楊勝遠(yuǎn)，李 云

（1.嶺南師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，熱帶與南海資源協(xié)同創(chuàng)新中心，廣東 湛江 524048；2.韓山師范學(xué)院生命科學(xué)與食品科技學(xué)院，廣東 潮州 521041）

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一種具有4 個(gè)碳原子的非蛋白質(zhì)組成氨基酸，為哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有利尿、降血脂、抗糖尿病、抗氧化、抗炎、抗癌、降血壓和鎮(zhèn)靜作用，已成為備受關(guān)注的藥品和保健品成分[1-3]。由于可以通過內(nèi)酰胺化作用形成2-吡咯烷酮，再通過化學(xué)轉(zhuǎn)化生成聚酰胺4，因此GABA還是生產(chǎn)生物塑料的重要原料[4-5]。

生物合成GABA是一種環(huán)境友好和安全的方式，主要可采用微生物發(fā)酵法[5-12]、微生物全細(xì)胞轉(zhuǎn)化法[13-18]和酶催化合成法[19-22]3 種方法進(jìn)行生產(chǎn)。但是，無論采用何種生物合成法，其實(shí)質(zhì)都是利用谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD；編號(hào)為EC4.1.1.15）。依賴于磷酸吡哆醛的GAD是生物催化L-谷氨酸的α-羧基發(fā)生脫羧反應(yīng)生成GABA的唯一酶[23]，微生物細(xì)胞的GAD活性大小與GABA的產(chǎn)量密切相關(guān)。培養(yǎng)條件對(duì)微生物產(chǎn)GAD具有重要的影響，適宜的培養(yǎng)基不僅可以提高細(xì)胞的GAD活力，而且可以從原料的經(jīng)濟(jì)性和配制簡(jiǎn)捷性角度降低GABA的生產(chǎn)成本。

GAD廣泛分布于生物活細(xì)胞中，從單細(xì)胞到哺乳動(dòng)物細(xì)胞均有存在GAD的報(bào)道[24]。乳酸菌通常被認(rèn)為是安全的微生物，可作為益生菌，因此在乳酸菌GAD和利用乳酸菌合成GABA方面?zhèn)涫荜P(guān)注[25]。近些年，利用屎腸球菌（Enterococcus faecium）GAD合成GABA的研究也備受青睞。Divyashri等[26]通過動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)模型對(duì)屎腸球菌分批發(fā)酵法生產(chǎn)GABA的條件進(jìn)行了探討，GABA的產(chǎn)量較優(yōu)化前提高了2.9 倍；Pham等[10]模擬胃腸條件，對(duì)屎腸球菌游離細(xì)胞和海藻酸鈣包埋細(xì)胞產(chǎn)GABA的傳質(zhì)特性進(jìn)行了研究，海藻酸鈣包埋細(xì)胞產(chǎn)GABA能力顯著高于游離細(xì)胞；朱泉等[27]也篩選到一株GABA高產(chǎn)屎腸球菌菌株；李云等[15,28]對(duì)屎腸球菌的GAD酶學(xué)特性、細(xì)胞轉(zhuǎn)化法制備GABA也進(jìn)行了報(bào)道。然而，目前關(guān)于屎腸球菌適宜產(chǎn)GAD培養(yǎng)基尚鮮見報(bào)道。

實(shí)驗(yàn)比較了4 種已報(bào)道用于乳酸菌產(chǎn)GAD的培養(yǎng)基，結(jié)果屎腸球菌以蛋白胨-蔗糖-牛肉膏（peptonesucrose-beef extract，PSB）培養(yǎng)基產(chǎn)GAD活力最高，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步通過雙向單因素和田口試驗(yàn)設(shè)計(jì)法作進(jìn)一步優(yōu)化，以期為屎腸球菌GAD的研究和生產(chǎn)提供更為簡(jiǎn)單、高效而經(jīng)濟(jì)的培養(yǎng)基。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與試劑

