體為流動相,采用高壓系統(tǒng),將待分離的物質(zhì)泵入固定相中實現(xiàn)樣品的分離純化。反相高效液相色譜法已成為肽類研究的主要分離方法。孫冰玉等[14]利用反相高效液相色譜法檢測大豆多肽中的β-CM-3 并確定其含量。盧鶴等[15]研究了三氯乙酸和梯度洗脫對大豆多肽分離的影響,建立了反相高效液相色譜法的分離分析方法。Krusa等[16]用反相高效液相色譜法對大豆蛋白進行了純化和定量分析。

2.2.2 凝膠過濾色譜法

凝膠過濾色譜法遵循分子篩的原理,按照各組分分子量大小進行分離,相對分子量大的不能進入孔內(nèi),很快被洗脫,相對分子量小的進入孔內(nèi),移動的路程長,后被洗脫。凝膠過濾色譜法因設(shè)備簡單,分離條件溫和,操作方便,易保持生物活性而被廣泛應(yīng)用于各種物質(zhì)的分離純化。

馬利華等[17]利用SephadexG-15凝膠過濾層析純化不同菌種制備大豆多肽,并對純化后的不同分子量組分進行抗氧化能力研究。Kim等[18]選用凝膠過濾色譜SephadexG-50 分離大豆蛋白。周媛媛等[19]將相對分子質(zhì)量小于6000的大豆多肽用葡聚糖凝膠SephadexLH-20進行分離純化,研究表明抗氧化性最好的組分a和b的相對分子質(zhì)量分別為630和310。

2.2.3 離子交換色譜法

離子交換色譜法主要是利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)測定溶液中的陽離子和陰離子,從而達到分離純化的目的。Wu等[20]利用離子交換色譜法分離三種蛋白酶,并探討其分離提取條件,為分離此類物質(zhì)提供了依據(jù)。張曉梅等[21]利用離子交換色譜SP-SephadexC-25 分離具有降血壓作用的大豆肽。

2.2.4 毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳法是以毛細(xì)管為分離通道,以高壓電場為驅(qū)動力,根據(jù)各樣品組分之間分配系數(shù)的不同實現(xiàn)分離純化的技術(shù)。因其具有分離速度快、效果好等優(yōu)點,成為大豆多肽分離純化的有效方法。劉靜等[22]利用毛細(xì)管法對水解大豆多肽的分子量進行測定,結(jié)果表明水解肽的分子量主要集中在8200 Da以下。Issaq等[23]利用該方法研究分離了5個九肽,分離快速、準(zhǔn)確。

3 大豆多肽的精制

3.1 脫色

大豆多肽呈棕黃色或褐色,添加到食品中,其色澤不易被人們接受。粉末活性炭有脫色作用,其成本低、效率高,但再生困難,產(chǎn)物損失率高,因此在實驗中常?；旌鲜褂枚喾N吸附劑。吳逸民等[24]利用數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析的方法研究了復(fù)合吸附劑(硅藻土、活性炭等)對大豆多肽脫色的效果,結(jié)果表明在多肽溶液濃度200 g/L、吸附劑用量15%、吸附溫度80 ℃、吸附時間5～10 min時,大豆多肽的脫色效果顯著。

3.2 脫苦

大豆多肽在酶解過程中會產(chǎn)生苦味,影響其進一步應(yīng)用。周利亙等[25]對大豆多肽苦味的形成機理及其脫苦技術(shù)進行了綜述,研究表明:多肽的苦味是由疏水性氨基酸引起并與其氨基酸的結(jié)構(gòu)組成有重要關(guān)系;在大豆多肽脫苦技術(shù)中,酶法和微生物脫苦技術(shù)具有廣泛的應(yīng)用前景。吳逸民等也就復(fù)合吸附劑對大豆多肽的脫苦處理進行了研究。

