何 佳 鄧峰美 林友勝 劉漪淪

(成都醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)系，四川 成都 610500)

網(wǎng)素蛋白(PLS)1是Plastin1是一種肌動蛋白成束蛋白，可與纖維狀肌動蛋白結(jié)合，使纖維狀肌動蛋白相互交聯(lián)形成緊密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在穩(wěn)定細胞肌動蛋白骨架及調(diào)節(jié)細胞運動等方面有重要作用。PLS家族主要貢獻于細胞肌動蛋白骨架的相關(guān)功能，PLS1在支撐小腸微絨毛的特異性結(jié)構(gòu)中有重要作用〔1〕；小鼠體內(nèi)PLS1缺失會導(dǎo)致小腸微絨毛發(fā)育的不完全；在耳毛細胞的形成和發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用〔2〕；在腎細胞中也有特殊作用〔3〕；腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲等都與細胞肌動蛋白骨架有密切關(guān)系，PLS1在結(jié)直腸癌細胞系中異常表達，可能與腫瘤細胞遷移有密切關(guān)系〔4〕。本研究將人全長PLS1基因克隆到慢病毒質(zhì)粒pEZ-Lv201上，構(gòu)建重組慢病毒表達載體pEZ-PLS1并觀察其在人大腸癌細胞株SW480中表達。

1 材料和方法

1.1質(zhì)粒、菌株和細胞 慢病毒表達質(zhì)粒pEZ-Lv201(pEZ-SV40-eGFP-IRES-Puro)為本實驗室保存。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購于北京全式金生物技術(shù)公司。人大腸癌細胞株SW480、人胚腎細胞株293T和非小細胞肺癌細胞株H1299均購于中科院上海細胞庫。

1.2主要酶和試劑 慢病毒包裝質(zhì)粒試劑盒(復(fù)能基因)；Taq酶、RT試劑盒(Takara)；限制性內(nèi)切酶ApaI、EcoRI、T4 DNA ligase (NEB)；1 000 bp DNA ladder marker(天根公司)；dNTP(Promega)；Plasmid抽提Kit(Qiagen)；Lipofectamine2000(Invitrogen)；胰酶(上?；瘜W(xué)試劑公司)；RPMI1640、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Hyclone)；兔抗PLS1一抗(Abcam)；兔抗小鼠eGFP一抗、小鼠抗β-actin，小鼠抗GAPDH一抗(proteintech)；羊抗兔IgG二抗、羊抗小鼠IgG二抗(中杉金橋)；引物合成及測序由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。

1.3PLS1基因的克隆 依據(jù)GenBank的PLS1基因的編碼區(qū)(CDS)設(shè)計相應(yīng)引物，根據(jù)載體質(zhì)粒pEZ-Lv201的要求在引物中引入EcoRI和ApaI酶切位點。正義：CGGGATCCTAAACTGTGAGGCATAC；反義：CCAAGCTTATAAAGACCTGAAGATAGT(劃線部分為酶切位點)，PLS1基因提取于人正常大腸組織，PCR擴增，反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃、3 min，變性94℃、30 s，退火55℃、30s，延伸72℃、1 min，30個循環(huán)，72℃延伸5 min。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，與Genebank提供的條帶大小897 bp相符，膠回收產(chǎn)物保存待用。

1.4重組慢病毒載體的構(gòu)建、鑒定和純化 慢病毒質(zhì)粒pEZ-Lv201和目的片段分別經(jīng)EcoRI和ApaI雙酶切消化，用T4 DNA連接酶連接，形成含增強綠色熒光蛋白(EGFP)基因的克隆重組體。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α，擴增培養(yǎng)后用EcoRI和ApaI雙酶切鑒定，并測序鑒定插入DNA片段的正確性。

