束文秀，吳祖芳*，劉連亮，翁佩芳

（寧波大學(xué)海洋學(xué)院，應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點實驗室，浙江 寧波 315211）

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胡柚、白砂糖 市售；MRS固體培養(yǎng)基、MRS液體培養(yǎng)基 杭州微生物試劑有限公司；植物乳桿菌L1（Lactobacillus plantarum L1，Lp L1）、發(fā)酵乳桿菌L2（L. fermentum L2，Lf L2）由寧波大學(xué)海洋學(xué)院食品生物技術(shù)實驗室保存。

1.2 儀器與設(shè)備

MX-GX1011攪拌機 廈門建松電器有限公司；5417R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；QP-2010 Plus GC-MS聯(lián)用儀 日本島津公司；SPME裝置、二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取纖維頭 美國Supelco公司；微量進樣器（10 μL）美國安捷倫公司；GC-O嗅探器 荷蘭ATAS&GL公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的處理

挑選新鮮無蟲害的胡柚并清洗表面雜質(zhì)，90 ℃水中煮10 min，再將煮過的胡柚去皮，去囊衣，去籽，得胡柚果肉，加水榨汁，經(jīng)過濾獲得胡柚汁；向胡柚汁中添加白砂糖攪拌均勻，90 ℃滅菌15 min，冷卻至25 ℃；將不同乳酸菌發(fā)酵菌劑按3%接種后發(fā)酵，37 ℃發(fā)酵36 h；然后置于8 ℃冰箱中靜置12 h進行后熟，得到樣品。樣品分別為對照組（未接菌）、發(fā)酵組1（Lp L1）、發(fā)酵組2（Lf L2）、發(fā)酵組3（Lp L1∶Lf L2=1∶1）。

1.3.2 HS-SPME測定

將50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭在GC進樣口老化，老化溫度為270 ℃，載氣體積流量為1.2 mL/min，老化時間為1 h。準(zhǔn)確移取10 mL樣品于25 mL螺口進樣瓶中，加入3.6 g NaCl，促進香氣成分的揮發(fā)，用聚四氟乙烯隔墊密封，于水浴鍋中平衡，平衡溫度為40 ℃，平衡時間為15 min。平衡后將SPME萃取頭通過隔墊插入進樣瓶，插入深度為1 cm，推出纖維頭，使纖維頭置于樣品瓶頂空進行吸附，吸附時間為40 min，隨后取出萃取頭，并立即將萃取頭插入GC儀的進樣口，插入深度為2 cm，推出纖維頭，解吸5 min，同時啟動儀器收集數(shù)據(jù)。

1.3.3 GC-MS聯(lián)用分析

GC條件：HP-5（5% diphenyl-95% dimethlpolysiloxane）彈性石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；He流量為1.2 mL/min；無分流進樣；進樣口溫度250 ℃；升溫程序：起始柱溫40 ℃，保持3 min，以3 ℃/min的速率升到160 ℃，保持2 min，然后以8 ℃/min的速率升至220 ℃，保持3 min[27]。

MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；燈絲發(fā)熱電流0.25 mA；電子倍增器電壓1 000 V；離子源溫度230 ℃；接口溫度280 ℃；質(zhì)量掃描范圍35～350 u。

1.3.4 電子鼻測定條件

徐天水今年六十多歲，是大徐莊老住戶。老兩口就一閨女，十幾年前到蘇州打工，談個外縣小伙子，徐天水死活不同意，誰知閨女更倔，硬是跟人跑了，讓徐天水在莊上挺丟人。老伴兒本來就是病病歪歪的，這下氣得更是成了藥罐子。

量取2 mL胡柚汁樣品于10 mL樣品瓶中，并加入用保鮮膜密封，靜置10 min后測量。采用頂空抽樣的方法用電子鼻進行檢測，檢測時間250 s，傳感器清洗時間200 s，電子鼻傳感器及其性能見表1。用穩(wěn)定狀態(tài)下的信號進行分析，取70 s的信號作為電子鼻分析的時間點。每個樣品重復(fù)5 次。

表1 電子鼻對不同物質(zhì)的響應(yīng)類型Table1 Chemical sensors used in electronic nose corresponding to different types of volatile substances