4 大豆多肽的生理特性

4.1 降血壓,降血脂,降膽固醇

大豆多肽具有降血壓的作用。血漿中的血管緊張素原被腎素水解成血管緊張素Ι,在血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)作用下,繼續(xù)水解產(chǎn)生血管緊張素Ⅱ,促使血管強烈收縮,血壓上升。大豆多肽可抑制ACE的活性,降低血壓。Skin等[26]發(fā)現(xiàn)注射5 mg/kg大豆多肽的強活性片段可顯著降低心臟收縮壓,這也表明大豆多肽具有降低血壓的作用。

大豆多肽具有降低血清膽固醇的作用。大豆多肽可刺激體內(nèi)甲狀腺激素的分泌,促進膽固醇的膽汁酸化,阻礙腸道內(nèi)膽固醇的再吸收,從而促使膽固醇排出體外。劉憶梅等[27]運用統(tǒng)計分析技術(shù)對大豆多肽的功能進行研究,結(jié)果表明大豆多肽可顯著提升高密度脂蛋白膽固醇的含量而降低低密度脂蛋白膽固醇的含量,說明大豆多肽具有降低血清膽固醇的作用。

4.2 調(diào)節(jié)血糖濃度,抗疲勞

大豆多肽具有調(diào)節(jié)血糖濃度的作用。陳曉光等[28]研究發(fā)現(xiàn),大豆多肽對α-葡萄糖苷酶有緩慢抑制作用,其中α-葡萄糖苷酶可將非還原糖分解成葡萄糖,因此大豆多肽可不受胰島素分泌量的影響而抑制血糖急速上升,以維持平衡狀態(tài)。

大豆多肽具有抗疲勞的作用。王啟榮等[29]研究大豆多肽固體飲料對耐力項目運動員恢復(fù)的促進作用,結(jié)果表明大豆多肽可促使運動員增加瘦體重、提高血清睪酮水平、降低訓(xùn)練后RPE的等級,說明大豆多肽具有一定的抗疲勞作用。 Sharma等[30]也進行了相關(guān)研究。

4.3 促進脂肪代謝和礦物質(zhì)吸收

大豆多肽具有促進脂肪代謝的作用。大豆多肽可活化交感神經(jīng),激活發(fā)熱臟器褐色脂肪功能,阻止脂肪吸收,促進脂肪代謝,減少人體的脂肪[31]。Ishihara等[32]研究發(fā)現(xiàn)在給小鼠灌胃含有5%大豆多肽的水溶液時,小鼠附睪脂肪墊和周圍脂肪的重量明顯減少。

大豆多肽具有促進礦物質(zhì)吸收的作用。大豆多肽可與鈣、鋅、銅等離子形成螯合物,保持其可溶狀態(tài),利于機體吸收。張智等[33]研究發(fā)現(xiàn)大豆多肽可與鈣等微量元素有效結(jié)合,形成絡(luò)合物,促進鈣吸收。

4.4 抗氧化,抗癌

大豆多肽具有抗氧化的作用。肽類化合物廣泛存在于自然界中,其中一些天然肽具有抗氧化作用。Fei等[34]研究發(fā)現(xiàn)蛋白酶水解大豆蛋白得到的大豆多肽具有抑制亞油酸自動氧化和清除自由基的作用。榮建華[35]系統(tǒng)研究了大豆多肽的抗氧化作用,結(jié)果表明大豆多肽對脂質(zhì)體系、非脂質(zhì)體系、酶系統(tǒng)、非酶系統(tǒng)、體外試驗均有顯著的抗氧化作用。

大豆多肽具有抗癌的作用。Hellerstein[36]從大豆中定性了一個抗有絲分裂肽,其對抑制腫瘤具有重大意義。小鼠口服不同劑量的大豆多肽,可增強其單核-巨噬細(xì)胞的碳廓清功能和半數(shù)溶血值,表明大豆多肽具有調(diào)節(jié)免疫力的作用[37]。

