耿 威 仉慧穎 李 林 陳 巖 邱一凡

(大慶油田總醫(yī)院消化內(nèi)科，黑龍江 大慶 163001)

胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因、多因素參與的過(guò)程，包括原癌基因的激活、抑癌基因的失活等〔1〕?？赏ㄟ^(guò)與靶基因結(jié)合調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡、分化、個(gè)體發(fā)育等過(guò)程，其異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生及發(fā)展相關(guān)〔2〕。其中miRNA-21在食管癌、乳腺癌、肺癌等多種實(shí)體腫瘤中呈現(xiàn)過(guò)表達(dá)，參與腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、侵襲等過(guò)程，在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中有重要作用〔3,4〕。本研究通過(guò)RNA干擾(RNAi)技術(shù)沉默胃癌細(xì)胞中miRNA-21的表達(dá)，研究其對(duì)細(xì)胞增殖及侵襲的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1一般資料 人胃癌SGC-7901細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。主要試劑和儀器：胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程有限公司；胰蛋白酶、RPMI1640培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；siRNA和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-2)、MMP-9、Notch1、Hes1抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；細(xì)胞裂解液購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、細(xì)胞增殖與活性檢測(cè)試劑盒(CCK8)均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自Bio-Rad公司；倒置顯微鏡購(gòu)自日本OLYMPUS；二氧化碳(CO2)細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自德國(guó)Heraus公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 人胃癌SGC-7901細(xì)胞在含有10%胎牛血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d后，用0.25%的胰蛋白酶消化后根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。轉(zhuǎn)染前2 d以2×104個(gè)/孔的濃度將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901細(xì)胞接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到90%以上時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染分為正常對(duì)照組、轉(zhuǎn)染siRNA Control的陰性對(duì)照組和轉(zhuǎn)染siRNA miRNA-21基因的沉默組。整個(gè)轉(zhuǎn)染過(guò)程嚴(yán)格按照Invitrogen 公司的脂質(zhì)體LipofectamineTM2000方法進(jìn)行操作。

1.3轉(zhuǎn)染效果檢測(cè) 取轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞，RNA提取試劑盒提取細(xì)胞中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)目的基因miRNA-21及內(nèi)參基因U6的RT-PCR引物。送由上海生工合成。引物序列上游引物：5'-TGCGGTAGCTTATCAGACTGATG-3'，下游引物：5'-CCAGTGCAGG-GTCCGAGGT-3'。按照試劑盒說(shuō)明設(shè)置反應(yīng)體系及參數(shù)，進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測(cè)。

1.4細(xì)胞增殖檢測(cè) 以1×106個(gè)/孔濃度將轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，置于37℃、5% CO2、95%飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后收集細(xì)胞。每孔細(xì)胞中加入CCK8試劑10 μl，37℃反應(yīng)2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定A570 nm的吸光度(A570)。細(xì)胞增殖率=(轉(zhuǎn)染組細(xì)胞A/對(duì)照組細(xì)胞A)×100%。

1.5細(xì)胞侵襲能力檢測(cè) Transwell侵襲小室鋪Matrigel膠，取轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞，0.25%的胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液，用含有100 ml/L胎牛血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以每毫升含有5×104個(gè)細(xì)胞接種于Transwell小室的上室中，Transwell小室的下室中加入500 μl含有100 ml/L胎牛血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后收集細(xì)胞。用棉簽輕輕擦掉上層的Transwell膠，95%的酒精固定15 min，染色，倒置顯微鏡下觀察，隨機(jī)取10個(gè)不同的視野(×200)進(jìn)行穿透細(xì)胞計(jì)數(shù)，試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算侵襲細(xì)胞的平均數(shù)。

