龍興瑤，李 鍵，謝 婕，趙 欣，王洪偉，張 玉，索化夷,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400715；2.重慶第二師范學(xué)院 重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶 400067；3.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041）

藏靈菇是由數(shù)種乳酸菌、酵母菌、醋酸菌和霉菌共生而成的西藏特有酸乳發(fā)酵劑[1]，其發(fā)酵的酸乳具有改善腸道菌群，增強(qiáng)胃腸道功能[2]、降低血清總膽固醇和甘油三酯、保護(hù)肝臟[3]、清除自由基[4]，抗氧化[5]，延緩衰老[6]、預(yù)防改善動(dòng)脈粥樣硬化[7]等功能，其分泌的胞外多糖能抑制癌細(xì)胞增殖，具有抗腫瘤作用[8]。且藏靈菇發(fā)酵的酸乳與普通酸乳在口感和風(fēng)味上具有較大差別，因?yàn)椴仂`菇發(fā)酵酸乳是酵母菌和乳酸菌共同發(fā)酵而成，所以藏靈菇發(fā)酵酸乳中有其特有的醇香味及起泡性[9]。

作為發(fā)酵劑，藏靈菇中的乳酸菌和酵母菌在發(fā)酵過(guò)程中發(fā)揮了主要作用，目前有針對(duì)乳酸菌和酵母菌的種類和發(fā)酵特性的研究，其研究結(jié)果表明，藏靈菇中的乳酸菌主要為乳桿菌屬、乳球菌屬、雙歧桿菌屬、微球菌屬，酵母菌主要為假絲酵母屬、魯維酵母屬和酵母屬[10]。藏靈菇發(fā)酵酸乳過(guò)程中，乳酸菌和酵母菌的新陳代謝產(chǎn)物能抑制有害菌的生長(zhǎng)，酵母菌能分解乳糖，產(chǎn)生維生素促進(jìn)乳酸菌生長(zhǎng)，同時(shí)產(chǎn)生的半乳糖能保護(hù)乳酸菌細(xì)胞免受乳酸濃度的阻礙。乳酸菌能促進(jìn)釀酒酵母和馬克斯克魯維酵母的生長(zhǎng)，釀酒酵母和乳酸菌共同接種有利于保持產(chǎn)品冷藏期間活菌數(shù)的穩(wěn)定，菌株之間可能存在共生作用[11]。藏靈菇作為發(fā)酵劑的發(fā)酵過(guò)程中，乳酸菌和酵母菌各自發(fā)揮的作用還尚未研究清楚。為研究藏靈菇發(fā)酵酸乳中乳酸菌和酵母菌的發(fā)酵特性，明確乳酸菌和酵母菌在酸乳發(fā)酵過(guò)程中各自對(duì)品質(zhì)、口感所產(chǎn)生的影響，選用實(shí)驗(yàn)室保藏藏靈菇進(jìn)行發(fā)酵。在發(fā)酵過(guò)程中，用放線菌酮和青鏈霉素分別抑制發(fā)酵過(guò)程中的酵母菌和乳酸菌，測(cè)定并比較正常發(fā)酵酸乳、抑制乳酸菌和酵母菌發(fā)酵酸乳的酸度、乙醇含量、氨基酸態(tài)氮、質(zhì)構(gòu)、游離氨基酸、有機(jī)酸、VB1和VB2含量等相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果可指導(dǎo)藏靈菇發(fā)酵酸乳標(biāo)準(zhǔn)的制定，也可保證藏區(qū)牧民家庭式藏靈菇發(fā)酵酸乳的品質(zhì)，對(duì)藏靈菇發(fā)酵酸乳產(chǎn)業(yè)起到推動(dòng)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藏靈菇菌粒為實(shí)驗(yàn)室保藏，采樣于西藏。

牦牛奶粉 紅原牦牛乳業(yè)有限責(zé)任公司；放線菌酮、青鏈霉素、茚三酮 北京索萊寶科技有限公司；鹽酸、乙酸鈉、甲酸、乙酸、磷酸二氫銨、溴百里香酚藍(lán)、氫氧化鈉、重鉻酸鉀、甲醛 成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