1.5重組慢病毒的包裝和滴度測定 ①包裝：重組慢病毒表達載體質(zhì)粒pEZ-PLS1、慢病毒包裝質(zhì)粒復(fù)合體Lenti-Pac HIV mix與轉(zhuǎn)染試劑DNA-EndoFectin complex混合后轉(zhuǎn)染293T細胞。48 h后收集病毒上清，4℃下800 r/min離心10 min棄去細胞碎片，上清液用0.45 μm聚醚砜低蛋白質(zhì)鏈接過濾器過濾收集病毒顆粒，濃縮后分裝10 μl/EP管，-70℃保存。②滴度測定：24孔板接種H1299細胞2×105/孔，37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)至細胞50%融合。慢病毒液分別以0.5、1.0、2.0、10.0、30.0 μl感染H1299細胞，72 h后熒光顯微鏡下計數(shù)EGFP陽性細胞數(shù)以計算病毒滴度(病毒滴度=EGFP陽性細胞率×細胞總數(shù)/慢病毒液體積×慢病毒液稀釋倍數(shù))(TU/ml)。為避免誤差，只選擇EGFP陽性細胞率為1%～30%的孔，取各組平均值計算滴度。

1.6轉(zhuǎn)染大腸癌細胞株SW480及其表達情況鑒定 24孔板接種SW480細胞1×105/孔，24 h后加入預(yù)先混好的感染復(fù)數(shù)(MOI)=10的重組慢病毒完全培養(yǎng)液2 ml，37℃、5%CO2孵箱中孵育12 h后換正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，72 h后在熒光顯微鏡觀察細胞轉(zhuǎn)染情況，并用Western印跡檢測PLS1表達情況。

2 結(jié) 果

2.1重組慢病毒載體pEZ-SV40-PLS1-eGFP-IRES-Puro的構(gòu)建和鑒定 PLS1基因編碼區(qū)DNA片段經(jīng)PCR擴增后，1%瓊脂糖凝膠電泳中可見897 bp特異性條帶，與理論值一致。PLS1的PCR產(chǎn)物純化后與載體pEZ-lv201進行酶切，連接，轉(zhuǎn)化后，得到數(shù)十個克隆，挑取3個單克隆搖菌，菌落PCR鑒定，結(jié)果顯示4個克隆(克隆1，2，3)可擴增出2 100 bp的目的片段(圖1)。經(jīng)測序鑒定與Genbank提供的序列一致，未發(fā)生任何突變，重組載體pEZ-PLS1構(gòu)建成功。

1、2、3陽性克隆，4陰性克隆，PC陽性對照，NC陰性對照圖1 PLS1基因與構(gòu)建的重組慢病毒載體的鑒定

2.2重組慢病毒包裝與病毒滴度測定 慢病毒包裝試劑盒Lenti-PacTMHIV Expression Packaging Kit包裝慢病毒載體pEZ-PLS1及其對照pEZ-eGFP后熒光顯微鏡下觀察(圖2A、B)。包裝后的慢病毒轉(zhuǎn)染H1299細胞后(圖2C、D、E)，測定慢病毒滴度約為2.1×109copies/ml，空載對照慢病毒濃縮后的病毒滴度約為7.9×1010copies/ml。

2.3重組慢病毒感染SW480細胞 重組慢病毒pEZ-PLS1以MOI為10感染SW480細胞，感染72 h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光，感染效率達90%以上(圖3)。

2.4Western印跡檢測SW480細胞中PLS1的表達 重組慢病毒感染SW480細胞，72 h后收集細胞沉淀，提取細胞總蛋白，72 kD左右有一條特異性條帶，其大小和PLS1預(yù)測條帶相符合，說明包裝產(chǎn)生的高滴度pEZ-PLS1重組慢病毒感染細胞能穩(wěn)定表達PLS1蛋白(圖4)。

A：白光下的293T細胞；B：熒光顯微鏡下的293T細胞；C(1、2)：0.1 μl；D(1、2)：1.0 μl；E(1、2)：10.0 μl圖2 重組慢病毒包裝與不同濃度慢病毒載體pEz-SV40-EGFP-IRES-Puro感染H1299細胞(×200)