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

定性方法：揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分實驗數(shù)據(jù)處理由GC-MS分析軟件系統(tǒng)完成，通過計算機譜庫（NIST/STEROL/Wiley）進行化合物的質(zhì)譜鑒定，再結(jié)合文獻進行人工譜圖解析，檢測出揮發(fā)性成分匹配度大于85（最大值為100）的化合物，確定揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的各個化學(xué)組成。定量方法：按峰面積歸一化進行相對定量，計算揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對含量。利用SPSS 19.0對揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)數(shù)據(jù)進行主成分分析。電子鼻的數(shù)據(jù)利用PEN3內(nèi)部Win Muster軟件進行線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌發(fā)酵胡柚汁色譜分析與風(fēng)味種類分析

圖1 不同胡柚汁樣品的總離子流圖Fig. 1 Total ion current (TIC) chromatograms of grapefruit juice samples

利用HS-SPME-GC-MS對不同的胡柚汁樣品（對照組、發(fā)酵組1、發(fā)酵組2、發(fā)酵組3）進行分析，對總離子流色譜圖，如圖1所示，結(jié)合文獻最終確定各揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，面積歸一化法計算各物質(zhì)的相對含量，結(jié)果如表2所示。

表2 胡柚汁樣品揮發(fā)性成分的鑒定結(jié)果Table2 Identification of the volatile components of grapefruit juice samples

續(xù)表2

如圖1所示，與對照組的總離子圖相比，接入不同菌種發(fā)酵胡柚汁的色譜圖區(qū)分明顯。3 種乳酸菌發(fā)酵樣品共鑒定出79 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)（表2），其中醇類20 種、烯烴類15 種、烷烴類12 種、酮類10 種、醛類5 種、酯類2 種、其他類15 種，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分別為59、36 種和35種。從揮發(fā)性成分種類的數(shù)量來看，胡柚汁經(jīng)不同乳酸菌接種發(fā)酵后揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類均增加，如圖2所示，與對照組相比，接種Lf L2揮發(fā)性物質(zhì)增加了3 個，接種混菌增加了2 個，增幅并不大。從揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類來看，與對照組相比，檢測到了新的種類為酯類化合物。

圖2 乳酸菌發(fā)酵胡柚汁揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對含量（A）和種類（B）Fig. 2 Volatile flavor composition of fermented grapefruit juice

2.2 乳酸菌發(fā)酵胡柚汁揮發(fā)性風(fēng)味組分相對含量變化

由表2和圖2可以看出，胡柚汁經(jīng)接種乳酸菌Lp L1發(fā)酵后，烷烴類化合物的總相對含量大量增加，達到33.48%，是對照組的33 倍，其中對照組中微量存在的八甲基環(huán)四硅氧烷相對含量增加顯著，相對含量達11.09%；檢測到許多對照組中未被檢測到的烷烴類物質(zhì)，其中相對含量較高的為十甲基環(huán)五硅氧烷（11.00%）、六甲基環(huán)三硅氧烷（4.98%）和十二甲基環(huán)六硅氧烷（3.98%）；而對照組中相對含量最高的十一烷未被檢測到。醇類化合物總相對含量大量增加，是對照組的11倍，其中L-香芹醇相對含量提高至3.29%，其他共有成分相對含量均提高到一半以上，同時檢測到大量新的醇類化合物，其相對含量較高的為正己醇（2.53%）、柏木烯醇（1.32%）、1-庚醇（0.91%）和1-壬醇（0.68%），對照組中存在的β-小茴香醇未被檢測到。酮類化合物總相對含量大量增加，其中包括相對含量較高的新酮類物質(zhì)如甲基壬基甲酮（0.79%）、6-甲基-5-庚烯-2-酮（0.57%）和2-壬酮（0.45%），對照組中相對含量最高的1-戊烯-3-酮相對含量降低至0.40%，而對照組中存在的甲基庚烯酮和右旋香芹酮未被檢測到。烯烴類化合物的總相對含量大幅降低了52.96%，其中對照組中相對含量最高的左旋檸檬烯相對含量降低至26.96%，松油烯相對含量降低至1.01%，并出現(xiàn)了新的烯烴類物質(zhì)苯乙烯和（E）-2,2-甲基-4-癸烯。醛類化合物的總相對含量降低了9.05%，2,4-戊二烯醛在對照組中相對含量最高，經(jīng)Lp L1發(fā)酵后相對含量降低至0.07%，對照組中存在的除2,4-戊二烯醛和壬醛外均未被檢測到，檢測到對照組中不存在的苯甲醛。酯類化合物的總相對含量達到1.88%，其中甲酸甲酯（1.76%）的相對含量最高。其他類的總相對含量降低了0.09%，與對照組較為接近，其中甲基異丙基苯相對含量最高，與對照組相比，相對含量降低到1.46%。

