李建鋒，謝勝，陳廣文，劉禮劍，黃曉燕，楊成寧，李娟，謝潔如，戴文杰，陳明冰

(1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院，南寧 530000； 2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，南寧 530000)

慢性胃炎(chronic gastritis，CG)、功能性消化不良(functional dyspepsIA，F(xiàn)D)及潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是消化系統(tǒng)常見疾病，占據(jù)消化內(nèi)科門診半數(shù)以上，發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢，嚴(yán)重危害人體身心健康，加重醫(yī)療經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前，這些疾病的病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，因此，進(jìn)一步深入研究這類消化系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制及藥物研發(fā)，相關(guān)動物模型的建立顯得尤為重要。近年來動物研究發(fā)現(xiàn)烷基化試劑—碘乙酰胺可基本模擬消化系統(tǒng)疾病如慢性胃炎、功能性消化不良、潰瘍性結(jié)腸炎的病理生理機(jī)制，碘乙酰胺可作為蛋白酶抑制劑抑制蛋白酶活力而不使蛋白變[1]，具有誘導(dǎo)細(xì)胞缺氧、黏膜損傷、焦慮和抑郁等作用，現(xiàn)將碘乙酰胺在CG、FD、UC動物模型建立中的作用機(jī)制、造模方法等研究進(jìn)行綜述。

1 碘乙酰胺的作用機(jī)制

碘乙酰胺(iodoacetomide，IA)，是蛋白組學(xué)中半胱氨酸和組氨酸的烷基化試劑，其與半胱氨酸上的巰基(-SH)在室溫下即可迅速發(fā)發(fā)生R-SH+ICH2CONH2→R-S-CH2CONH2+HI[1]不可逆反應(yīng)。因此IA具有誘導(dǎo)細(xì)胞缺氧、黏膜損傷、焦慮和抑郁等作用。

1.1 IA誘導(dǎo)細(xì)胞缺氧

IA是磷酸肌酸激酶(creatine kinase, CK)的特異性抑制劑，CK被抑制后，ATP轉(zhuǎn)運(yùn)障礙[2]，則供能量生成嚴(yán)重障礙，誘導(dǎo)細(xì)胞缺氧，并導(dǎo)致肌肉運(yùn)動能力下降。且無氧代謝可造成酸中毒，在將加重ATP合成障礙，還將破壞細(xì)胞器和細(xì)胞，更進(jìn)一步加重缺氧并誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。

1.2 IA誘導(dǎo)黏膜損傷

研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生巰基(-SH)化合物，如谷胱甘肽對保護(hù)胃黏膜發(fā)揮著重要作用[3]，它們能夠防止活性氧(reactive oxy gen species, ROS)及其代謝物參與胃黏膜損傷[4]。IA特異抑制了巰基(-SH)，從而使巰基(-SH)失去保護(hù)黏膜的作用，進(jìn)而導(dǎo)致黏膜損傷。

1.3 IA介導(dǎo)蛋白質(zhì)變性

蛋白質(zhì)分子中各氨基酸通過肽鍵及二硫鍵結(jié)合成具有一定順序的肽鏈稱為一級結(jié)構(gòu)。二硫鍵起著穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)及抑制聚集的作用[5]。IA具有抑制巰基(-SH)的作用，致使二硫鍵斷裂，多肽鏈伸展開來，使蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而失去生物活性。

1.4 IA誘導(dǎo)焦慮和抑郁

IA誘導(dǎo)雌性小鼠胃炎的表現(xiàn)出與高架十字迷宮測試(elevated plus maze test, EPMT)中所評估的焦慮相關(guān)的行為增加[6]。Luo等[7]研究發(fā)現(xiàn)用IA處理的雌性小鼠中皮質(zhì)酮的循環(huán)水平降低，而焦慮抑郁相關(guān)行為指標(biāo)顯著增強(qiáng)，但在雄性小鼠中沒有顯著變化。同時指出，可能是長期胃炎增強(qiáng)焦慮樣行為，并引起下丘腦 - 垂體 - 腎上腺軸(hypothalamic-pituitary-adrenal axis, HPA or HTPA axis)的習(xí)慣化以性別依賴方式有關(guān)，其中IA對焦慮和HPA軸活性的影響是由外周作用部位引起的。Painsipp等[8]研究中發(fā)現(xiàn)，IA誘導(dǎo)雌性大鼠胃炎中HPA軸過度活躍，而HPA軸過度活躍是焦慮抑郁癥患者的共同表現(xiàn)[9-10]，并表明IA誘導(dǎo)的胃炎通過神經(jīng)內(nèi)分泌(HPA軸)途徑導(dǎo)致雌性大鼠的焦慮和抑郁樣行為。

