謝晶瑩，張 勇，馮若飛

(1.西北民族大學 生物工程與技術(shù)國家民委重點實驗室，甘肅 蘭州 730030；2. 甘肅農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730070；3. 甘肅省動物細胞工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730030)

動物生物反應器是利用轉(zhuǎn)基因活體動物，在其器官或組織中高效表達某種外源蛋白，并進行工業(yè)化生產(chǎn)功能蛋白質(zhì)的技術(shù).根據(jù)目的蛋白表達部位的不同，可分為乳腺、血液、蛋清、尿液、精囊腺、唾液腺等生物反應器[1].由于乳腺有高表達重組蛋白以及翻譯后修飾的能力[2]，乳腺生物反應器是目前國際上惟一證明可以達到商業(yè)化的生物反應器.首例轉(zhuǎn)基因動物是通過將DNA注射到小鼠胚胎中，然后將胚胎植入雌性小鼠子宮產(chǎn)生的[3].但真正的乳腺生物反應器研究則始于1987 年Gordon 等的工作.Gordon 等[4]首次構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺生物反應器，并成功表達提取出組織型纖溶酶原激活劑( tPA).此后一批以轉(zhuǎn)基因動物為核心技術(shù)的生物制藥公司相繼建立，例如荷蘭Genpharm 公司和美國GTC公司.Genpharm 公司用轉(zhuǎn)基因牛生產(chǎn)乳鐵蛋白，而GTC 公司用山羊乳腺生物反應器生產(chǎn)的重組人抗凝血酶Ⅲ( ATryn) ，成為首個在歐洲藥監(jiān)局和美國FDA 相繼獲準上市的生物工程藥物.乳腺生物反應器是一種全新的生產(chǎn)模式.與需要特定培養(yǎng)環(huán)境以及培養(yǎng)基的哺乳動物細胞表達系統(tǒng)相比，其最大的優(yōu)勢在于能夠得到高產(chǎn)量，并且具有天然構(gòu)象的蛋白質(zhì)，而且成本低廉[2].這些優(yōu)點使其在生物醫(yī)藥行業(yè)具有更廣闊的應用前景.本文僅對乳腺生物反應器的原理、優(yōu)勢，在生物制藥領域的應用以及未來的應用前景等方面做一簡要綜述.

1 乳腺生物反應器的原理

乳腺生物反應器(mammary gland bioreactor)是指利用哺乳動物乳腺特異性表達，并通過乳腺的正常分泌作用，以期從轉(zhuǎn)基因動物乳汁中獲取重組蛋白的一種生物反應器[5].乳腺反應器的原理是將編碼活性蛋白的基因?qū)雱游锏氖芫鸦蛟缙谂咛?nèi)，以制備轉(zhuǎn)基因動物，利用雌性動物產(chǎn)仔后乳腺分泌乳汁的特點，利用乳蛋白基因的乳腺特異性調(diào)控元件驅(qū)動外源基因在動物乳腺中的高效表達，從而在乳汁中源源不斷地獲得外源性蛋白[6].

2 乳腺生物反應器的優(yōu)勢

與利用微生物或細胞發(fā)酵生產(chǎn)藥用重組蛋白的傳統(tǒng)技術(shù)相比，轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應器具有不可比擬的優(yōu)勢.①乳腺生產(chǎn)藥用重組蛋白產(chǎn)量高、成本低、易純化.哺乳動物的乳腺是高度分化的腺體，具有超強的蛋白質(zhì)合成能力，尤其是經(jīng)過改良后的動物品系，其乳腺的蛋白質(zhì)合成能力更強.現(xiàn)有研究報道，動物乳腺中表達外源蛋白的含量可高達g/L[7].分離純化是乳腺生物反應器研制成功后，投入規(guī)模化生產(chǎn)的下游關(guān)鍵步驟.由于乳汁中蛋白質(zhì)種類相對較少，因此更易于藥用重組蛋白分離純化，且生產(chǎn)工藝簡單[8].②表達產(chǎn)物可被充分修飾且生物活性穩(wěn)定.哺乳動物乳腺細胞相對于原核生物及酵母具有更完善的翻譯后修飾和加工能力，從而能保證表達產(chǎn)物在生化組成，結(jié)構(gòu)及生物學功能等方面最大限度地接近天然蛋白[9].③ 無環(huán)境污染.乳腺生物反應器在產(chǎn)品的生產(chǎn)和純化過程中沒有毒性物質(zhì)或有害物質(zhì)釋放[10].④轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應器技術(shù)對動物自身的傷害小.哺乳動物的乳腺是個相對封閉的分泌系統(tǒng)，能有效地防止其特異性表達的重組蛋白進入循環(huán)系統(tǒng)，因而對轉(zhuǎn)基因動物健康的傷害很小.⑤乳腺生物反應器的產(chǎn)業(yè)具有巨大市場潛力和巨額利潤.GTC 公司上市的ATryn 預計每年市值7億美元.另據(jù)美國紅十字會分析，人血清白蛋白(HSA) 、人纖維蛋白原( hFIB) 、人蛋白C ( hPC) 、人凝血因子hF-Ⅷ和hF-Ⅸ的市場潛力年估值均在幾億和十幾億美元之間[11].