L-8800氨基酸分析儀 日立（中國(guó)）有限公司；DY-09 PHS-3C酸度計(jì) 成都世紀(jì)方舟科技有限公司；LC-20A高效液相色譜儀 日本島津公司；XDB-C18高效液相色譜柱 安捷倫科技有限公司；TA-XT2i質(zhì)構(gòu)儀英國(guó)SMS公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵工藝

將3.6 g牦牛奶粉加入30 mL水中混勻，30 ℃預(yù)熱，巴氏殺菌（63 ℃、30 min），冷卻至室溫，接種5%的發(fā)酵劑在37 ℃條件下發(fā)酵10 h后放入4 ℃冷庫(kù)，后熟24 h。

1.3.2 抑制發(fā)酵條件

按照不同發(fā)酵時(shí)間（2、6、10、22、34 h）和發(fā)酵方式分別發(fā)酵藏靈菇酸乳。分別取0.001、0.002、0.004、0.006 g的放線菌酮溶解于100 mL的原料乳中，按1.3.1節(jié)方法進(jìn)行發(fā)酵，取發(fā)酵10 h的發(fā)酵乳，按GB 4789.15—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》[12]，GB 4789.35—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》[13]分別對(duì)酸乳中的酵母菌和乳酸菌計(jì)數(shù)，并計(jì)算酵母菌的抑制率。吸取0.3、0.5、1.0、1.5 mL的青鏈霉素混合液（青霉素10 kU/mL，鏈霉素10 mg/mL）溶于100 mL的原料乳中進(jìn)行發(fā)酵，然后取發(fā)酵10 h的發(fā)酵乳，按GB 4789.15—2010、GB 4789.35—2010分別對(duì)酸乳中的酵母菌和乳酸菌計(jì)數(shù)，并計(jì)算乳酸菌的抑制率。

1.3.3 滴定酸度的測(cè)定

根據(jù)GB 5413.34—2010《乳和乳制品酸度的測(cè)定》[14]，進(jìn)行滴定酸度的測(cè)定。

1.3.4 氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定

根據(jù)GB 5009.30—2003《醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法測(cè)定》[15]，進(jìn)行氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定。

1.3.5 乙醇含量測(cè)定

根據(jù)GB/T 12143—2008《飲料通用分析方法的測(cè)定》[16]，進(jìn)行乙醇含量的測(cè)定。

1.3.6 質(zhì)構(gòu)特性測(cè)定

選用A/BE探頭對(duì)藏靈菇發(fā)酵牦牛酸乳的硬度、稠度、黏聚性和黏性指數(shù)等質(zhì)構(gòu)特性進(jìn)行測(cè)定[17]。其中探頭選擇直徑為35 mm壓力盤，設(shè)定下降速率為10 mm/s，測(cè)試和提升速率為1 mm/s，測(cè)試深度為發(fā)酵酸奶總高度的70%，記錄速率為200 mg/kg。

1.3.7 游離氨基酸含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取樣品400 mg于18 mm×180 mm試管中，向盛有樣品的試管中加入7 mL的鹽酸（6 mol/L），振蕩混勻。用酒精噴燈把該試管口下1/3處拉細(xì)到4～6 mm，抽真空10 min后封管。處理過(guò)的試管置（110±1）℃恒溫烘箱中沙浴水解22 h，拿出冷至室溫，搖勻過(guò)濾，取1 mL濾液于50 mL燒杯中，用60 ℃恒溫水浴蒸干濾液，加入0.02 mol/L鹽酸稀釋6 倍，用0.22 μm濾膜過(guò)濾上機(jī)分析。

分析周期為53 min；分離柱（4.6 mm×60 mm）柱溫設(shè)為70 ℃，柱壓7.678 MPa，洗脫液以0.4 mL/min流速流經(jīng)此柱；反應(yīng)柱柱溫135 ℃、柱壓0.982 MPa，茚三酮及茚三酮緩沖液以0.35 mL/min流速流經(jīng)此柱；進(jìn)樣體積為20 μL。