4.5 低過敏性

過敏反應(yīng)是因過敏源的存在而導(dǎo)致的免疫球蛋白傳遞的特異性反應(yīng),是一種非正常的病理性免疫應(yīng)答。大豆蛋白具有抗原性,往往會導(dǎo)致過敏反應(yīng)。與大豆蛋白相比,大豆多肽具有較低的抗原性,能減弱過敏反應(yīng)的程度,為機體補充氮源[38]。大豆多肽的低抗原性可以應(yīng)用到易引起過敏反應(yīng)的食品中,尤其是低抗原性的嬰兒食品。

4.6 營養(yǎng)特性

人體攝取的蛋白質(zhì)經(jīng)消化后,常常以多肽的形式被吸收利用,因此大豆多肽可參與游離氨基酸的轉(zhuǎn)運吸收。大豆多肽還能通過血中血蛋白的升高,降低小肽對水與電解質(zhì)的排泄,達到預(yù)防腹瀉的效果。同時大豆多肽還保留了原蛋白質(zhì)的營養(yǎng)特性,能夠消除抑制因子,提高多肽的吸收效率[39]。

大豆多肽作為一種新型大豆深加工產(chǎn)品,不僅具有較高的營養(yǎng)價值,還具有很好的生理功能。隨著社會經(jīng)濟、科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和工藝條件的不斷改善,大豆多肽的質(zhì)量不斷提高,其產(chǎn)品將會成為人們?nèi)粘Ｉ钪械囊环N優(yōu)質(zhì)蛋白營養(yǎng)品，具有較好的發(fā)展前景。

參考文獻：

[1]劉傳富,董海洲,劉曉婷.大豆多肽及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J].糧食與油脂,2002(10):31-32.

[2]劉曉艷,國立東,孟丹,等.大豆豆粕及其多肽制備工藝[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2011 (10): 353.

[3]劉艷秋.大豆多肽生產(chǎn)工藝的優(yōu)化及其生物活性研究[D].長春:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),2004.

[4]高曉梅,李楊, 劉曉輝,等.固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)大豆多肽的初步研究[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué),2014 (7): 78-81.

[5]余勃, 陸兆新.發(fā)酵豆粕生產(chǎn)大豆多肽研究[J].食品科學(xué),2007 (2):189-192.

[6]田少君,焦寶利,毛小平,等.大豆肽的超濾分離及其清除自由基活性研究[J].中國油脂,2015(4): 18-21.

[7]黃文凱,華欲飛,賀大偉,等.超濾處理對大豆肽體外免疫功能的影響[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報, 2007 (5): 31-34.

[8]RAO A, SHALLO H E, ERICSON A P, et al. Characterization of soy protein concentrate produced by membrane ultrafiltration[J].Journal of food science,2002 (4): 1412-1418.

[9]MARTIN-ORUE C, BOUHALLAB S, GAREM A. Nanofiltration of amino acid and peptide solutions: mechanisms of separation[J].Journal of membrane science, 1998 (2): 225-233.

[10]BUTYLINA S, LUQUE S, NYSTROM M. Fractionation of whey-derived peptides using a combination of ultrafiltration and nanofiltration[J].Journal of membrane science, 2006 (1):418-426.

[11]李猷,杜銳,王華國,等.膜技術(shù)在魚多肽生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].食品科技,2007(12):130-132.

[12]李丹,官庭輝,張志翔,等.膜技術(shù)在制備棉籽蛋白多肽中的應(yīng)用研究[J].食品研究與開發(fā),2011 (3):41-43.

[13]楊萬根,馬美湖.微/超濾技術(shù)濃縮豬血紅蛋白水解液[J].食品科學(xué), 2009 (24): 26-29.

[14]孫冰玉,石彥國,胡春林,等.反相高效液相色譜法檢測大豆蛋白外啡肽的研究[J].食品工業(yè)科技,2010 (9):339-342.

[15]盧鶴,鄭永杰.高效液相色譜法分離大豆蛋白肽[J].齊齊哈爾大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2006 (2):1-3.

[16]KRUSA M, TORRE M, MARINA M L. A reversed-phase high-performance liquid chromatographic method for the determination of soya bean proteins in bovine milks[J].Analytical chemistry, 2000 (8): 1814-1818.