3 乳腺生物反應器的應用

目前，乳腺生物反應器的主要應用有以下三個方面：第一是生產(chǎn)藥用蛋白；第二是建立轉(zhuǎn)基因動物的生物反應器；第三是提高乳品質(zhì).

3.1 生產(chǎn)藥用蛋白

抗凝血酶Ⅲ (Antithrombin Ⅲ，AT Ⅲ) 是血漿中最重要的一個抗凝血酶因子，在維持血液的凝血與抗凝血平衡中起重要作用.青島森淼實業(yè)有限公司開展了利用嶗山奶山羊乳腺生物反應器制備藥用蛋白的研究工作，建立了乳腺生物反應器的開發(fā)平臺，其中利用乳腺生物反應器生產(chǎn)rhAT Ⅲ已經(jīng)達到大規(guī)模生產(chǎn)的要求[12].

蛋白C，又稱凝血酶原IIA和凝血因子XIV，其活化形式在調(diào)節(jié)人及其他動物的抗凝血、炎癥、細胞死亡和維持血管壁通透性等方面起著重要作用[13].活化蛋白C (Activated Protein C，APC) 因其活性部位含有絲氨酸殘基而被歸類為絲氨酸蛋白酶[14].在人類中，蛋白C是由PROC基因編碼的，該基因存在于2號染色體上[15].人蛋白C (hPC) 是一種維生素K依賴的血漿糖蛋白，具有抗凝血活性，由25 KD輕鏈和41 KD重鏈組成[16].已有多種宿主表達系統(tǒng)用來生產(chǎn)重組hPC. Macias WL等應用HEK293細胞生產(chǎn)rhPC用于膿毒癥的治療[17]. 轉(zhuǎn)基因豬乳腺也被用來生產(chǎn)重組hPC.乳腺細胞生產(chǎn)的重組蛋白易于純化，而且表達量優(yōu)于其他表達系統(tǒng)[18，19].

人凝血因子VIII 對缺乏人凝血因子VIII所致的凝血機能障礙具有糾正作用.其主要用于防治由凝血因子VIII(FVIII)缺陷引起的出血性疾病，如甲型血友病.Wang Q 等應用轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺生物反應器高效并特異性表達了人重組凝血因子VIII.通過對比兩種不同啟動子的重組表達載體P1A3-hFVIIIBD 和 CMV-hFVIIIBD在小鼠乳汁中蛋白表達水平以及蛋白活性，發(fā)現(xiàn)P1A3-hFVIIIBD更適用于在乳腺生物反應器中生產(chǎn)hFVIII[20].

人體組織型纖溶酶原激活劑(tPA)是纖維蛋白溶解的關(guān)鍵激酶，溶解纖維蛋白凝塊以促進血栓溶解過程中起到重要作用.雖然tPA是目前臨床上用于治療血栓疾病的主要生物藥品之一，但其存在著不可避免的缺點，如出血副作用較大、半衰期短等[21].Song SZ等成功構(gòu)建了重組人纖溶酶原激活劑的轉(zhuǎn)基因兔乳腺生物反應器，而且表達的蛋白是分泌到乳汁中的.乳汁中rhPA 表達水平可達到15.2～630 μg/mL.經(jīng)纖維蛋白瓊脂糖平板檢測顯示rhPA具有強溶栓生物活性，最高的比活性是藥品阿替普酶的360倍[22].

乳鐵蛋白具有抗菌和抗炎的特性.已有研究成功地在牛乳腺上皮干細胞表達牛乳鐵蛋白(LF cinB)并應用于牛乳腺炎的治療[23].人乳鐵蛋白(hLF)是一種多功能糖蛋白，參與腸道和非特異性免疫系統(tǒng)的鐵吸收[24].Cui CC等應用乳腺β-乳球蛋白敲除(BLG-)的山羊作為轉(zhuǎn)基因動物反應器來大規(guī)模生產(chǎn)人乳鐵蛋白，通過ELISA檢測，來自BLG-/hLF山羊的乳汁中的hLF表達水平較BLG/HLF山羊乳汁水平高，而且差異呈顯著性[25].Dai Y等對乳腺生物反應器表達的重組人乳鐵蛋白的毒性做了相關(guān)研究.急性口服毒性試驗表明，rhLF在觀察期內(nèi)沒有毒性作用，重組人乳鐵蛋白小鼠急性口服LD50大于20000 mg/kg.90天喂養(yǎng)試驗表明，300次rhLF推薦劑量后，動物體內(nèi)無明顯不良反應，毒理學參數(shù)NOAEL為10.00 g/(kg·d).這一研究結(jié)果也表明，rhLF不存在食品安全隱患[26].