1.3.8 乳酸、乙酸、檸檬酸含量的測(cè)定[18]

稱取發(fā)酵乳試樣約5 g（精確到0.000 1 g）于50 mL容量瓶中，用超純水稀釋至刻度，超聲5 min，搖勻，濾紙過(guò)濾后，吸取濾液過(guò)0.45 μm濾膜后作為樣液，供高效液相色譜測(cè)定。

色譜柱選用Agilent XDB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.1 mol/L磷酸二氫銨溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH 2.4，過(guò)0.45 μm濾膜）和甲醇；流速為甲醇0.03 mL/min，磷酸二氫銨溶液0.57 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm；色譜柱溫度35 ℃；進(jìn)樣體積10 μL。

1.3.9 VB1含量的測(cè)定[19]

稱取5～10 g（精確至0.01 g）試樣于100 mL三角瓶中，加60 mL的0.1 mol/L鹽酸充分搖勻，用棉花塞和牛皮紙封口，放入高壓滅菌鍋內(nèi)，在121 ℃保持30 min，待冷卻至40 ℃以下后取出，輕搖數(shù)次；用2.0 mol/L乙酸鈉溶液調(diào)pH值至4.0左右，加入2.0 mL混合酶液，搖勻后置于37 ℃的培養(yǎng)箱中過(guò)夜；將酶解液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，濾紙過(guò)濾，取濾液備用。取上述濾液10.00 mL于25 mL具塞比色管中，加入5 mL堿性鐵氰化鉀，充分混勻后，加10.00 mL正丁醇，強(qiáng)烈振蕩后靜置約10 min，充分分層，吸取正丁醇相（上層）于4 000～6 000r/min離心5 min，取上清液經(jīng)有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾，供進(jìn)樣用。

選用C18反相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.05 mol/L乙酸鈉溶液和色譜級(jí)甲醇，體積比為65∶35；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)375 nm，發(fā)射波長(zhǎng)435 nm；進(jìn)樣量20 μL。

1.3.10 VB2含量的測(cè)定[20]

稱取5～10 g（精確至0.01 g）試樣于100 mL三角瓶中，加60 mL 0.1 mol/L鹽酸充分搖勻，用棉花塞和牛皮紙封口，放入高壓滅菌鍋內(nèi)，在121 ℃保持30 min，待冷卻至40 ℃以下后取出，輕搖數(shù)次；用2.0 mol/L乙酸鈉溶液調(diào)pH值至4.0左右，加入2.0 mL混合酶溶液搖勻后，置于37 ℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜；將酶解液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，用定量濾紙過(guò)濾，取濾液再經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，取濾液備用。

選用C18反相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.05 mol/L乙酸鈉溶液和甲醇，體積比為65∶35；流速設(shè)為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)為462 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為522 nm；進(jìn)樣量20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌和乳酸菌的抑制率結(jié)果

表1 添加青鏈霉素發(fā)酵酸乳的菌落計(jì)數(shù)Table1 Colony counts of Lactobacillus and yeast in yoghurt with penicillin

表2 添加放線菌酮發(fā)酵酸乳的菌落計(jì)數(shù)Table2 Colony counts of yoghurt with cycloheximide

通過(guò)對(duì)正常發(fā)酵和添加不同量抑制劑發(fā)酵酸奶的菌落計(jì)數(shù)分析，由表1、2可以發(fā)現(xiàn)，添加0.004 g/100 mL放線菌酮的發(fā)酵酸乳，對(duì)其進(jìn)行酵母菌計(jì)數(shù)，抑制率達(dá)到100%，在相同條件下對(duì)酸乳中的乳酸菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，對(duì)乳酸菌無(wú)明顯的抑制作用。添加0.5 mL/100 mL青鏈霉素的發(fā)酵酸乳，對(duì)乳酸菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，抑制率達(dá)到89.7%，在相同條件下對(duì)酸乳中的酵母菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，對(duì)酵母菌無(wú)明顯的抑制作用。因此選擇0.004 g/100 mL的放線菌酮抑制酵母菌，0.5 mL/100 mL的青鏈霉素抑制乳酸菌。

