向 丹 羅 琴

(荊門市中醫(yī)醫(yī)院肺病科，湖北 荊門 448000)

肺癌的發(fā)生及發(fā)展是一個(gè)多基因多階段的過程，研究其病因及發(fā)病機(jī)制具有重要意義〔1〕。半乳糖凝集素(Galectin)-3參與細(xì)胞生長、凋亡、周期調(diào)控、損傷及腫瘤轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)染等過程，在肝癌、乳腺癌、甲狀腺癌等多種腫瘤中過度表達(dá)，而抑制其表達(dá)可影響腫瘤細(xì)胞的增殖及凋亡〔2〕。目前關(guān)于Galectin-3對(duì)肺癌的影響及機(jī)制尚不清楚。RNA干擾(RNAi)是一種能使序列特異性基因轉(zhuǎn)錄后發(fā)生沉默的現(xiàn)象，是目前研究基因功能有效的方法〔3〕。本研究通過RNAi沉默Galectin-3在肺癌中的表達(dá)，研究其對(duì)肺癌細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 人肺癌A549細(xì)胞購自上海繼和生物科技有限公司。青鏈霉素、胰酶、胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、Annexin V-FITC凋亡試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所；Galectin-3、酶切含半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved caspase)3、β-鏈蛋白(catenin)、細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1單克隆抗體及辣根過氧化物標(biāo)記的二抗均購自美國abcam公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國SIM公司；倒置顯微鏡購自日本OLYMPUS；酶標(biāo)儀、電泳凝膠圖像分析系統(tǒng)、聚丙烯酰胺凝膠電泳儀均購自Bio-Rad公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 取出保存在液氮罐中的人肺癌A549細(xì)胞，即刻放入37℃的水浴鍋中解凍，輕輕搖動(dòng)使其在1～2 min內(nèi)溶解。取解凍的細(xì)胞在含有10%胎牛血清、100 μg/ml鏈霉素和100 U/ml青霉素的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基置于37℃，5% CO2，95%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞匯集率達(dá)到80%以上時(shí)，用0.25%的胰蛋白酶消化后傳代，細(xì)胞生長達(dá)到對(duì)數(shù)期后再用于后續(xù)的試驗(yàn)研究。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將生長至對(duì)數(shù)期的人肺癌A549細(xì)胞以1×106個(gè)/ml濃度接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞生長密度達(dá)到80%～90%時(shí)，將NC-siRNA組(用非特異性siRNA干預(yù)細(xì)胞)、Galectin-3-siRNA1和Galectin-3-siRNA2組(用Galectin-3-siRNA干預(yù)細(xì)胞)轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)，未轉(zhuǎn)染任何的siRNA作為對(duì)照組。嚴(yán)格按照Invitrogen 公司的脂質(zhì)體LipofectamineTM2000方法進(jìn)行。細(xì)胞轉(zhuǎn)染過程中使用無血清培養(yǎng)基，6 h后更換為正常的細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.4轉(zhuǎn)染效果檢測 收集轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，利用細(xì)胞蛋白提取試劑盒提取各組細(xì)胞中的總蛋白，利用BCA法對(duì)總蛋白進(jìn)行定量，配置12%分離膠及5%的濃縮膠，取50 μg的蛋白樣品與上樣緩沖液等量充分混勻，100℃變性10 min，取變性蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，電泳結(jié)束后電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%的脫脂奶粉37℃封閉1 h，加入一抗〔Galectin-3 1∶200稀釋，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)，1∶1 000稀釋〕，4℃孵育過夜，然后孵育二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，1∶1 000稀釋)，37℃孵育1 h，洗膜3次，電化學(xué)發(fā)光(ECL)發(fā)光劑顯影，自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。以GAPDH作為內(nèi)參，分析Galectin-3的蛋白表達(dá)水平。

1.5細(xì)胞凋亡檢測 取轉(zhuǎn)染48 h的NC-siRNA及Galectin-3-siRNA組細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)及結(jié)合緩沖液各洗滌細(xì)胞1次，離心后棄去上清，加入400 μl的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，取細(xì)胞沉淀再加入5 μl的PI和 Annexin-V-FITC，37℃避光靜置20 min，再加400 μl結(jié)合緩沖液，上機(jī)，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.6Western印跡檢測Cleaved caspase3、β-catenin、Cyclin D1蛋白表達(dá) 取轉(zhuǎn)染48 h的上述細(xì)胞，提取細(xì)胞中的蛋白，根據(jù)1.4方法檢測各組細(xì)胞中Cleaved caspase3、β-catenin、Cyclin D1的蛋白表達(dá)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1Western印跡檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中Galectin-3的蛋白相對(duì)表達(dá) NC-siRNA組Galectin-3的蛋白表達(dá)(0.415±0.153)與對(duì)照組(0.422±0.164)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，Galectin-3-siRNA1、Galectin-3-siRNA2組(0.103±0.009，0.204±0.107)均顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，Galectin-3-siRNA1組的抑制效果更明顯，選擇作為后續(xù)研究。見圖1。

2.2抑制Galectin-3的表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響 NC-siRNA組細(xì)胞凋亡率〔(2.02±0.35)%〕與對(duì)照組〔(1.97±0.29)%〕差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，Galectin-3-siRNA組〔(15.18±1.23)%〕顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。

2.3Western印跡檢測抑制Galectin-3的表達(dá)對(duì)Cleaved caspase3、β-catenin、Cyclin D1蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組及NC-siRNA組比較，Galectin-3-siRNA組β-catenin、Cyclin D1蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，Cleaved caspase3蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)。見表1，圖2。