Lf L2以及混菌接種后發(fā)酵汁中的風(fēng)味成分相似，但與對照組和接種Lp L1發(fā)酵相比，風(fēng)味物質(zhì)差異顯著。烯烴類化合物總相對含量最高，與對照組相比，Lf L2和混菌接種分別降低了2.23%和2.24%，胡柚汁原料本身的特征烯烴類風(fēng)味物質(zhì)左旋檸檬烯、松油烯、月桂烯均被檢測到。醇類物質(zhì)的總相對含量僅次于烯烴類化合物，2 種樣品的增幅都在4%的范圍內(nèi)，經(jīng)Lf L2發(fā)酵后出現(xiàn)新的醇類物質(zhì)順-2-己烯-1-醇和順香芹醇，這2 個物質(zhì)在Lp L1的發(fā)酵液中并未發(fā)現(xiàn)，混菌發(fā)酵液中存在Lf L2發(fā)酵液中不存在的環(huán)己醇。烷烴類化合物的總相對含量也顯著提高，分別為4.58%和3.90%，其中4 種樣品中所共有的八甲基環(huán)四硅氧烷相對含量最高，分別達到2.23%和2.16%，與另外2 個樣品比較相對含量差別較大；六甲基環(huán)三硅氧烷和十甲基環(huán)五硅氧烷在對照組中未被檢測到，而在Lp L1、Lf L2以及混菌發(fā)酵組中有檢測到，且相對含量均在0.5%以上。酮類化合物相對含量增加，除3-辛酮、甲基庚烯酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮和左旋香芹酮外，其他檢測到的物質(zhì)與Lp L1發(fā)酵組相似，1-戊烯-3-酮是4 種樣品所共有的，其相對含量在Lf L2以及混菌發(fā)酵組中均有所降低。醛類化合物相對含量分別降低了9.05%和9.65%。總體來看，乳酸菌發(fā)酵胡柚汁樣品中醛類物質(zhì)相對含量大量降低，醇類、酮類和烷烴類相對含量顯著提高。與對照組相比，乳酸菌發(fā)酵后的胡柚汁的風(fēng)味物質(zhì)更加豐富。

2.3 主成分分析結(jié)果

利用SPSS 19.0軟件對4 種胡柚汁樣品中的91 種揮發(fā)性風(fēng)味化合物進行主成分分析，所得的主成分的特征值和貢獻率如表3所示，所得的載荷矩陣圖如圖3所示。

表3 3 個主成分的特征值和貢獻率Table3 Eigenvalues of three principal components and their variance contributions and cumulative contributions

圖3 主成分載荷矩陣圖Fig. 3 PCA loading plot

以91 種風(fēng)味物質(zhì)的第1主成分載荷值為橫坐標(biāo)，第2主成分的載荷值為縱坐標(biāo)，由圖3可知，第1主成分中正影響揮發(fā)性物質(zhì)載荷系數(shù)達到0.9以上有39 種，主要為醇類、烷烴類和酯類，這些成分與第1主成分有高的相關(guān)性，八甲基環(huán)四硅氧烷（0.999）、6-異丙烯基-3-甲基-1-環(huán)己烯-1-醇（0.993）、L-香芹醇（0.991）、六甲基環(huán)三硅氧烷（0.989）是第1主成分中正影響揮發(fā)性物質(zhì)的典型代表；負影響揮發(fā)物質(zhì)載荷系數(shù)達到0.9以上有10 種，大部分為烯烴類，甲基異丙基苯（0.999）、月桂烯（0.995）、左旋檸檬烯（0.995）、松油烯（0.993）是第1主成分中負影響揮發(fā)性物質(zhì)的典型代表。第2主成分中載荷較高的正影響揮發(fā)性物質(zhì)主要為醛類，壬醛（0.989）、1-戊烯-3-酮（0.971）、2,4-戊二烯醛（0.883）較高，與第2主成分有高度相關(guān)性；負影響揮發(fā)物質(zhì)載荷較高的主要為酮類，其中2-庚酮（0.939）、2-壬酮（0.936）、左旋香芹酮（0.897）較高。第1主成分代表烯烴類、酯類、烷烴類、醇類和其他類，第2主成分代表酮類和醛類，將影響胡柚汁樣品風(fēng)味的7 種物質(zhì)降維到2 種主成分。烯烴類是4 種樣品所共有的，主要集中在第2、3象限內(nèi)，是對照組、Lf L2和混菌發(fā)酵組中相對含量最高的揮發(fā)性成分。醛類主要集中在第3象限內(nèi)，在對照組中相對含量僅次于烯烴類。除烯烴類外，Lp L1、Lf L2和混菌發(fā)酵胡柚汁的主要揮發(fā)性成分烷烴類和醇類，大部分集中在第1象限內(nèi)。發(fā)酵樣品能夠在這2 個主成分中被區(qū)分開來，Lp L1主要揮發(fā)性物質(zhì)集中在第1、2象限，Lp L2和混菌集中在第1、2、3象限，分布差異性顯著。

