唐 明 趙 欣 魏興軍 楊長(zhǎng)路

(天津永久醫(yī)院急診科，天津 300450)

阿爾茨海默病(AD)是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)慢性疾病，表現(xiàn)為學(xué)習(xí)、記憶能力的下降〔1〕。研究發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致老年人認(rèn)知功能障礙的危險(xiǎn)因素包括心血管疾病、中年高膽固醇血癥、代謝綜合征等因素〔2,3〕。研究〔4〕發(fā)現(xiàn)，AD患者的腦內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平發(fā)生變化，提示AD患者的認(rèn)知功能與凋亡蛋白相關(guān)。白藜蘆醇是從葡萄、虎杖等植物中提取的一種多酚類素質(zhì)，具有抗凋亡、抗腫瘤及保護(hù)心血管等作用〔5,6〕。本文探討白藜蘆醇對(duì)AD大鼠的抗凋亡機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 SPF級(jí)Wistar大鼠5只作為對(duì)照組，早老素(PS)1/淀粉樣前體蛋白(APP)雙轉(zhuǎn)基因大鼠10只隨機(jī)均分為AD組和白藜蘆醇組，動(dòng)物購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所。

1.2藥品及儀器 白藜蘆醇購(gòu)自西安百川生物科技有限公司，一抗caspase-3、 Bax 和 Bcl，IgG二抗均購(gòu)自北京中杉金橋生物有限公司。

1.3樣品制備 生理鹽水、多聚甲醛快速灌注，立即取腦，左腦固定于4%的多聚甲醛，右腦存放于-80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)大鼠腦組織caspase-3、 Bax 和 Bcl蛋白表達(dá) 70%酒精3 h→95%酒精3 h→95%酒精過夜→100%酒精脫水2次→透明(二甲苯)→浸蠟→切片(5 μm)→烤箱過夜→二甲苯脫蠟3次→脫水→抗原修復(fù)→血清封閉→滴加一抗過夜→加二抗→顯色；Western印跡法檢測(cè)caspase-3、 Bax 和 Bcl蛋白的表達(dá)水平，取出腦組織→加入磷酸鹽緩沖液(PBS)超聲波破碎→離心5 min(12 000 r/min)→取上清→十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳→電轉(zhuǎn)→封閉2 h→一抗4℃孵育過夜→二抗孵育1 h→二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行ANOVA分析。

2 結(jié) 果

2.1免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果 AD組caspase-3和Bax陽(yáng)性表達(dá)較對(duì)照組增強(qiáng)且數(shù)目顯著增加，Bcl陽(yáng)性表達(dá)顯著減弱(P<0.05)；白藜蘆醇組caspase-3和Bax陽(yáng)性表達(dá)顯著降低，Bcl陽(yáng)性表達(dá)顯著增強(qiáng)(P<0.05)。見圖1。

2.2Western印跡檢測(cè)結(jié)果 AD組較對(duì)照組腦組織內(nèi)caspase-3、 Bax蛋白水平顯著升高，Bcl蛋白水平顯著下降(P<0.05)，白藜蘆醇組caspase-3、 Bax蛋白水平顯著降低，Bcl蛋白水平顯著升高(P<0.05)。見圖2和表1。

圖1 各組腦組織caspase-3、Bax、Bcl表達(dá)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(DAB，×30)

圖2 各組腦組織caspase-3、Bax、Bcl蛋白表達(dá)

組別caspase?3BaxBcl對(duì)照組0．0048±0．0010．1071±0．0100．1903±0．025AD組0．1317±0．0311)0．2726±0．0151)0．0879±0．010白藜蘆醇組0．0516±0．0082)0．0931±0．0112)0．3164±0．0282)

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與AD組比較：2)P<0.05

3 討 論

目前，AD的發(fā)病機(jī)制尚不明了，隨著醫(yī)學(xué)進(jìn)步，醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)界出現(xiàn)了以下學(xué)說：神經(jīng)遞質(zhì)代寫障礙、β-淀粉樣蛋白、基因、金屬離子、神經(jīng)細(xì)胞凋亡等學(xué)說〔7～9〕。caspase家族是凋亡相關(guān)蛋白，當(dāng)線粒體收到損傷，線粒體通透性轉(zhuǎn)換開放，細(xì)胞色素C釋放到胞質(zhì)中，從而引起caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔10〕。Bcl是凋亡抑制基因，腦組織中Bcl蛋白表達(dá)水平降低將促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。本文提示白藜蘆醇可能通過下調(diào)促凋亡蛋白caspase-3、 Bax的水平和上調(diào)抑制凋亡蛋白Bcl水平調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)改善AD大鼠的認(rèn)知功能。

1Wang Z，Wang L，Yamamoto R，etal.Role of the lateral habenula in shaping context-dependent locomotor activity during cognitive tasks〔J〕.Neuroreport，2013;24(6)：276-80.

2Gessner G，Cui YM，Otani Y，etal.Molecular mechanism of pharmacological activation of BK channels〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2012;109(9)：3552-7.

3Zhang W，Hao J，Liu R，etal.Soluble A13 levels correlate with cogni-tive deficits in the 12.month.old APPswe/PSIdE9 mouse model of Alheimer's disease〔J〕.Behav Brain Res，2011;222(2)：342-50.

4王建平，許棟乾，趙源征，等.白藜蘆醇對(duì)永久性腦缺血細(xì)胞凋亡及Bcl-2表達(dá)的影響〔J〕.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2011；28(12)：1078-81.

5Bai T,Dong DS,Pei L.Resveratrol mitigates isoflurane-induced neuroapoptosis by inhibiting the activation of the Akt-regulatedmitochondrial apoptotic signaling pathway〔J〕.Int J Mol Med,2013;32(3):819-26.

6Akkerman S，Blokland A，Reneerkens O，etal.Object recognition testing：methodological considerations on exploration and discrimination measures〔J〕.Behav Brain Res，2012;232(2)：335-47.

7Alzheimer's Association.2013 Alzheimer's disease facts and figures〔J〕.Alzheimers Dement，2013;9(2)：208-45.

8Zhang Y,Xu Z,Wang H,etal.Anesthetics isoflurane and desflurane differently affect mitochondrial function,learning,and memory〔J〕.Ann Neurol,2012;71:687-98.

9Yang WN，Han H，Hu XD，etal.The effects of perindopril on cognitive impairment induced by d-galactose and aluminum trichloride via inhibition of acetylcholinesterase activity and oxidative stress〔J〕.Pharmacol Biochem Behav，2013;114：31-6.

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