2.2 3 種發(fā)酵條件對(duì)滴定酸度的影響

酸乳的酸度是衡量發(fā)酵劑發(fā)酵性能的主要指標(biāo)之一，當(dāng)酸度達(dá)到一定的數(shù)值之后，酸乳便會(huì)凝固。對(duì)比圖1中3 種不同發(fā)酵方式，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，抑制酵母菌發(fā)酵的樣品與正常發(fā)酵樣品的變化趨勢(shì)基本無(wú)差別，而抑制乳酸菌發(fā)酵的樣品，其滴定酸度明顯低于前兩種。藏靈菇酸乳在2～10 h的發(fā)酵過(guò)程中，正常發(fā)酵和抑制酵母菌發(fā)酵樣品的滴定酸度由21 °T增加至60 °T，而抑制乳酸菌的樣品只由18 °T增加至22 °T，最終滴定酸度為正常發(fā)酵滴定酸的1/3，這說(shuō)明乳酸菌是影響酸乳發(fā)酵過(guò)程中滴定酸度最主要的因素。

圖1 不同發(fā)酵方式藏靈菇酸乳發(fā)酵過(guò)程中滴定酸度變化Fig. 1 Changes in titratable acidity of yogurt during fermentation under different conditions

2.3 3 種發(fā)酵條件對(duì)乙醇含量的影響

圖2 不同發(fā)酵方式藏靈菇酸乳發(fā)酵過(guò)程中乙醇含量變化Fig. 2 Changes in alcohol content of yogurt during fermentation under different conditions

藏靈菇牦牛發(fā)酵乳屬于Ⅳ型發(fā)酵乳[21]，其獨(dú)特的醇香味可能是與酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生乙醇有關(guān)。而乙醇主要是酵母在無(wú)氧狀態(tài)下，由乙醇脫氫酶還原乙醛生成[22]。對(duì)比圖2中3 種發(fā)酵方式，抑制酵母菌生長(zhǎng)的發(fā)酵酸乳，其乙醇含量值明顯低于正常發(fā)酵和抑制乳酸菌發(fā)酵的發(fā)酵樣品。藏靈菇3 種發(fā)酵方式樣品終點(diǎn)的乙醇含量分別為4.44、3.68、2.77 g/kg，抑制酵母菌發(fā)酵的酸乳其乙醇含量約為正常發(fā)酵組的1/2，因此，酵母菌對(duì)酸乳發(fā)酵過(guò)程中乙醇的產(chǎn)生發(fā)揮了主要的作用。但抑制乳酸菌發(fā)酵的酸乳乙醇含量略低于正常發(fā)酵，說(shuō)明乳酸菌可能會(huì)影響酵母菌產(chǎn)生乙醇。

2.4 3 種發(fā)酵條件對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響

蛋白質(zhì)在微生物水解酶的作用下分解成各種氨基酸，從而使酸乳獲得更豐富的香味，因此氨基酸態(tài)氮的含量在一定程度上可代表酸乳的感官品質(zhì)。如圖3所示，在前發(fā)酵過(guò)程的終點(diǎn)10 h時(shí)，藏靈菇的氨基酸態(tài)氮含量分別為223.18、202.99、73.56 mg/100 g，說(shuō)明抑制酵母菌和抑制乳酸菌的發(fā)酵方式對(duì)樣品中氨基酸態(tài)氮的含量是有影響的。對(duì)比整個(gè)發(fā)酵過(guò)程，抑制酵母菌的發(fā)酵方式，其氨基酸態(tài)氮含量的變化趨勢(shì)與正常發(fā)酵的一致，但抑制了乳酸菌發(fā)酵的樣品，其氨基酸態(tài)氮含量明顯降低，由65 mg/100 g下降為53 mg/100 g，約為正常發(fā)酵的30%，說(shuō)明蛋白酶主要來(lái)源于乳酸菌，乳酸菌對(duì)氨基酸態(tài)氮的產(chǎn)生起到了關(guān)鍵的作用。