2.4 電子鼻分析結(jié)果

LDA是將高維的模式樣本投影到最佳鑒別矢量空間，投影后保證模式樣本在新的子空間有最小的類內(nèi)距離和最大的類間距離的一種統(tǒng)計分析方法，能夠最大限度地區(qū)分不同的樣品集，降低數(shù)據(jù)空間維度。對4 種胡柚汁樣品進行電子鼻分析，并利用電子鼻自帶軟件對數(shù)據(jù)進行LDA，如圖4所示。

圖4 電子鼻檢測的LDA圖Fig. 4 LDA plot of electronic nose data

由圖4可知，LD1和LD2的方差貢獻率分別為57.53%和17.74%，兩判別式的總貢獻率達75.27%，能較好地反映總體信息。4 種樣品無重疊部分，數(shù)據(jù)點均分布在各自的區(qū)域內(nèi)，能夠被很好地區(qū)分開來，說明電子鼻能較好地識別乳酸菌發(fā)酵胡柚汁樣品的香氣物質(zhì)，4 種樣品的香氣之間差異性顯著。從各樣品兩兩之間的橢圓距離來看，未接種的胡柚汁樣品與接種乳酸菌的樣品距離較大，說明接種乳酸菌對胡柚汁香氣的影響較大；接種Lf L2和接種混菌的距離更為接近，說明這2 種樣品的風(fēng)味更為接近，這與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的檢測結(jié)果一致。

3 討 論

乳酸菌發(fā)酵胡柚汁的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主要來源于胡柚原料的本身和乳酸菌發(fā)酵代謝的成分。烯烴類化合物閾值較低，多呈現(xiàn)果香和花香[28]，加熱易促使其分解，在3 種發(fā)酵樣品中相對含量豐富，除接種Lp L1外，與對照組相近；本實驗檢測結(jié)果左旋檸檬烯是胡柚汁原料所特有的呈味物質(zhì)，這與洪鵬等[29]研究3 種柚子精油最主要的成分均為檸檬烯和β-月桂烯的結(jié)果一致，烯烴類化合物也是發(fā)酵組的主要呈味物質(zhì)。醛類化合物多為果香及花香，閾值較低，賦予香氣能力較強[28]。高含量的醛類物質(zhì)可能會引起異味[30]。對照組中醛類物質(zhì)相對含量較高，原因可能是胡柚汁在接菌之前進行了高溫的處理，加熱過程可能導(dǎo)致醛類物質(zhì)的增加[24]，如對照組中有檢測到的戊醛具有煮熟的風(fēng)味[30]。乳酸菌發(fā)酵后代謝分解了大部分醛類物質(zhì)，Lp L1發(fā)酵組中檢測到的苯甲醛具有櫻桃味和甜味，對風(fēng)味起到加強作用。醇類通常具有芳香、植物香，其閾值一般很低，對風(fēng)味的形成有不容忽視的作用。胡柚汁發(fā)酵后醇類物質(zhì)的種類均增加，正己醇、1-庚醇是乳酸菌發(fā)酵所獨有的，接種Lp L1醇類物質(zhì)增加明顯，可能與Lp L1的代謝特性有關(guān)。醇類一般由相應(yīng)的醛通過脫氫酶催化的還原反應(yīng)形成，乳糖的代謝、甲基酮的還原、氨基酸的代謝都可生成相應(yīng)的醇，特別是在乳酸菌的作用下，這些反應(yīng)更加強烈[31-32]。酯類是一類影響風(fēng)味的重要化合物低分子質(zhì)量的酯類一般具有芳香氣味或特定水果香味[33]，發(fā)酵組均發(fā)現(xiàn)了對照組沒有的酯類物質(zhì)，這是由于酯類物質(zhì)是在乳酸菌的作用下由醇類和有機酸等生成的一類化合物[34]。酮類化合物香味優(yōu)異持久，一般貢獻花香和果香風(fēng)味[31]，其閾值要高于其同分異構(gòu)體醛，其中不飽和酮類具有較高的揮發(fā)性[29]。乳酸菌發(fā)酵后酮類物質(zhì)增加，對風(fēng)味起到加強作用，且隨著菌種不同增加的種類和相對含量不同，原因可能是酮類物質(zhì)是氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，而乳酸菌的加入對氧化反應(yīng)起到促進作用。烷烴類主要來源于脂肪酸烷氧自由基的斷裂[35]，由于香味閾值較高，對胡柚汁風(fēng)味的貢獻較小，為Lp L1發(fā)酵的主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。對樣品香氣成分的電子鼻檢測并結(jié)合LDA方法可對發(fā)酵胡柚汁樣品揮發(fā)性風(fēng)味差異性的判別，與GC-MS分析結(jié)果具有較好的互補性。