1.6MMP-2、MMP-9、Notch1、Hes1蛋白表達(dá)檢測(cè) 取轉(zhuǎn)染48 h的各組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞中的總蛋白。取少量蛋白樣品BCA法檢測(cè)蛋白的濃度。配置12%的分離膠和5%的濃縮膠。取蛋白樣品與上樣緩沖液按照5∶1的比例充分混勻后，100℃變性5 min。取100 μg蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)印蛋白至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，置于4℃的封閉液中封閉過(guò)夜，加入一抗，4℃孵育過(guò)夜，加入1∶1 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗，室溫置于搖床上孵育1 h，TBST洗膜5次，每次5 min，洗膜后進(jìn)行顯影和定影。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參，分析MMP-2、MMP-9、Notch1、Hes1蛋白表達(dá)水平。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1轉(zhuǎn)染siRNA后SGC-7901細(xì)胞中miRNA-21 mRNA表達(dá) 轉(zhuǎn)染siRNA后正常對(duì)照組(1.000)和陰性轉(zhuǎn)染組(0.991±0.010)miRNA-21 mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，沉默組(0.432±0.032)顯著低于正常對(duì)照組(P<0.01)。

2.2沉默miRNA-21的表達(dá)降低SGC-7901細(xì)胞增殖 轉(zhuǎn)染siRNA后沉默組細(xì)胞存活率(57.43%±6.98%)顯著低于正常對(duì)照組(100.00%)和轉(zhuǎn)染陰性組(97.18%±3.12%，P<0.01)。

2.3沉默miRNA-21的表達(dá)降低SGC-7901細(xì)胞侵襲能力 siRNA轉(zhuǎn)染48 h后，沉默組細(xì)胞侵襲數(shù)〔(91.65±13.21)個(gè)〕顯著低于正常對(duì)照組和轉(zhuǎn)染陰性組〔(159.65±15.87)個(gè)、(158.88±15.12)個(gè)，P<0.01〕。

2.4沉默miRNA-21的表達(dá)對(duì)MMP-2、MMP-9、Notch1、Hes1蛋白表達(dá)的影響 siRNA轉(zhuǎn)染48 h后，與正常對(duì)照組(0.255±0.036，0.159±0.029，0.511±0.018，0.268±0.029)及轉(zhuǎn)染陰性組(0.551±0.038，0.156±0.030，0.508±0.047，0.270±0.026)比較，沉默組MMP-2、MMP-9、Notch1、Hes1蛋白表達(dá)(0.143±0.027，0.058±0.014，0.174±0.028，0.165±0.017)均顯著下調(diào)(P<0.01)。見(jiàn)圖1。

圖1 Western印跡檢測(cè)沉默miRNA-21表達(dá)對(duì)MMP-2、MMP-9、Notch1、Hes1蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

胃癌的發(fā)生是一個(gè)多因素多階段的過(guò)程，涉及癌基因的活化、抑癌基因的失活、基因啟動(dòng)子的異常轉(zhuǎn)錄活化、細(xì)胞周期調(diào)控失常、表觀遺傳學(xué)等多個(gè)方面。有研究顯示miRNA對(duì)多種癌細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移等過(guò)程有重要的調(diào)節(jié)功能〔5〕。miRNA-21對(duì)消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等有調(diào)節(jié)功能，參與多種腫瘤的血管生成、增殖、遷移、抗藥形成等〔6〕。研究顯示，抑制肺癌、食管癌等腫瘤細(xì)胞中miRNA-21的表達(dá)，可降低癌細(xì)胞的增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔7〕。

RNAi是由雙鏈RNA介導(dǎo)的能使基因在轉(zhuǎn)錄后發(fā)生沉默的現(xiàn)象，具有高度的特異性、有效性，是研究基因功能的有效方法〔8〕。本研究通過(guò)RNAi技術(shù)沉默miRNA-21的表達(dá)，結(jié)果顯示細(xì)胞的增殖及侵襲能力均顯著降低。腫瘤的侵襲是一個(gè)多步驟、多環(huán)節(jié)的復(fù)雜過(guò)程，受到多種因素的影響，而MMPs表達(dá)改變，尤其是MMP-2和MMP-9表達(dá)升高，可通過(guò)使基底膜中的Ⅳ型膠原蛋白酶降解，進(jìn)而增強(qiáng)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及侵襲能力〔9〕。研究顯示，肺腺癌、宮頸癌等腫瘤中MMP-2和MMP-9的表達(dá)升高可使腫瘤對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)降解的能力增加，最終導(dǎo)致細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲〔10〕。