屎腸球菌（E. faecium）LNSF2為嶺南師范學(xué)院綠色生物制造研究室保藏菌株，分離自泡菜。

GABA（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%）、異硫氰酸苯酯（phenylisothiocyanate，PITC） 美國(guó)Sigma公司；乙腈、乙酸和三乙胺（均為色譜純） 美國(guó)TEDIA公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基[29]：各成分用量分別為蛋白胨10.0 g/L、牛肉膏10.0 g/L、酵母膏5.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、吐溫80 1.0 g/L、檸檬酸銨2.0 g/L、乙酸鈉5.0 g/L、MgSO40.1 g/L、MnSO40.05 g/L、K2HPO42.0 g/L、谷氨酸一鈉（monosodium glutamate，MSG）10.0 g/L。

GYP培養(yǎng)基[16]：各成分用量分別為葡萄糖10.0 g/L、酵母膏10.0 g/L、蛋白胨5.0 g/L、乙酸鈉2.0 g/L、MgSO4·7H2O 20.0 mg/L、MnSO4·4H2O 1.0 mg/L、FeSO4·7H2O 1.0 mg/L、NaCl 1.0 mg/L、MSG 10.0 g/L。

TYG培養(yǎng)基[30]：各成分用量分別為胰蛋白胨5.0 g/L、酵母膏5.0 g/L、葡萄糖10.0 g/L、MSG 10.0 g/L。

PSB培養(yǎng)基[8]：各成分用量分別為蛋白胨15.0 g/L、牛肉膏12.5 g/L、蔗糖12.5 g/L、檸檬酸銨2.0 g/L、乙酸鈉5.0 g/L、K2HPO41.03 g/L、CaCl22.12 g/L、吐溫80 1.0 g/L、MSG 10.0 g/L。

培養(yǎng)基pH值均調(diào)節(jié)到6.8，配制100 mL于250 mL三角瓶中，121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

1200 Series高效液相色譜儀（配置G1354A四元梯度泵、G1316A柱溫箱、G1314B可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器、Chemstation工作站等） 美國(guó)Agilent公司；PSH-200生化培養(yǎng)箱 中科生命科技股份有限公司；Centrifuge 5804R冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；VX-200旋渦混合儀美國(guó)Labnet公司；AUW120電子分析天平 日本Shimadzu公司。

1.3 方法

1.3.1 種子液的制備

從4 ℃保藏的E. faecium LNSF2斜面挑取1 環(huán)，接入PSB培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h，然后按1%（體積分?jǐn)?shù)，下同）的接種量接入PSB培養(yǎng)基，于37 ℃靜置培養(yǎng)12 h作為種子液。

1.3.2 E. faecium LNSF2發(fā)酵

將E. faecium LNSF2種子液按2%的接種量分別接入實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基，各接種9 瓶，于37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，作為發(fā)酵醪。發(fā)酵結(jié)束后，按同種培養(yǎng)基隨機(jī)分成3 組，每組3 瓶，分別將同組的發(fā)酵醪合并，每組3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，每個(gè)平行300 mL發(fā)酵醪。

1.3.3 不同培養(yǎng)基對(duì)E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的影響

分別以文獻(xiàn)報(bào)道用于研究Lactobacillus plantarum[29]、L. brevis[16]、Lactococcus lactis[30]和Streptococcus salivarius subsp. thermophilus[8]產(chǎn)GABA或GAD的MRS[29]、GYP[16]、TYG[30]和PSB[8]培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，比較等體積發(fā)酵醪菌體的GAD活力。發(fā)酵按照1.3.2節(jié)方法進(jìn)行。

1.3.4 雙向單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

正向單因素試驗(yàn)培養(yǎng)基設(shè)計(jì)：以PSB培養(yǎng)基中的蛋白胨15 g/L、牛肉膏12.5 g/L和蔗糖12.5 g/L作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加CaCl22.12 g/L、K2HPO41.03 g/L、檸檬酸銨2.0 g/L、乙酸鈉5.0 g/L、吐溫80 1.0g/L、MSG 10.0g/L作為實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基。以僅由蛋白胨、牛肉膏和蔗糖組成的基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為對(duì)照組的培養(yǎng)基。

反向單因素試驗(yàn)培養(yǎng)基設(shè)計(jì)：以PSB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別去除配方中的CaCl2、K2HPO4、檸檬酸銨、乙酸鈉、吐溫80、MSG作為實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基。以PSB培養(yǎng)基作為對(duì)照組的培養(yǎng)基。

培養(yǎng)基均調(diào)節(jié)pH 6.8，分裝100 mL于250 mL三角瓶，121 ℃滅菌15 min。發(fā)酵方法按照1.3.2節(jié)進(jìn)行。