[17]馬利華,秦衛(wèi)東,陳學(xué)紅.不同菌種制備大豆多肽的抗氧化活性比較研究[J].食品工業(yè)科技,2011 (10): 201-204.

[18]KIM S E, KIM H H, KIM J Y, et al. Anticancer activity of hydrophobic peptides from soy proteins[J].Biofactors, 2000(1-4): 151-155.

[19]周媛媛,周瑞寶.大豆多肽的分離純化與抗氧化活性研究[J].中國油脂,2008(5):34-36.

[20]WU D, WALTERS R R. Effects of stationary phase ligand density on high-performance ion-exchange chromatography of proteins[J].Journal of chromatography A, 1992 (1): 7-13.

[21]張曉梅.降血壓和降膽固醇大豆肽的分離純化[D].無錫: 江南大學(xué),2006.

[22]劉靜,張光華.蛋白酶聯(lián)合水解大豆蛋白制備小分子肽的研究[J].食品工業(yè),2010 (4):26-29.

[23]ISSAQ H J, JANINI G M, ATAMNA I Z, et al. Capillary electrophoresis separation of small peptides: effect of pH, buffer additives and temperature[J].Journal of liquid chromatography and related technologies, 1992(6-7): 1129-1142.

[24]吳逸民,龔樹立,文劍,等.大豆多肽脫苦脫色工藝在運動飲料研制中的應(yīng)用[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2005(9): 118-121.

[25]周利亙,陳新峰,王君虹,等.大豆多肽苦味機理及脫苦技術(shù)[J].安徽農(nóng)學(xué)通報,2006(10): 49-51.

[26]SKIN Z, HIS-HIS-LEU R Y. An angiotensin Ι converting enzyme ihhibitory peptide derived from kerean soybean paste, exerts antihypertensive activity in vivo[J].Journal of agricultural and food chemistry, 2001, 49: 3004-3009.

[27]劉憶梅, 陳朝暉.大豆蛋白肽降血脂功能性的研究[J].大豆通報, 2004 (3): 22.

[28]陳曉光,金紅梅,胡薇.大豆肽的生理功能及應(yīng)用前景[J].中國食物與營養(yǎng),2000(4):39-40.

[29]王啟榮,李肅反,楊則宜,等.補充大豆多肽對中長跑運動員訓(xùn)練期生化指標(biāo)的影響[J].中國運動醫(yī)學(xué)雜志，2004(1):33-37.

[30]SHARMA A, SINGH S B, PANJWANI U.Effect of a carhohydrate supplement on feeding behaviour and exercise in rats exposed to hypobaric hypoxia[J].Appetite,2002(2):127-135.

[31]高春霞.大豆多肽生理活性、應(yīng)用與前景分析[J].大豆通報,2006 (4):18-22.

[32]ISHIHARA K, MATSUMOTO K, UOHASHI R, et al. Effects of soybean peptide on suppression of body fat accumulation during endurance swimming inmice[J].Reportof the soy protein research committee Japan, 1996, 17:94-97.

[33]張智,趙云財,梁金鐘,等.大豆蛋白活性肽的生理功能及產(chǎn)品開發(fā)[J].大豆通報,2003(2):25-26.

[34]FEI Y J, KANAI Y, NUSSHERGER S, et al. Expression

and cloning of a mammalian protron-coupled oligo-peptide transporter[J].Nature, 1994,368:563-566.

[35]榮建華.大豆多肽及其生物活性的研究[D]. 武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2001.

[36]HELLERSTEIN M H. Antimitotic peptide characterized from soybean: role in protection from cancer[J].Nutrition reviews, 2010(11):359-361.

[37]陳琛.大豆多肽的生物功能研究進展[J].飼料研究,2010 (5): 28-31.

[38]盧亞萍, 馮杰.大豆多肽的性質(zhì)及其研究進展[J].飼料研究, 2005(11): 26-29.

[39]王進波,劉建新.寡肽的吸收機制及其生理作用[J].飼料研究,2000(6):1-4.