圖3 不同發(fā)酵方式藏靈菇酸乳發(fā)酵過(guò)程中氨基酸態(tài)氮含量變化Fig. 3 Changes in nitrogen amino acid content of yogurt during fermentation under different conditions

2.5 發(fā)酵條件對(duì)質(zhì)構(gòu)特性的影響

圖4 不同發(fā)酵方式藏靈菇酸乳發(fā)酵過(guò)程中硬度特性變化Fig. 4 Changes in firmness of yogurt during fermentation under different conditions

圖5 不同發(fā)酵方式藏靈菇酸乳發(fā)酵過(guò)程中稠度特性變化Fig. 5 Changes in consistency of yogurt during fermentation under different conditions

硬度和稠度反映了酸乳的爽滑性及細(xì)膩度，而黏聚性和黏性指數(shù)則代表探頭在離開酸乳時(shí)的附著力，一般情況下稠度越大的酸乳，其黏著力也較大。通過(guò)對(duì)發(fā)酵酸乳硬度、稠度、黏聚性和黏性指數(shù)的測(cè)定（圖4～7），可以模擬酸乳的口感，使酸乳在咀嚼特性方面有更好的量化指標(biāo)[23-24]。在進(jìn)行酸奶質(zhì)構(gòu)的測(cè)定時(shí)，抑制乳酸菌活性的發(fā)酵方式，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵酸乳都未凝乳，因此未對(duì)其進(jìn)行質(zhì)構(gòu)測(cè)定?？赡茉?yàn)橐种迫樗峋姆敝?，使酸乳產(chǎn)酸量不足，酸乳中的蛋白質(zhì)達(dá)不到凝固的酸度等電點(diǎn)，凝膠結(jié)構(gòu)無(wú)法形成。

圖6 不同發(fā)酵方式藏靈菇酸乳發(fā)酵過(guò)程中黏聚性變化Fig. 6 Changes in cohesiveness of yogurt during fermentation under different conditions

圖7 不同發(fā)酵方式藏靈菇酸乳發(fā)酵過(guò)程中黏性指數(shù)變化Fig. 7 Changes in viscosity index of yogurt during fermentation under different conditions

綜合分析抑制酵母菌活性和正常發(fā)酵兩種發(fā)酵方式下各樣品的硬度、稠度、黏聚性和黏性指數(shù)，可以發(fā)現(xiàn)抑制酵母菌活性后，酸奶在質(zhì)構(gòu)特性方面并沒(méi)有出現(xiàn)太大的變化，質(zhì)構(gòu)各項(xiàng)指數(shù)變化趨勢(shì)的曲線幾乎相同，但各項(xiàng)指標(biāo)均與正常發(fā)酵組存在一些差別。這說(shuō)明雖然酵母菌對(duì)發(fā)酵酸乳的質(zhì)構(gòu)存在一些影響，但乳酸菌才是酸乳發(fā)酵過(guò)程中最重要的影響因素。

2.6 3 種發(fā)酵條件對(duì)游離氨基酸含量的影響

游離氨基酸可直接被人體吸收，吸收速率快，利用率高[25]。如表3所示，在3 種發(fā)酵方式中，含量最高的氨基酸為脯氨酸和絲氨酸，而非高薇等[26]實(shí)驗(yàn)結(jié)果中的谷氨酸、脯氨酸和賴氨酸。單抑制酵母菌發(fā)酵的條件下，藏靈菇發(fā)酵酸乳的氨基酸總含量與正常發(fā)酵方式相差較小，單抑制乳酸菌的發(fā)酵方式所產(chǎn)生的游離氨基酸與正常發(fā)酵方式相比相差較大，特別是賴氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸7 種必需氨基酸在抑制乳酸菌以后含量明顯下降，只有正常發(fā)酵組的一半左右。說(shuō)明乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中對(duì)游離氨基酸的產(chǎn)生起主要作用，酵母菌影響較小。