1.3.5 田口試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在雙向單因素優(yōu)化結(jié)果基礎(chǔ)上，選擇用量較大的蛋白胨、牛肉膏、蔗糖、乙酸鈉和MSG為主要影響因素，以原PSB相應(yīng)因素的20%為步長(zhǎng)，采用Minitab 15軟件選擇田口試驗(yàn)設(shè)計(jì)法進(jìn)行優(yōu)化，田口試驗(yàn)設(shè)計(jì)法的因素與水平見表1。各組試驗(yàn)培養(yǎng)基中非考察因素吐溫80的用量均為1.0 g/L，初始pH值為6.8，分裝100 mL于250 mL三角瓶，121 ℃滅菌15 min。發(fā)酵方法按照1.3.2節(jié)進(jìn)行。田口試驗(yàn)分析采用2 批次的重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果作為響應(yīng)值，選擇望大法分析均值和信噪比，從而選擇各因素的最優(yōu)水平。

表1 田口試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table1 Level and code of independent variables used for Taguchi design g/L

1.3.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

分別以原PSB培養(yǎng)基及經(jīng)田口試驗(yàn)優(yōu)化的改良PSB培養(yǎng)基作為培養(yǎng)基，按照1.3.2節(jié)的發(fā)酵方法進(jìn)行發(fā)酵。比較不同培養(yǎng)基對(duì)屎腸球菌的產(chǎn)GAD能力。培養(yǎng)基的pH值均為6.8，裝液量均為100 mL于250 mL三角瓶，滅菌條件為121 ℃滅菌15 min。

1.3.7 GAD活力測(cè)定

將300 mL發(fā)酵醪于4 ℃、8 500 r/min離心20 min，收集菌體。分別在含菌體的離心管中加入50 mL生理鹽水，混勻，然后于4 ℃、8 500 r/min離心20 min，收集菌體。分別加入15 mL 0.2 mol/L乙酸-乙酸鹽緩沖液（pH 4.4），冰浴中500 W超聲波破碎3 min（工作5 s，間隔5 s），作為粗酶液。

取粗酶液1 mL，加入1 mL 0.2 mol/L MSG溶液（0.2 mol/L、pH 4.4乙酸-乙酸鹽緩沖液），混勻后于40 ℃水浴恒溫反應(yīng)6 h，立即加入-20 ℃預(yù)冷的無水乙醇8 mL，混勻，取1.0 mL于4 ℃、14 000 r/min離心15 min，收集上清液作為酶反應(yīng)終止液。以1 mL不含MSG的0.2 mol/L乙酸-乙酸鹽緩沖液（pH 4.4）替代底物按同樣操作獲得的反應(yīng)液作為空白對(duì)照。

將酶反應(yīng)終止液經(jīng)適當(dāng)稀釋后，采用高效液相色譜法測(cè)定GABA含量。

GAD活力單位定義為：在上述測(cè)定條件下1 h生成1 μmol GABA所需要的酶量為1 個(gè)酶活力單位（U）。以300 mL發(fā)酵醪的菌體GAD總活力作為各實(shí)驗(yàn)條件下產(chǎn)GAD的響應(yīng)值。GAD總活力的計(jì)算見下式：

式中：A為實(shí)驗(yàn)組酶反應(yīng)終止液GABA濃度/（μmol/mL）；B為測(cè)定實(shí)驗(yàn)組反應(yīng)終止液GABA濃度時(shí)樣品的稀釋倍數(shù)；C為空白組酶反應(yīng)終止液GABA濃度/（μmol/mL）；D為測(cè)定空白組反應(yīng)終止液GABA濃度時(shí)樣品的稀釋倍數(shù)；5為無水乙醇終止酶反應(yīng)產(chǎn)生的稀釋倍數(shù)；2為酶反應(yīng)液的總體積/mL；15為以300 mL發(fā)酵醪的菌體所制備的GAD酶液總體積/mL；6為酶反應(yīng)時(shí)間/h。