圖3 熒光顯微鏡下慢病毒pEZ-PLS1感染后的SW480細胞(×200)

圖4 Western印跡檢測病毒感染SW480細胞后PLS1的表達

3 討 論

PLS1最早在雞腸細胞中發(fā)現(xiàn)，是PLS家族的成員之一，其相對分子質(zhì)量大約70 000，由629個氨基酸殘基組成，基因定位于3q23，主要與actin結(jié)合〔5，6〕，分子N端無磷酸化位點和核輸出信號序列〔7〕。在人小腸中I-plastin與villin、espin小剪接體、class I myosins和ezrin等肌動蛋白結(jié)合蛋白共同作用，將肌動蛋白纖絲交聯(lián)成緊密的束狀結(jié)構(gòu)，支持著微絨毛的特殊形態(tài)和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定〔3〕。腸上皮細胞形成的這種微絨毛結(jié)構(gòu)間接地增加了細胞的膜表面積，從而在結(jié)構(gòu)上滿足了細胞需要大量吸收營養(yǎng)物質(zhì)的特殊生理功能〔8〕。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠耳蝸毛細胞的形成過程中I-plastin在穩(wěn)定毛細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)上也有重要作用〔2〕。PLS家族中PLS2在免疫細胞中〔9〕和乳腺癌、黑色素瘤、前列腺癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤細胞中都有不同程度的表達上調(diào)，且與腫瘤細胞的遷移侵襲及腫瘤分期等密切相關(guān)〔10～12〕。研究發(fā)現(xiàn)PLS3在神經(jīng)細胞中表達，主要協(xié)助纖維狀肌動蛋白的成束而促進軸突生成〔13，14〕，在皮膚T細胞淋巴瘤中通過抑制細胞的凋亡來促進腫瘤發(fā)展〔15〕，在肝癌和子宮癌中PLS3的下調(diào)可增強細胞對DNA損傷的敏感性而誘發(fā)細胞程序性凋亡〔16〕。

目前已發(fā)現(xiàn)PLS1在肝癌、乳腺癌、胃癌、大腸癌〔17～19〕等惡性腫瘤中表達異常。大腸癌是世界上常見的高危害消化道惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率均位居前列〔20〕。細胞外基質(zhì)環(huán)境的變化是大腸腫瘤發(fā)生的重要原因之一。慢病毒載體是目前一種應(yīng)用較多的目的基因重組的重要工具，其具有容納外源性目的基因片段大，體內(nèi)表達穩(wěn)定，免疫反應(yīng)小和安全性較好等優(yōu)點〔21〕。重組的慢病毒載體可以感染非分裂細胞、分裂細胞及多種組織。此外，pEZ-Lv201慢病毒載體屬于“自殺”性慢病毒，不會利用宿主細胞形成新的病毒顆粒，病毒感染目的細胞后不會再感染其他細胞，已成為當(dāng)前重組基因研究的最佳選擇。

本研究成功構(gòu)建了PLS1重組慢病毒表達載體pEZ-PLS1；通過病毒包裝、收集和濃縮，得到高滴度慢病毒顆粒。感染大腸腺癌細胞系SW80后，熒光顯微鏡下觀察到90%以上細胞發(fā)出綠色熒光，Western印跡檢測SW480在實驗組中表達明顯高于對照。

1Grimm-Günter E-MS，Revenu C，Ramos S，etal.Plastin 1 binds to keratin and is required for terminal Web assembly in the intestinal epithelium〔J〕.Mol Biol Cell，2009；20(10)：2549-62.

2Taylor R，Bullen A，Johnson SL，etal.Absence of plastin 1 causes abnormal maintenance of hair cell stereocilia and a moderate form of hearing loss in mice〔J〕.Human Molecular Genetics，2015；24(1)：37-49.