表3 不同發(fā)酵條件藏靈菇酸乳發(fā)酵過(guò)程中游離氨基酸含量變化Table3 Changes in free amino acid content of yogurt during fermentation under different conditions

2.7 3 種發(fā)酵條件對(duì)有機(jī)酸含量的影響

圖8 不同發(fā)酵方式藏靈菇酸乳發(fā)酵過(guò)程中各有機(jī)酸含量變化Fig. 8 Changes in organic acid contents of yogurt during fermentation under different conditions

有機(jī)酸作為乳酸風(fēng)味的重要來(lái)源，其中乳酸與滴定酸呈正相關(guān)，乙酸和檸檬酸也可分解為相關(guān)的酯、氨基化合物或某些醇類物質(zhì)，為酸乳帶來(lái)豐富而清爽的口感[27]。從圖8結(jié)果來(lái)看，抑制乳酸菌之后的酸乳其乳酸、乙酸在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中幾乎沒(méi)有產(chǎn)生，檸檬酸也逐漸減少，這與根據(jù)周劍忠等[28]的研究結(jié)果相似，說(shuō)明乳酸菌是影響乳酸和乙酸生成的重要因素。乳酸菌和酵母菌對(duì)檸檬酸的影響并沒(méi)有明顯的規(guī)律，但總量都低于正常發(fā)酵。

2.8 3 種發(fā)酵條件對(duì)VB1、VB2含量的影響

圖9 不同發(fā)酵方式藏靈菇酸乳發(fā)酵過(guò)程中VB1和VB2變化Fig. 9 Changes in VB2 content of yogurt during fermentations under different conditions

如圖9所示，抑制乳酸菌后，VB1明顯下降，由20 μg/100 g下降為18 μg/100 g；VB2含量在后期有小幅提升，且趨勢(shì)與正常發(fā)酵相似。抑制酵母菌活性的酸乳，其VB2含量相對(duì)較低，特別是在發(fā)酵后期VB2更明顯降低，由168 μg/100 g下降為157 μg/100 g。說(shuō)明乳酸菌與VB1的生成有關(guān)，酵母菌與VB2的生成有關(guān)。

3 討 論

藏靈菇作為藏區(qū)特有的發(fā)酵劑，其發(fā)酵的酸乳風(fēng)味獨(dú)特，適口性良好，對(duì)身體有益。但現(xiàn)階段的開發(fā)利用和發(fā)酵研究程度不夠。本實(shí)驗(yàn)采用抑制酵母菌和乳酸菌的方式研究乳酸菌和酵母菌分別對(duì)發(fā)酵的影響。測(cè)定結(jié)果中正常發(fā)酵酸乳滴定酸度最高值為60 °T，與Zhang Heping等[29]報(bào)道的市售酸奶滴定酸度一致。與王則臻等[30]和賈磊[31]的研究所得結(jié)果類似，使用乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵在前幾個(gè)小時(shí)內(nèi)酸度值會(huì)明顯增加，而用酵母菌發(fā)酵時(shí)滴定酸度值變化不大，說(shuō)明在發(fā)酵前期，乳酸菌迅速生長(zhǎng)，分解乳糖產(chǎn)生乳酸等一系列酸性物質(zhì)，使酸乳滴定酸度急劇升高，但環(huán)境酸度過(guò)低會(huì)抑制乳酸自身生長(zhǎng)[32]，所以到發(fā)酵后期，酸乳的滴定酸度保持相對(duì)穩(wěn)定，可見(jiàn)乳酸菌是提高酸乳酸度的主要微生物。Cheirsilp等[33]研究也發(fā)現(xiàn)，乳糖陽(yáng)性酵母菌和乳糖陰性酵母菌的存在會(huì)促進(jìn)乳糖繼續(xù)代謝，能使產(chǎn)品的pH值有所上升，這也能夠解釋在抑制乳酸菌的發(fā)酵酸乳中酵母菌能夠增加滴定酸度的原因。