2 IA在在消化系統(tǒng)疾病動物模型建立中的應(yīng)用

2.1 慢性胃炎

CG由多種原因引起的胃黏膜的慢性炎性反應(yīng)，當(dāng)前我國CG患病率接近90%[11]，并且CG伴腸上皮化生發(fā)生胃癌的危險度增加[12]，在臨床上應(yīng)引起高度重視，故CG物模型的構(gòu)建對深入研究該病的相關(guān)機(jī)制顯得尤為重要。

IA具有誘發(fā)輕度胃炎的作用，并產(chǎn)生在感覺和酸分泌功能顯著變化反應(yīng)，國外學(xué)者在建立慢性胃炎大鼠模型中已多次應(yīng)用[13-14]。且慢性胃炎與飲食因素具密切相關(guān)[15]，而采用IA化學(xué)刺激模損傷胃黏膜以擬人類因不良飲食習(xí)慣來造成的慢性胃炎，這種模擬病因的方式能很好地反映慢性胃炎發(fā)展的真實情況。陳娟等[16]用0.07% 的IA溶液代替飲水自由飲用4 周以誘導(dǎo)誘導(dǎo)胃炎模型，發(fā)現(xiàn)IA組肉眼可見胃黏膜明顯充血水腫、紅斑點(diǎn)、呈線狀或片狀，病理炎癥中可觀察到胃黏膜毛細(xì)血管擴(kuò)張淤血，在胃小凹區(qū)、固有腺底部直至黏膜肌層見不同程度的淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞浸潤；Lee等[17]用0.1 mL 0.15% 的IA灌胃，同時以0.15% 的IA與2% 蔗糖的混合液替飲水自由飲用建立CG雄性大鼠模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)IA組大鼠胃黏膜損傷在1 d后已經(jīng)很明顯，并持續(xù)了整個實驗的7 d，胃組織表面可見中度胃損傷，而MPO活性顯著提高；Luo等[7]選用8 ～ 9周齡SD大鼠，予0.1% 的IA溶液代飲水飲用7 d以誘導(dǎo)胃炎模型，發(fā)現(xiàn)IA組的MPO活性顯著增加，研究同時發(fā)現(xiàn)，IA誘導(dǎo)的胃炎癥可通過神經(jīng)內(nèi)分泌途徑導(dǎo)致雌性大鼠的焦慮和抑郁樣行為；Painsipp等[8]選用8 ～ 16 周齡、體重25 ～ 35 g的OF1品系雄性和雌性小鼠，以0.1% 的IA溶液代飲用水飲用7 d誘導(dǎo)胃炎模型，在肉眼觀察中，IA組小鼠的胃、空腸和結(jié)腸黏膜改變無明顯差異，并在宏觀上呈現(xiàn)正常，但I(xiàn)A組小鼠中MPO活性顯著升高(P< 0.01)，組織學(xué)分析顯示，IA組小鼠的胃黏膜的腔側(cè)顯示結(jié)構(gòu)性損傷，特征在于黏膜的腔側(cè)被從上皮脫落的松散的黏膜細(xì)胞覆蓋；Takeeda等[18]選用體重在200 ～ 230 g的雄性SD大鼠，將濃度為0.1% IA溶液代飲用水給予大鼠飲用5 d誘導(dǎo)胃炎。實驗觀察到飲用第3 天時，即引起胃黏膜糜爛性病變，且損傷嚴(yán)重，并發(fā)現(xiàn)黏膜和黏膜下層中性粒細(xì)胞浸潤。飲用至第5 天時，大鼠體重較飲用前相比明顯下降(P< 0.05)；Piqueras等[19]選用6 ～ 8周雄性瑞士CD-1小鼠，每只每天予0.1 mL 0.1% 的IA灌胃，同時以0.1% 的IA與2.0% 蔗糖的混合液替飲水自由飲用6 d。結(jié)果在鏡下觀察到IA組大鼠胃黏膜下層具有炎性浸潤，包括肥大細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞；與對照組相比，IA組胃排空率差異無顯著性(P> 0.05)；但基礎(chǔ)胃酸分泌明顯增加(P< 0.05)；而在體重、飲食量、飲水量均明顯下降(P< 0.05)。