1.3.8 GAD反應(yīng)終止液GABA測(cè)定

1.3.8.1 色譜條件

參照文獻(xiàn)[31]，略有改變。色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；進(jìn)樣量20 μL，柱溫25 ℃。采用流動(dòng)相A與流動(dòng)相B體積比80∶20，以0.6 mL/min線性等梯度洗脫。流動(dòng)相A：稱取8.205 g乙酸鈉，溶于900 mL超純水，加入三乙胺0.5 mL、乙酸0.7 mL和乙腈 5.0 mL，調(diào)節(jié)至pH 5.8，定容至1 000 mL。流動(dòng)相B：60%乙腈溶液。

1.3.8.2 衍生化方法

衍生化方法參照文獻(xiàn)[32]，略作改進(jìn)。取100 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液或GAD反應(yīng)終止液注入1.5 mL的錐形離心管，加入50 μL乙腈-水-三乙胺-PITC（7∶1∶1∶1，V/V），混勻，室溫下放置1 h 后，加入150 μL流動(dòng)相A-流動(dòng)相B（80∶20，V/V），旋渦混合器振蕩1 min，然后加入600 μL正己烷，旋渦混合器振蕩1 min，靜置10 min。用注射器吸取下層溶液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾備測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

雙向單因素試驗(yàn)結(jié)果采用IBM SPSS Statistics 19.0軟件以獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，田口試驗(yàn)結(jié)果采用Minitab 15軟件選擇田口試驗(yàn)設(shè)計(jì)法分析工具進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的影響

圖1 不同培養(yǎng)基對(duì)E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的影響Fig. 1 Effect of different media on GAD production

從圖1可知，PSB培養(yǎng)基最有利于E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD，總活力為（249.96±14.54）U。經(jīng)t檢驗(yàn)，E. faecium LNSF2在MRS、GYP和TYG培養(yǎng)基中產(chǎn)GAD活力與其在PSB培養(yǎng)基中產(chǎn)GAD活力差異極顯著（P＜0.01），因此選擇PSB培養(yǎng)基作為E. faecium LNSF2的產(chǎn)酶培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。

2.2 雙向單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 CaCl2對(duì)E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的影響

圖2 CaCl2對(duì)E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的影響Fig. 2 Effect of CaCl2 on GAD production

由圖2可知，在正向單因素試驗(yàn)中，添加CaCl2實(shí)驗(yàn)組的GAD總活力為（135.48±8.52）U，低于對(duì)照組的GAD總活力（203.52±9.34）U，經(jīng)t檢驗(yàn)分析，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異極顯著（P＜0.01），說明CaCl2對(duì)E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD不利。在反向單因素試驗(yàn)中，去除CaCl2實(shí)驗(yàn)組的GAD總活力為（311.98±11.43）U，高于對(duì)照組的GAD總活力（257.64±10.48）U，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異極顯著（P＜0.01），結(jié)果也表明CaCl2對(duì)E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD不利。因此，綜合正向和反向單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇不添加CaCl2。

2.2.2 K2HPO4對(duì)E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的影響

圖3 K2HPO4對(duì)E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的影響Fig. 3 Effect of K2HPO4 on GAD production

由圖3可知，添加K2HPO4實(shí)驗(yàn)組的GAD總活力為（119.67±6.82）U，低于對(duì)照組的GAD總活力（195.71±8.63）U，經(jīng)t檢驗(yàn)分析，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異極顯著（P＜0.01），說明K2HPO4對(duì)E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD不利。雖然實(shí)驗(yàn)組去除K2HPO4后，GAD總活力為（268.09±10.38）U，略高于對(duì)照組的GAD總活力（251.83±11.31）U，但是t檢驗(yàn)表明實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組無顯著性差異（P＞0.05），結(jié)果表明K2HPO4對(duì)E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD影響不大。

從結(jié)果分析可見，正反兩向的單因素試驗(yàn)結(jié)果并不顯著。由于反向單因素試驗(yàn)中，培養(yǎng)基組分多，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的培養(yǎng)基中均存在CaCl2，K2HPO4容易同CaCl2形成磷酸鹽沉淀，從而減弱了對(duì)照組中K2HPO4對(duì)E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的不利影響；而且實(shí)驗(yàn)組去除K2HPO4后，CaCl2無法再通過形成磷酸鹽沉淀而消除，從而造成CaCl2對(duì)E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的影響作用增強(qiáng)。