人溶菌酶具有殺菌消炎、免疫調(diào)節(jié)、改善腸道菌群等作用，也是人體的非特異性免疫物質(zhì)和母乳重要成分，食用、藥用均安全可靠，無免疫原性，可廣泛應用于食品保鮮、嬰幼兒奶粉、抗菌消炎藥和抗生素替代等方面，具有廣闊的應用前景.人溶菌酶轉(zhuǎn)基因動物研究的最終目的是獲得抗仔豬腹瀉的豬、抗乳房炎的奶牛和奶山羊來獲取大量有生物活性的重組人溶菌酶，以用于食品和醫(yī)學臨床研究[27-30].

干擾素α-2b(IFNα-2b)是重要的免疫調(diào)節(jié)劑，臨床上廣泛用于治療慢性肝炎、慢性粒細胞白血病和多發(fā)性骨髓瘤等.臨床上使用的IFNα-2b通常是原核表達系統(tǒng)生產(chǎn)的重組蛋白[31].其存在一定的缺陷：除缺乏翻譯后O-糖基化以及血清半衰期短之外，E.coli表達的重組蛋白多存在于包涵體中.復性過程中有近50%的蛋白損失，這也是生物技術(shù)行業(yè)公認的技術(shù)瓶頸[32，33].Hui Li等應用轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺生物反應器成功表達了具有生物活性的人干擾素α-2b，彌補了原核表達系統(tǒng)的不足.但其高表達及低成本的特性也為干擾素α-2b的生產(chǎn)提供了新的途徑[34].

人粒細胞集落刺激因子(hG-CSF)是一種糖蛋白，主要由內(nèi)毒素、TNF-α和IFN-γ活化單核—噬細胞產(chǎn)生.rhG-CSF作用于造血祖細胞，刺激粒細胞、單核巨噬細胞成熟，并促進成熟細胞向外周血釋放[35，36].Mashkani B等應用畢赤酵母表達系統(tǒng)成功表達了去內(nèi)毒素并具有生物活性的人CSF-1[37].Batista RI等應用轉(zhuǎn)基因山羊生物反應器，使其成功地在乳汁中分泌表達.該研究證明rhG-CSF可以在第一代(F1)轉(zhuǎn)基因山羊的乳腺中表達[38].

縱觀乳腺生物反應器表達的產(chǎn)物，從最初的抗凝血酶Ⅲ( A Tryn)、人蛋白C (h PC)、凝血因子Ⅷ(h F-Ⅷ) 到組織型纖溶酶原激活劑(tPA)、乳鐵蛋白(hLF)、溶菌酶、超氧化物歧化酶(SOD)[39]、干擾素α-2b和集落刺激因子.可見轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應器生產(chǎn)的都是一些醫(yī)用價值高的酶或細胞因子等.

3.2 建立轉(zhuǎn)基因動物生物反應器

自從轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)發(fā)展以來，轉(zhuǎn)基因動物的乳腺就被用作反應器來生產(chǎn)重組藥用蛋白[40，41].用于乳腺生物反應器研究的物種主要是小鼠[4]，此外還有其他產(chǎn)奶動物，如綿羊[42]、山羊[43]、牛[44]、豬[45]和兔[22]等.有研究表明，已在山羊乳腺成功表達抗凝血酶原III[46]，而且在轉(zhuǎn)基因兔中成功表達了以生理活性形式存在的超氧化物歧化酶[47].

3.3 提高乳品質(zhì)

通過乳腺生物反應器改良乳品質(zhì)有兩方面內(nèi)容：一是表達一些外源營養(yǎng)蛋白提高乳汁本身的營養(yǎng)價值，降低有害物質(zhì)的含量；二是改變?nèi)橹性谐煞郑瑥亩谷橹蛉橹破犯欣谌祟惤】?以乳鐵蛋白為例，其是牛奶中一種具有廣譜抗菌活性的多功能蛋白質(zhì)，可以抵抗多種細菌、真菌、病毒以及寄生蟲感染[48].它的抗菌活性也使得其可以替代傳統(tǒng)藥物用于牛乳腺炎的治療.但是牛奶中該蛋白的表達量明顯低于人乳，因此在牛乳腺中表達相關(guān)重組蛋白會使牛乳更接近于人乳，有利于人類健康[40].Zhang JX等人，采用質(zhì)粒介導的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使乳腺細胞合成和分泌牛乳鐵蛋白和?？咕念A防牛乳腺炎[49].

4 結(jié)語

雖然轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應器技術(shù)已經(jīng)取得了一些成就，展示了廣闊的發(fā)展?jié)摿颓熬?可廣泛應用于實際生產(chǎn)，但還是仍存在許多理論和技術(shù)問題需要解決，如外源基因在動物體內(nèi)的整合位點問題、轉(zhuǎn)基因表達產(chǎn)物的后期分離純化問題、目的基因的翻譯后修飾問題以及外源基因在動物乳腺中特異性表達的問題.盡管這一技術(shù)還存在一些問題，但它實實在在創(chuàng)造了一個新的現(xiàn)代生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè).它仍然是一種理想的藥用蛋白的生產(chǎn)工具，有著不可比擬的優(yōu)勢，將成為現(xiàn)代生物醫(yī)藥領域改革的方向.其具有巨大的經(jīng)濟價值和廣闊的應用前景.