3Brown JW，Mcknight CJ.Molecular Model of the Microvillar Cytoskeleton and Organization of the Brush Border〔J〕.PLoS One，2010；5(2)：e9406.

4霍永旭，張彤彤，蘇小娟，等.Plastin在腫瘤中的研究進展〔J〕.生命的化學(xué)，2015；(3)：413-7.

5Morley SC.The actin-bundling protein L-plastin supports T-cell motility and activation〔J〕.Immunol Rev，2013；256(1):48-62.

6Lin CS，Lau A，Lue TF.Analysis and mapping of plastin phosphorylation〔J〕.DNA Cell Biol，1998；17(12)：1041-6.

7Delanote V，Vandekerckhove JL，Gettemans J.Plastins：versatile modulators of actin organization in (patho)physiological cellular processes〔J〕.Acta Pharmacol Sinica，2005；26(7)：769-79.

8Revenu C，Ubelmann F，Hurbain I，etal.A new role for the architecture of microvillar actin bundles in apical retention of membrane proteins〔J〕.Mol Biol Cell，2012；23(2)：324-36.

9Todd EM，Deady LE，Celeste MS.Intrinsic T-and B-cell defects impair T-cell-dependent antibody responses in mice lacking the actin-bundling protein L-plastin〔J〕.Eur J Immunol，2013；43(7)：1735-44.

10Eilis F，Peter MW，Dermot K，etal.The leukocyte protein L-plastin induces proliferation，invasion and loss of E-cadherin expression in colon cancer cells〔J〕.Int J Cancer，2006；118(8)：2098-104.

11Riplinger SM，Wabnitz GH，Kirchgessner H，etal.Metastasis of prostate cancer and melanoma cells in a preclinical in vivo mouse model is enhanced by L-plastin expression and phosphorylation〔J〕.Mol Cancer，2014；13(1)：546.

12Samstag Y，Klemke M.Ectopic expression of L-plastin in human tumor cells：diagnostic and therapeutic implications〔J〕.Adv Enzyme Regul，2007；47(1)：118-26.

13Lyon AN，Pineda RH，Le Thi H，etal.Calcium binding is essential for plastin 3 function in Smn-deficient motoneurons〔J〕.Hum Mol Genet，2014；23(8)：1990-2004.

14Nishio H.PLS3 expression and SMA phenotype：a commentary on correlation of PLS3 expression with disease severity in children with spinal muscular atrophy〔J〕.J Hum Genet，2014；59(1)：64-5.

15Bégué E，Jean-Louis F，Bagot M，etal.Inducible expression and pathophysiologic functions of T-plastin in cutaneous T-cell lymphoma〔J〕.Blood，2012；120(1)：143-54.

16Ikeda H，Sasaki Y，Kobayashi T，etal.The role of T-fimbrin in the response to DNA damage：silencing of T-fimbrin by small interfering RNA sensitizes human liver cancer cells to DNA-damaging agents〔J〕.Int J Oncol，2005；27(4)：933-40.

17潘秀華，陳曉慧，李曉青，等.骨誘導(dǎo)因子 mRNA 表達與乳腺癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的關(guān)系〔J〕.天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2008；14(2)：203-6.

18Wang Y，Ma Y，Lü B，etal.Differential expression of mimecan and thioredoxin domain-containing protein 5 in colorectal adenoma and cancer：a proteomic study〔J〕.Exp Biol Med，2007；232(9)：1152-9.

19Lee JY，Eom EM，Kim DS，etal.Analysis of gene expression profiles of gastric normal and cancer tissues by SAGE〔J〕.Genomics，2003；82(1)：78-85.

20Jemal A，Bray F，Center MM，etal.Global cancer statistics〔J〕.CA：Cancer J Clin，2011；61(2)：69-90.

21Cockrell AS，Kafri T.Gene delivery by lentivirus vectors〔J〕.Molecular biotechnology，2007；36(3)：184-204.