圖4 K2HPO4和CaCl2對(duì)E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的綜合影響Fig. 4 Combined impact of K2HPO4 and CaCl2 on GAD production

為了驗(yàn)證上述分析的正確性，參照反向單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)思路，同時(shí)去除PSB培養(yǎng)基的CaCl2和K2HPO4進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，由圖4可知，實(shí)驗(yàn)組GAD總活力為（332.17±8.13）U，較對(duì)照組、只含K2HPO4和CaCl2之一實(shí)驗(yàn)組的GAD總活力均顯著提高（P＜0.05）。因此考慮CaCl2與K2HPO4的關(guān)系，采信正向單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選擇不添加K2HPO4。

2.2.3 檸檬酸銨對(duì)E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的影響

圖5 檸檬酸銨對(duì)E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的影響Fig. 5 Effect of ammonium citrate on GAD production

由圖5可知，添加檸檬酸銨實(shí)驗(yàn)組GAD總活力為（101.42±3.18）U，低于對(duì)照組GAD總活力（186.55±10.12）U，經(jīng)t檢驗(yàn)分析，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異極顯著（P＜0.01），說明檸檬酸銨對(duì)E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD不利。然而，反向單因素試驗(yàn)結(jié)果卻顯示，去除PSB培養(yǎng)基的檸檬酸銨后，GAD總活力只有（215.94±10.38）U，低于含有檸檬酸銨對(duì)照組（249.72±10.33）U（P＜0.05），與正向單因素試驗(yàn)結(jié)果矛盾。

上述結(jié)果表明CaCl2對(duì)E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD不利，在原PSB培養(yǎng)基的配方中同時(shí)存在著檸檬酸銨和CaCl2，由于檸檬酸酸根對(duì)金屬離子具有一定的螯合作用，可能檸檬酸銨與Ca2＋形成螯合物，從而可減小檸檬酸銨和CaCl2對(duì)E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD不利影響；去除檸檬酸銨后，造成CaCl2的負(fù)面作用突顯，從而造成E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD能力下降。在正向單因素試驗(yàn)中，培養(yǎng)基不存在CaCl2的影響，檸檬酸銨對(duì)E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的影響更直接，結(jié)果更可信，因此采信正向單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇不添加檸檬酸銨。

2.2.4 乙酸鈉對(duì)E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的影響

圖6 乙酸鈉對(duì)E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的影響Fig. 6 Effect of sodium acetate on GAD production

由圖6可知，在正向單因素試驗(yàn)結(jié)果中，添加乙酸鈉實(shí)驗(yàn)組的GAD總活力為（218.78±7.91）U，高于對(duì)照組的GAD總活力（186.55±10.12）U，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組有顯著性差異（P＜0.05）；在反向單因素試驗(yàn)結(jié)果中，去除乙酸鈉實(shí)驗(yàn)組的GAD總活力為（124.51±6.84）U，低于對(duì)照組的GAD總活力（249.72±10.33）U，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異極顯著（P＜0.01）。正反雙向的單因素結(jié)果均表明培養(yǎng)基中添加乙酸鈉更有利于E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD，因此選擇添加乙酸鈉。

2.2.5 吐溫80對(duì)E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的影響

圖7 吐溫80對(duì)E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的影響Fig. 7 Effect of Tween 80 on GAD production

由圖7可知，在正向單因素試驗(yàn)結(jié)果中，添加吐溫80實(shí)驗(yàn)組GAD總活力為（208.52±7.63）U，高于對(duì)照組GAD總活力（181.46±9.71）U，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05）；在反向單因素試驗(yàn)結(jié)果中，去除吐溫80實(shí)驗(yàn)組GAD總活力為（223.26±8.22）U，低于對(duì)照組GAD總活力（251.37±7.86）U，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05）。正反雙向的單因素試驗(yàn)結(jié)果均表明培養(yǎng)基中添加吐溫80更有利于E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD，因此選擇添加吐溫80。

2.2.6 MSG對(duì)E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的影響

圖8 MSG對(duì)E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的影響Fig. 8 Effect of MSG on GAD production