藏靈菇發(fā)酵酸乳中含有的酵母菌在進(jìn)行無(wú)氧呼吸產(chǎn)生乙醇的同時(shí)可以為產(chǎn)品帶來(lái)特殊的香氣和風(fēng)味[34]，在抑制乳酸菌生長(zhǎng)的樣品中，酵母菌有更充足的生長(zhǎng)環(huán)境，活性更高，產(chǎn)生乙醇的速率增加，到發(fā)酵后期，高含量的乙醇會(huì)抑制酵母菌的活性，因此前10 h乙醇含量增加迅速到后期乙醇含量相對(duì)穩(wěn)定，相反，在抑制酵母菌生長(zhǎng)的樣品中乙醇含量明顯減少，因此在藏靈菇發(fā)酵酸乳中所產(chǎn)生的醇香物質(zhì)來(lái)源為酵母菌。此結(jié)果與賈磊[31]前4 h快速產(chǎn)乙醇存在一些差別，分析原因可能為本實(shí)驗(yàn)中發(fā)酵酸乳環(huán)境中含氧量較低，酵母菌從最開始便進(jìn)行無(wú)氧呼吸產(chǎn)生乙醇，而沒(méi)有進(jìn)行有氧呼吸大量繁殖。雖然酵母菌是乙醇的主要來(lái)源，但抑制酵母菌發(fā)酵的酸乳乙醇含量略低于正常發(fā)酵酸乳的乙醇含量，可能原因是放線菌酮的添加對(duì)酵母菌也有部分抑制。

氨基酸態(tài)氮含量為判斷發(fā)酵程度的一項(xiàng)指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)抑制乳酸菌發(fā)酵后酸乳中的氨基酸態(tài)氮明顯減少，可能因?yàn)槿樗峋墚a(chǎn)生更多分解蛋白質(zhì)的酶類，這些酶能將蛋白質(zhì)分解為肽和氨基酸，氨基酸態(tài)氮的含量就會(huì)增加。3 種條件的發(fā)酵酸乳10 h后氨基酸態(tài)氮含量都略有下降，可能原因是菌株自身增殖又利用了生成的氨基酸作為氮源所致[35]。

乳酸菌對(duì)酸乳的質(zhì)構(gòu)起到至關(guān)重要的作用，因?yàn)橐种迫樗峋l(fā)酵酸乳產(chǎn)酸不夠，無(wú)法達(dá)到蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，無(wú)法形成凝乳狀態(tài)。但也能發(fā)現(xiàn)酵母菌對(duì)發(fā)酵酸乳的質(zhì)構(gòu)起到一定的作用，可能原因是酵母菌會(huì)影響乳酸菌和明串珠菌胞外多糖的產(chǎn)生來(lái)影響發(fā)酵酸乳的質(zhì)構(gòu)[36-37]。與祝靜[38]測(cè)定的羊酸奶發(fā)酵酸乳相比，藏靈菇發(fā)酵酸乳在質(zhì)構(gòu)指標(biāo)上有明顯的優(yōu)勢(shì)，說(shuō)明藏靈菇中蘊(yùn)含的乳酸菌和酵母菌在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的物質(zhì)對(duì)質(zhì)構(gòu)的貢獻(xiàn)優(yōu)于其他發(fā)酵劑。Soukoulis等[39]的研究表示，較高的pH值能使酸乳質(zhì)構(gòu)更加穩(wěn)定，這與本實(shí)驗(yàn)有類似的結(jié)果，在發(fā)酵酸乳達(dá)到10 h，滴定酸度不斷積累，pH值不斷降低的情況下，質(zhì)構(gòu)的穩(wěn)定性出現(xiàn)波動(dòng)，尤其是硬度和稠度出現(xiàn)明顯轉(zhuǎn)折。

游離氨基酸通過(guò)脫羧、脫氨、氨基轉(zhuǎn)移和硫酸化等代謝途徑形成短鏈脂肪酸、酯類、醛類及其他成分。本研究中抑制乳酸菌發(fā)酵后7 種必需氨基酸含量下降，可能原因是乳酸菌所生成的酶對(duì)必需氨基酸的影響較大，抑制乳酸菌發(fā)酵后這些酶類無(wú)法產(chǎn)生，因此無(wú)法形成相對(duì)應(yīng)的氨基酸。