從單一菌種與混合菌種發(fā)酵產(chǎn)物差異性結(jié)果比較，個別組分在單菌種發(fā)酵未能檢出（如3-亞甲基-6-（1-甲基乙基）環(huán)己烯）而混合菌發(fā)酵中產(chǎn)生，或者在混合菌發(fā)酵中未能檢出（如2,4-戊二烯醛）而單菌種發(fā)酵中檢測到，這可能是由于不同的2 種菌其所含酶系的差異性及其代謝特性存在差別，相比單菌種發(fā)酵，混合菌發(fā)酵體系中，一種菌的代謝產(chǎn)物可能是另一種菌的代謝底物，同時也存在發(fā)酵產(chǎn)物間或發(fā)酵底物與產(chǎn)物之間等復(fù)雜的反應(yīng)。相似機理已有相關(guān)文獻報道，例如，保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的互惠共生作用，保加利亞乳桿菌代謝產(chǎn)物氨基酸為后者提供氮源，也為后者提供嘌呤類物質(zhì)和嘌呤類物質(zhì)前體[36]等?；旌暇l(fā)酵品質(zhì)組分的差異性的機制有待進一步通過基因組學(xué)、代謝組學(xué)等手段進一步闡明。

4 結(jié) 論

胡柚汁經(jīng)接種乳酸菌（Lp L1、Lf L2和混合菌）發(fā)酵后其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分別為59、36 種和35 種，揮發(fā)性風(fēng)味化合物的種類均增加，并產(chǎn)生了新的風(fēng)味物質(zhì)酯類，醛類物質(zhì)相對含量顯著降低，醇類、酮類和烷烴類相對含量顯著提高。通過乳酸菌發(fā)酵后風(fēng)味物質(zhì)得到了調(diào)整并呈現(xiàn)一定協(xié)同效應(yīng)，使胡柚汁的果香與乳酸菌的發(fā)酵香渾然一體，賦予了發(fā)酵胡柚汁獨特的風(fēng)味。主成分分析選取了2 個主成分代表4 種樣品92.53%的原始信息，其中八甲基環(huán)四硅氧烷、甲基異丙基苯、月桂烯、6-異丙烯基-3-甲基-1-環(huán)己烯-1-醇、L-香芹醇、壬醛、1-戊烯-3-酮和2-庚酮對揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對含量影響較大，找出了影響4 個樣品的特征風(fēng)味組分在主成分中的差異，表明主成分分析法可實現(xiàn)對益生菌發(fā)酵胡柚汁特征風(fēng)味差異性的評價。電子鼻分析表明乳酸菌發(fā)酵胡柚汁后風(fēng)味改變顯著，LDA能夠區(qū)分出4 種胡柚汁樣品存在顯著性差異，且不同乳酸菌發(fā)酵胡柚汁其風(fēng)味也有較顯著的差異。

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