1～4：對(duì)照組，NC-siRNA組，Galectin-3-siRNA 1組，Galectin-3-siRNA 2組圖1 Galectin-3在轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中的蛋白表達(dá)

圖2 抑制Galectin-3的表達(dá)對(duì)Cleaved caspase3、β-catenin、Cyclin D1蛋白表達(dá)的影響

組別Cleavedcaspase3β?cateninCyclinD1對(duì)照組0113±00071)0626±00371)0421±00391)NC?siRNA組0109±00081)0618±00351)0428±00371)Galectin?3?siRNA組0157±00070142±00110170±0031

與Galentin-3-siRNA組比較：1)P<0.05

3 討 論

Galectin-3基因定位于14q21-22染色體上，是Galectin家族的一個(gè)重要成員，在腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)、胞膜及正常細(xì)胞中均有廣泛表達(dá)，并可結(jié)合細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子、整聯(lián)素、細(xì)胞外基質(zhì)等多種配體，影響細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、侵襲等多種生物學(xué)效用，對(duì)腫瘤的血管生成及腫瘤細(xì)胞分化、侵襲和轉(zhuǎn)移等也有調(diào)控作用〔4〕，有研究顯示，Galectin-3在卵巢癌、黑色素瘤等多種惡性腫瘤中高表達(dá)〔5〕。RNA是一種高效、可行的抑制基因表達(dá)手段，目前已在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因治療等領(lǐng)域得到應(yīng)用。有研究顯示，RNAi抑制Galectin-3的表達(dá)可降低大腸癌、乳腺癌等腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)凋亡〔6〕。本研究結(jié)果顯示，抑制Galectin-3的表達(dá)可顯著促進(jìn)肺癌細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種程序性死亡過程，caspase-3在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。caspase-3是caspase家族的關(guān)鍵蛋白，在正常組織中主要以無活性的形式存在，不同的凋亡途徑最終都會(huì)引起caspase-3的活化，活化的caspase-3導(dǎo)致細(xì)胞以凋亡的形式解體，目前caspase-3在胃癌、肺癌等多種腫瘤中均有研究〔7，8〕。Wnt信號(hào)通路是在進(jìn)化上相對(duì)保守的一條信號(hào)傳導(dǎo)途徑，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、分化及胚胎發(fā)育等多種生命活動(dòng)過程，可分為經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路和非經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路，Wnt/β-catenin信號(hào)通路是一條經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路，與腫瘤、骨質(zhì)疏松等多種人類疾病密切相關(guān)，其異常激活可被調(diào)控的相關(guān)基因或蛋白改變，從而導(dǎo)致細(xì)胞的生長及無限增殖，最終引起腫瘤的發(fā)生〔9〕。近年研究顯示，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活影響肺癌的發(fā)生及發(fā)展〔10〕。β-catenin是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的關(guān)鍵分子，Cyclin D1是Wnt/β-catenin信號(hào)通路下游靶基因。本研究結(jié)果顯示，抑制Galectin-3的表達(dá)可顯著下調(diào)β-catenin、Cyclin D1蛋白表達(dá)。

1Schapira MM，Aggarwal C，Akers S，etal.How patients view lung cancer screening.the role of uncertainty in medical decision making〔J〕.Ann Am Thorac Soc，2016；13(11)：1969-76.

2Shimura T，Shibata M，Gonda K，etal.Circulating galectin-3 correlates with angiogenetic factors，indicators of nutritional condition and systemic inflammation in patients with thyroid cancer〔J〕.Ann Cancer Res Ther，2016；24(1)：35-40.

3Brachs S，Winkel AF，Tang H，etal.Inhibition of citrate cotransporter Slc13a5/mINDY by RNAi improves hepatic insulin sensitivity and prevents diet-induced non-alcoholic fatty liver disease in mice〔J〕.Mol Metab，2016；5(11)：1072-82.

4Park AM，Hagiwara S，Hsu DK，etal.Galectin-3 plays an important role in innate immunity to gastric infection by Helicobacter pylori〔J〕.Infec Immun，2016；84(4)：1184-93.

5Shimura T，Kofunato Y，Okada R，etal.Intranuclear accumulation of galectin-3 is associated with a poor prognosis in patients with invasive intraductal papillary mucinous neoplasm〔J〕.Ann Cancer Res Ther，2016；24(1)：23-9.

6Ilmer M，Mazurek N，Gilcrease MZ，etal.Low expression of galectin-3 is associated with poor survival in node-positive breast cancers and mesenchymal phenotype in breast cancer stem cells〔J〕.Breast Cancer Res，2016；18(1)：97.

7申建剛，張定國，朱惠明.血管內(nèi)皮生長因子-A siRNA 對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2016；36(3)：542-4.

8Sohn D，Peters D，Piekorz RP，etal.miR-30e controls DNA damage-induced stress responses by modulating expression of the CDK inhibitor p21WAF1/CIP1 and caspase-3〔J〕.Oncotarget，2016；7(13)：15915.

9Ye S，Zhang D，Cheng F，etal.Wnt/β-catenin and LIF-Stat3 signaling pathways converge on Sp5 to promote mouse embryonic stem cell self-renewal〔J〕.J Cell Sci，2016；129(2)：269-76.

10Shi J，Jiang X，Yu Z，etal.ZNRF3 contributes to the growth of lung carcinoma via inhibiting Wnt/β-catenin pathway and is regulated by miR-93〔J〕.Tumor Biol，2016；37(3)：3051-7.