有機(jī)酸影響著酸乳酸爽的口感，乳酸菌通過(guò)HMP途徑產(chǎn)生乳酸和乙酸，因此抑制乳酸菌生長(zhǎng)后酸乳中乙酸與乳酸明顯降低。抑制酵母菌活性后乙酸含量略微高于正常發(fā)酵組，可能原因是酵母菌生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)消耗乙酸。田輝等[40]利用高效液相色譜法測(cè)定酸奶中的有機(jī)酸，乳酸的含量顯著多于乙酸、檸檬酸且乳酸含量與滴定酸度呈明顯的正相關(guān)與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同。發(fā)酵酸乳的乙酸含量在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中是呈下降趨勢(shì)的，這是由于乙酸是乙酸乙酯等各類風(fēng)味物質(zhì)的前體物質(zhì)，在發(fā)酵過(guò)程中，乙酸被不斷利用以合成各類風(fēng)味物質(zhì)，因此在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中乙酸的含量顯示為下降狀態(tài)。檸檬酸的含量也有所下降，這是由于檸檬酸是很多風(fēng)味物質(zhì)的前體物質(zhì)[41]，在酸乳后發(fā)酵時(shí)期檸檬酸轉(zhuǎn)化形成其他風(fēng)味物質(zhì)，使得檸檬酸的含量有所下降。

B族維生素是許多活性酶的輔酶，VB1、VB2可以調(diào)節(jié)糖類和蛋白質(zhì)的代謝。從本研究的結(jié)果可以看出，抑制乳酸菌后VB1損失較大，抑制酵母菌后VB2損失較大，特別是發(fā)酵后期，這與陸婧[42]的研究類似。乳酸菌影響VB1可能的原因?yàn)閂B1是乳酸菌活動(dòng)所產(chǎn)生的，雖然VB1會(huì)因?yàn)殛?yáng)光和乳酸菌的消耗有一定量的損失，但是某些乳酸菌也會(huì)合成和促進(jìn)B族維生素的合成，如乳酸乳球菌和雙歧桿菌[43-44]。而酵母菌的各種生理代謝與VB2的產(chǎn)生有關(guān)，特別是在發(fā)酵后期，VB2明顯減少，一方面是因?yàn)榻湍妇怯绊慥B2的主要微生物，另一方面是缺乏酵母菌的競(jìng)爭(zhēng)性生長(zhǎng)，乳酸菌消耗掉一部分VB2。

國(guó)內(nèi)外大量的研究以發(fā)酵酸乳的發(fā)酵特性作為研究基礎(chǔ)，例如酸度、質(zhì)構(gòu)特性、香氣物質(zhì)等，結(jié)合感官評(píng)價(jià)綜合評(píng)價(jià)酸乳的品質(zhì)。特別是Han Xue等[45]研究中發(fā)酵酸乳的酸度、硬度、黏度、黏聚性均與本實(shí)驗(yàn)中酸乳相似。趙欣[46]和陳潔[47]等研究發(fā)現(xiàn)，氨基酸態(tài)氮和游離氨基酸的含量直接影響發(fā)酵產(chǎn)品感官評(píng)價(jià)中的香氣評(píng)分。

綜上，在藏靈菇發(fā)酵酸乳過(guò)程中，酵母菌對(duì)酸乳中乙醇和VB2的生成起到關(guān)鍵作用，乳酸菌對(duì)酸乳酸度、氨基酸態(tài)氮含量、質(zhì)構(gòu)、游離氨基酸、乳酸和乙酸含量、VB1含量起到關(guān)鍵作用。酵母菌和乳酸菌可以互相促進(jìn)生長(zhǎng)，酵母菌可以促進(jìn)乳酸菌產(chǎn)生乳酸，乳酸菌能促進(jìn)酵母菌產(chǎn)生乙醇。

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