王 昊，晏 玉，謝婭鑫，馮迎雪，呂瑩瑩，葉 萌

(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，哈爾濱 150076)

多糖是在生物體中廣泛存在的一種物質(zhì)，是一類由醛糖或酮糖通過糖苷鍵連接而成的天然高分子多聚物，它即是生物體內(nèi)特別重要的生物大分子，也是維持生命活動(dòng)的基本物質(zhì)[1].多糖按其來源大致可分為三類：植物多糖、動(dòng)物多糖和微生物多糖，這三大類當(dāng)中，從植物中提取的水溶性多糖最為重要.我國(guó)多糖資源非常充盈，隨著人們的生活水平和保健意識(shí)的不斷增強(qiáng)，植物中提取的多糖作為一種保健類的食品，產(chǎn)品也異常豐富，這當(dāng)中特別是來源于中草藥的植物多糖，應(yīng)用歷史悠久，具有巨大的開發(fā)前景[2].甘薯(學(xué)名：Dioscorea esculenta(Lour.) Burkill)又名甜薯，旋花科甘薯屬(不是薯蕷科薯蕷屬)纏繞草質(zhì)藤本.甘薯不僅營(yíng)養(yǎng)豐富，還含有蛋白、多糖、多酚、膳食纖維、維生素和礦物質(zhì)等多種生物活性物質(zhì)[3].對(duì)甘薯多糖的研究主要以大陸研究居多，這些研究大多為多糖的提取的分離與純化、組分分析、生物活性等方面.本實(shí)驗(yàn)擬以甘薯塊根為原料，經(jīng)過去皮、切片、干燥，粉碎的前處理.采用水提醇沉法提取甘薯多糖，再對(duì)其進(jìn)行脫蛋白等處理，最后得到純度較高的甘薯多糖.再通過進(jìn)行單因素試驗(yàn)分析及正交試驗(yàn)對(duì)甘薯多糖的提取工藝進(jìn)行對(duì)比研究，確立甘薯多糖的最佳提取工藝，為甘薯多糖的進(jìn)一步開發(fā)與利用提供必要的理論依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑及儀器

甘薯：購(gòu)于菜市場(chǎng)；紫外可見分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；烘干箱(深圳博造科技有限公司)；高速萬能粉碎機(jī)(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；苯酚(天津光復(fù)化學(xué)試劑廠)；95%乙醇(天津永大化學(xué)試劑有限公司)；濃硫酸(西安化學(xué)試劑廠)；無水乙醇(天津永大化學(xué)試劑有限公司)；丙酮(天津光復(fù)化學(xué)試劑廠)；正丁醇(天津光復(fù)化學(xué)試劑廠)；氯仿(天津光復(fù)化學(xué)試劑廠).

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL置50 mL容量瓶中[4-7]，加水至刻度，搖勻.精密吸取上述各質(zhì)量濃度的溶液2.0 mL，另吸取蒸餾水2.0 mL作空白對(duì)照，置10 mL容量瓶中，分別加入5%苯酚溶液1.0 mL，濃硫酸5.0 mL搖勻，于沸水浴中加熱15 min，然后置冷水浴中冷卻30 min，定容，隨行空白.于490 nm波長(zhǎng)測(cè)定其吸光度值.以吸光度為縱坐標(biāo)(Y)，葡萄糖對(duì)照品溶液的溶度(mg/ mL)為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸數(shù)據(jù)處理，求得回歸方程為Y=12.886X+0.001 5，r=0.999 8，n=6.結(jié)果表明在0.009 94～0.059 64 mg/ mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系.葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示.

2.2 甘薯多糖含量測(cè)定的計(jì)算

精密量取本實(shí)驗(yàn)提取的甘薯多糖樣品4.0 mg，用蒸餾水溶解所取的甘薯多糖標(biāo)準(zhǔn)品，并定容于100 mL容量瓶中，質(zhì)量濃度為0.04 mg/ mL.用移液管吸取2.0 mL于10 mL容量瓶中，另吸取蒸餾水2.0 mL作空白對(duì)照，置10 mL容量瓶中，分別加入5%苯酚溶液1.0 mL，濃硫酸5.0 mL搖勻，于沸水浴中加熱15 min，然后置冷水浴中冷卻30 min，定容.于490 nm波長(zhǎng)測(cè)定其吸光度值，由回歸方程計(jì)算出質(zhì)量濃度和含甘薯多糖的量以及提取率.

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 精密度考察

按上述2.2的方法，于490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，重復(fù)測(cè)定6次，得出其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果RSD值為1.264%，說明本實(shí)驗(yàn)精密度良好.

2.4 穩(wěn)定性考察

稱取蒸干的甘薯多糖的樣品10 mg，加水溶解，定容至100 mL容量瓶中，作為供試品.取供試品溶液適量做穩(wěn)定性測(cè)試，用上述方法進(jìn)行測(cè)定.在5 h內(nèi)，每隔1 h 測(cè)定一次其吸光度.由其數(shù)據(jù)可以看出在490 nm波長(zhǎng)測(cè)定多糖含量時(shí)，吸光度穩(wěn)定，RSD為1.794%，說明實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性良好.

2.5 重復(fù)性考察

取上述所制得的供試品溶液做重復(fù)性測(cè)試，用同種方法進(jìn)行測(cè)定，在其最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值.通過計(jì)算相應(yīng)的含多糖量，再得出在490 nm波長(zhǎng)測(cè)定多糖含量時(shí)，RSD為1.045%，說明實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性良好.