由圖8可知，在正向單因素試驗(yàn)結(jié)果中，添加MSG實(shí)驗(yàn)組GAD總活力為（196.77±8.14）U，顯著高于對(duì)照組GAD總活力（171.12±6.68）U（P＜0.05）；在反向單因素試驗(yàn)中，去除MSG實(shí)驗(yàn)組GAD總活力為（173.22±6.58）U，顯著低于對(duì)照組GAD總活力（247.36±8.35）U（P＜0.01）。結(jié)果表明培養(yǎng)基中添加MSG有利于E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD，因此選擇添加MSG。

2.3 田口試驗(yàn)結(jié)果

田口試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。采用田口分析的望大法對(duì)各因素水平的均值情況和信噪比情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示各因素的均值殘差（圖9）和信噪比殘差（圖10）與模型擬合性較好，符合正態(tài)分布。

表2 田口試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table2 Taguchi design matrix with experimental values of GAD activity

圖9 均值殘差正態(tài)概率圖Fig. 9 Normal probability pot for mean residual

圖10 信噪比殘差正態(tài)概率圖Fig. 10 Normal probability pot for residual of signal-to-noise ratio

表3 所選因素水平的均值響應(yīng)Table3 Mean response of factors

表4 均值方差分析Table4 Analysis of variance of mean values

表5 所選因素水平的信噪比響應(yīng)Table5 Signal-to-noise ratio response of factors

表6 信噪比方差分析Table6 Analysis of variance of signal-to-noise ratio

由表3可知，各因素的均值響應(yīng)情況為D＞A＞E＞C＞B；由表4可知，A、B、C、D、E均為極顯著因素（P＜0.01）。由表5可知，各因素信噪比響應(yīng)情況也為D＞A＞E＞C＞B；從表6可知，A、C、D和E為極顯著因素（P＜0.01），B為不顯著因素（P＞0.10）。

因此，綜合考慮影響均值和信噪比的顯著性因素，確定A、C、D和E為位置因素，B為散度因素。首先根據(jù)圖11選擇位置因素的水平使均值最大，即A2C2D3E2，再根據(jù)圖12選擇非位置因素的散度因素B的第1水平，使散度最小化，即B1，最終得出最優(yōu)培養(yǎng)基的組合為A2B1C2D3E2，與非考察因素吐溫80（1.0 g/L）即可得出優(yōu)化后的PSB培養(yǎng)基（稱為改良PSB培養(yǎng)基）組成為蛋白胨15 g/L、牛肉膏10 g/L、蔗糖 12.5 g/L、乙酸鈉6.0 g/L、MSG 10 g/L、吐溫80 1.0 g/L。

圖11 均值主效應(yīng)圖Fig. 11 Main effect of mean values

圖12 信噪比主效應(yīng)圖Fig. 12 Main effect of signal-to-noise ratio

2.4 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將優(yōu)化的主要因素的最優(yōu)水平A2B1C2D3E2采用軟件中的“預(yù)測(cè)田口結(jié)果”功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)果GAD總活力均值為399.30 U，標(biāo)準(zhǔn)差為12.51 U。

以經(jīng)田口優(yōu)化的改良PSB培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果GAD總活力為（384.26±10.32）U，與預(yù)測(cè)值接近。經(jīng)t檢驗(yàn)，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)值沒有顯著性差異（P＞0.05）。

當(dāng)以原PSB培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，GAD總活力僅為（263.71±9.37）U。采用優(yōu)化后的改良PSB培養(yǎng)基發(fā)酵制備的GAD總活力較優(yōu)化前的PSB培養(yǎng)基提高了45.71%。從表7可知，改良PSB培養(yǎng)基的組分顯著減少，成本更低，配制更簡(jiǎn)捷。

表7 優(yōu)化前后PSB的配方Table7 PSB medium components before and after optimization

3 討 論

單因素試驗(yàn)法可針對(duì)性地考察某一因素的作用，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種因素篩選的研究中。然而，由于傳統(tǒng)單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)是在基礎(chǔ)條件上單向增加或減少某一因素，未考慮因素間的交互作用，容易產(chǎn)生因改變某一因素而致使與之存在交互作用的另一因素的作用凸顯，從而導(dǎo)致誤判。這種情況在多因素共存的研究中尤為普遍。在多因素共存的情況下，各因素功能不同，可能是有利的或有害作用，而有的因素則本身的作用既無益也無害，但可能與其他因素發(fā)生作用而表現(xiàn)出有益或有害的影響。在多因素共存的系統(tǒng)中，甚至可能存在有害因素之間發(fā)生多種形式的相互作用，從而產(chǎn)生有益的表觀現(xiàn)象或表觀參數(shù)。例如，本實(shí)驗(yàn)中CaCl2和K2HPO4對(duì)屎腸球菌LNSF2產(chǎn)GAD都是不利的，但是二者卻可發(fā)生反應(yīng)形成磷酸鹽沉淀，從而減弱彼此的有害作用。如果試驗(yàn)只是考察單一方向上的增加或去除CaCl2或K2HPO4，則會(huì)因改變了原有交互作用而產(chǎn)生誤判。