Notch1信號(hào)通路是一條高度保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在多種器官和組織的早期發(fā)育過(guò)程中，其家族成員對(duì)調(diào)控細(xì)胞的發(fā)育、凋亡、分化等過(guò)程有重要作用。由受體和配體及DNA結(jié)合蛋白組成。哺乳動(dòng)物有Notch1、Notch2、Notch3、Notch4 4個(gè)同源的Notch受體，Notch1是主要的受體〔11〕。大量研究顯示，Notch1在各種腫瘤中有致癌作用，胃癌、胰腺癌等腫瘤中下調(diào)Notch1信號(hào)通路可降低癌細(xì)胞生長(zhǎng)及侵襲能力〔12〕。Hes1是Notch1信號(hào)通路的一個(gè)重要靶基因，是Notch1信號(hào)通路激活的標(biāo)志。本研究結(jié)果顯示，胃癌細(xì)胞中沉默miRNA-21的表達(dá)可通過(guò)抑制Notch1信號(hào)通路降低細(xì)胞的增殖及侵襲能力，為胃癌的分子診斷及靶向治療提供了一定的理論基礎(chǔ)。

1Hess LM,Michael D,Mytelka DS,etal.Chemotherapy treatment patterns,costs,and outcomes of patients with gastric cancer in the United States:a retrospective analysis of electronic medical record(EMR) and administrative claims data〔J〕.Gastric Cancer,2016;19(2):607-15.

2Singh N,Shankar J,Srivastava A,etal.PUB127 role of microRNAs and proteostasis system in diesel exhaust particle induced lung toxicity〔J〕.J Thorac Oncol,2017;12(1):S1520-1.

3Sun L,Dong S,Dong C,etal.Predictive value of plasma miRNA-718 for esophageal squamous cell carcinoma〔J〕.Cancer Biomark,2016;16(2):265-73.

4Wu ZH,Tao ZH,Zhang J,etal.MiRNA-21 induces epithelial to mesenchymal transition and gemcitabine resistance via the PTEN/AKT pathway in breast cancer〔J〕.Tumor Biol,2016;37(6):7245-54.

5Valli AA,Santos BA,Hnatova S,etal.Most microRNAs in the single-cell alga Chlamydomonas reinhardtii are produced by Dicer-like 3-mediated cleavage of introns and untranslated regions of coding RNAs〔J〕.Genome Res,2016;26(4):519-29.

6Qu K,Lin T,Pang Q,etal.Extracellular miRNA-21 as a novel biomarker in glioma:Evidence from meta-analysis,clinical validation and experimental investigations〔J〕.Oncotarget,2016;7(23):33994-4010.

7Zhang M,Xu Q,Yan S,etal.Suppression of forkhead box Q1 by microRNA-506 represses the proliferation and epithelial-mesenchymal transition of cervical cancer cells〔J〕.Oncol Rep,2016;35(5):3106-14.

8葉麗平,馬靜方,仇會(huì)會(huì).RNA 干擾 cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白對(duì)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的人卵巢癌細(xì)胞 Bcl-2 表達(dá)的影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志,2017;37(2):280-2.

9Her Z,Kam YW,Gan VC,etal.Severity of plasma leakage is associated with high levels of interferon γ-inducible protein 10,hepatocyte growth factor,matrix metalloproteinase 2(MMP-2),and MMP-9 during dengue virus infection〔J〕.J Infect Dis,2017;215(1):42-51.

10Yu J,Xie Q,Zhou H,etal.Survivin,MMP-2,and MMP-9 expression in different types of cervical lesions and correlation analysis〔J〕.Int J Clin Exp Pathol,2016;9(5):5445-51.

11Feng S,Yang Y,Lv J,etal.Valproic acid exhibits different cell growth arrest effect in three HPV-positive/negative cervical cancer cells and possibly via inducing Notch1 cleavage and E6 downregulation〔J〕.Int J Oncol,2016;49(1):422-30.

12Konishi H,Asano N,Imatani A,etal.Notch1 directly induced CD133 expression in human diffuse type gastric cancers〔J〕.Oncotarget,2016;7(35):56598-607.