2.6 甘薯多糖的提取

2.6.1 甘薯多糖的提取方法

甘薯預(yù)處理：甘薯 → 去皮切片 → 烘干 → 粉碎 → 脫脂 → 甘薯粉末.提取甘薯多糖的具體方案：甘薯粉末→熱水浸提 抽濾→濾液→蒸發(fā)濃縮至100 mL→濃縮液→Sevage法除蛋白、離心取上清液→多糖溶液→加入95%乙醇，靜置，抽濾→沉淀→乙醇，丙酮洗滌、干燥→甘薯多糖.

2.6.2 甘薯多糖提取單因素考察

1)不同提取時(shí)間對(duì)甘薯多糖提取率的影響

稱取20 g/份的甘薯粉末5份進(jìn)行熱水浸提[8-14]，料液比1∶20，溫度80 ℃，提取1次，提取時(shí)間分別為2、3、4、5、6 h進(jìn)行提取.依法測(cè)定結(jié)果，考察提取時(shí)間對(duì)甘薯多糖提取率的影響.可以得出在料液比1∶20，溫度80 ℃，提取1次的條件下，含甘薯多糖的量隨提取時(shí)間增加呈先升后降的趨勢(shì)，在提取時(shí)間5 h時(shí)，提取率達(dá)到最大值.因此提取時(shí)間為5 h為宜.不同提取時(shí)間對(duì)甘薯多糖提取率的影響如圖2所示.

圖2 不同提取時(shí)間對(duì)甘薯多糖提取率的影響

2)不同提取溫度對(duì)甘薯多糖提取率的影響

稱取20g/份的甘薯粉末5份進(jìn)行熱水浸提，料液比1∶20，提取時(shí)間3 h，提取1次，提取溫度分別為60、70、80、90、100 ℃進(jìn)行提取.依法測(cè)定結(jié)果，考察提取溫度對(duì)甘薯多糖提取率的影響.在料液比1∶20，提取時(shí)間3 h，提取1次的條件下，含甘薯多糖的量隨溫度升高呈先升后降的趨勢(shì)，在90 ℃時(shí)提取率達(dá)到最高，其下降原因可能為多糖在熱水中提取時(shí)發(fā)生水解，也可能是溫度過高可導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)被破壞，影響其生物活性，因此，溫度選為90 ℃為宜.不同提取溫度對(duì)甘薯多糖提取率的影響如圖3所示.

圖3 不同提取溫度對(duì)甘薯多糖提取率的影響

3)不同料液比對(duì)甘薯多糖提取率的影響

稱取20 g/份的甘薯粉末5份進(jìn)行熱水浸提，溫度80 ℃，提取時(shí)間3 h，提取1次，提取料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，考察提取料液比對(duì)甘薯多糖提取率的影響.在溫度80 ℃，提取時(shí)間3 h，提取1次的條件下，含甘薯多糖的量在料液

比較低時(shí)，含甘薯多糖的量隨著料液比的增大而增大，通過增加提取液的體積可以增加多糖的溶出量.在料液比1∶15時(shí)，甘薯多糖提取率達(dá)到最大值，當(dāng)隨著料液比逐漸增多，甘薯多糖開始減小.由于加水量過大稀釋了多糖的質(zhì)量濃度，在一定體積倍數(shù)乙醇沉淀的過程中不利于多糖沉淀的析出.因此料液比選1∶15為宜.其結(jié)果如圖4所示.

圖4 不同料液比對(duì)甘薯多糖提取率的影響

2.6.3 甘薯多糖提取正交試驗(yàn)與結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇提取時(shí)間，提取溫度，料液比3個(gè)因素的較優(yōu)水平，按L9(34)設(shè)計(jì)進(jìn)行正交試驗(yàn)，得出提取甘薯多糖的最佳工藝條件.正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)與結(jié)果分析如表1、2所示.

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)數(shù)據(jù)及極差結(jié)果

表2 正交試驗(yàn)方差數(shù)據(jù)分析表

通過正交試驗(yàn)的極差數(shù)據(jù)分析結(jié)果可知：時(shí)間因素極差為0.50，溫度因素極差為0.08，料液比因素極差為0.01.影響水提醇沉法提取甘薯多糖提取率的諸因素的主次關(guān)系依次是提取時(shí)間>提取溫度>料液比.水提醇沉法提取甘薯多糖的最佳工藝為：A2B2C2，即提取時(shí)間為5 h，提取溫度為90 ℃，料液比為1∶15(m/V).在此條件下，甘薯多糖提取的提取率最大.

通過正交試驗(yàn)的方差數(shù)據(jù)分析結(jié)果可知：時(shí)間因素和溫度因素對(duì)甘薯多糖提取率的影響極為顯著(P<0.01)，料液比因素對(duì)甘薯多糖提取率的影響顯著(P<0.05).

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表3所示.

表3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果

由正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果可知，在最佳提取工藝條件下，即提取時(shí)間為5 h，提取溫度為90 ℃，料液比為1∶15時(shí)，其提取甘薯多糖提取率的平均值為1.78%.

3 結(jié) 語

本次采用水提醇沉法提取甘薯多糖工藝研究的過程中，分別考察了不同提取時(shí)間、提取溫度、料液比三個(gè)因素對(duì)甘薯多糖提取的影響.結(jié)果表明，提取時(shí)間和提取溫度對(duì)多糖的提取率影響為極顯著水平(P<0.01)，其次是料液比為顯著水平(P<0.05).其最優(yōu)化的提取工藝條件是：提取時(shí)間為5 h、提取溫度為90 ℃、料液比為1∶15(m/V).在該工藝條件下，甘薯多糖的提取率為1.78%.

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