乳酸菌GAD與細(xì)胞生長(zhǎng)的耐酸機(jī)制有關(guān)，可在酸性條件下誘導(dǎo)合成[33]。屎腸球菌是一種乳酸菌，在其生長(zhǎng)代謝過程中因產(chǎn)酸而造成培養(yǎng)基pH值下降，從而對(duì)其生長(zhǎng)和GAD的誘導(dǎo)合成產(chǎn)生影響。乙酸-乙酸鈉緩沖液在pH 3.6～5.8范圍內(nèi)具有較好的緩沖能力，乙酸鈉在培養(yǎng)基中可以起到緩沖鹽的作用，能在更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)維持培養(yǎng)基的偏酸性環(huán)境，對(duì)菌體生長(zhǎng)和GAD合成更為有利。吐溫80是一種表面活性劑，能起到乳化劑作用，可增加培養(yǎng)基的均勻性和細(xì)胞膜的通透性，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。GAD是一種誘導(dǎo)酶，楊勝遠(yuǎn)等[34]在唾液鏈球菌嗜熱亞種Y-2產(chǎn)GAD影響因素的研究表明，添加MSG對(duì)GAD的合成并沒有明顯的誘導(dǎo)作用，而本研究結(jié)果表明添加MSG有利于屎腸球菌產(chǎn)GAD。由此可見，培養(yǎng)基中添加MSG對(duì)唾液鏈球菌嗜熱亞種和屎腸球菌產(chǎn)GAD的影響不同，其原因可能是：1）培養(yǎng)基中的蛋白胨和牛肉膏中存在L-谷氨酸，不同微生物對(duì)蛋白胨和牛肉膏的水解活性、蛋白酶的作用位點(diǎn)以及細(xì)胞對(duì)水解形成的L-谷氨酸利用情況不一致，從而導(dǎo)致起誘導(dǎo)作用的游離L-谷氨酸在培養(yǎng)基中的濃度存在差異，因而誘導(dǎo)能力存在差異；2）不同微生物合成GAD的底物誘導(dǎo)作用與底物濃度有一定相關(guān)性。具體誘導(dǎo)機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。上述分析表明，乙酸鈉、吐溫80和MSG對(duì)屎腸球菌產(chǎn)GAD是有利的，這在本研究的雙向單因素試驗(yàn)中也得到了證實(shí)，理論分析與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

楊勝遠(yuǎn)等[35]在解淀粉芽孢桿菌抗菌物質(zhì)發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化中設(shè)計(jì)了雙向單因素試驗(yàn)法，在判斷MgSO4對(duì)解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)抗菌物質(zhì)作用方面起到了至關(guān)重要的作用。本實(shí)驗(yàn)采用雙向單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，也成功突破了CaCl2、K2HPO4和檸檬酸銨組分因交互作用而產(chǎn)生的假象。本實(shí)驗(yàn)再次表明，雖然雙向單因素試驗(yàn)法會(huì)增加實(shí)驗(yàn)組數(shù)，增加工作量，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果能夠起到相互驗(yàn)證的作用，更有利于對(duì)因素作用作出正確判斷，是一種非常有效的因素篩選方法。

田口法是田口玄一于20世紀(jì)50年代初在費(fèi)歇爾多元配制法試驗(yàn)設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上開發(fā)的正交試驗(yàn)技術(shù)，研究表明該方法高效、穩(wěn)健[36-38]。本實(shí)驗(yàn)采用雙向單因素試驗(yàn)法結(jié)合田口法，在PSB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上對(duì)屎腸球菌產(chǎn)GAD培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明培養(yǎng)基組分減少而GAD總活力顯著提高，說明采用的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法合理、可靠。

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