以IA溶液灌胃或/和代水自由飲用誘導(dǎo)的胃炎模型，結(jié)果均能發(fā)現(xiàn)MOP水平升高，MOP被廣泛地作為粒細(xì)胞浸潤到各種組織(包括胃腸道)的生化標(biāo)志物[20]，其水平的升高反映炎癥相關(guān)的嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤到組織中，故在實驗中均可在組織學(xué)下發(fā)現(xiàn)黏膜固有層中等發(fā)現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤。在IA誘導(dǎo)的胃炎模型中，大鼠在飲水量、體重、基礎(chǔ)胃酸分泌及肉眼觀察下的胃黏膜病變損傷程度等方面均有差異性，這些差異性可能與動物品系、IA溶液濃度、造模時間及IA的使用方式的不同相關(guān)。此外，在研究中發(fā)現(xiàn)，IA誘導(dǎo)可雌性大鼠的焦慮和抑郁樣行為，并且這種焦慮和抑郁行為可能誘導(dǎo)雌鼠的胃炎比雄鼠更嚴(yán)重，這一發(fā)現(xiàn)將可運(yùn)用于臨床上CG患者常伴發(fā)焦慮或抑郁狀態(tài)的研究。同時研究表明，與化學(xué)刺激物如阿司匹林、消炎痛、乙醇等造成的胃黏膜急性重度損傷模型相比，IA造成的是輕度胃黏膜損傷，且造模時間較短，是慢性淺表性胃炎的可靠模型[21]。

2.2 功能性消化不良

FD當(dāng)前全球患病率為10% ～ 30%[22]，胃十二指腸運(yùn)動功能紊亂和內(nèi)臟高敏感是FD的重要病理生理學(xué)機(jī)制，而FD患者的抑郁、焦慮情緒和睡眠障礙發(fā)生率更高[23]，故精神心理因素與FD的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。IA在誘發(fā)輕度胃炎的同時，并產(chǎn)生在感覺和運(yùn)動功能顯著變化[24]，并可導(dǎo)致并加重雌性大鼠的焦慮和抑郁樣行為[7-8]。故采用IA誘導(dǎo)FD動物模型，這種模擬FD發(fā)病的方式能很好地反映FD發(fā)展的真實情況。

Liu等[25]選用10 日齡雄性SD大鼠，每天給予0.2 mL的0.1% IA與2.0% 蔗糖的混合液連續(xù)灌胃6 d，發(fā)現(xiàn)IA組大鼠在對胃氣囊擴(kuò)張(GD)的行為反應(yīng)、神經(jīng)反應(yīng)得分均顯著增加(P< 0.001)，而傳入神經(jīng)活化閾值、胃容量均顯著較低(P< 0.001)，該實驗證實了對新生兒期的胃刺激可導(dǎo)致成年期的慢性胃過敏和胃運(yùn)動功能障礙，為FD的發(fā)病機(jī)制研究提供了一個潛在的動物模型。Liu等[26]以同樣造模方式對大鼠焦慮、抑郁行為進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在抑郁、焦慮樣行為測試中，IA組糖水偏好百分比、攀爬和游泳行為、開放手臂上行走距離百分比及30 min測試期間總行程均明顯降低(P< 0.05)；而5 min內(nèi)不動性顯著增加(P< 0.01)；進(jìn)一步證實了經(jīng)IA處理可誘發(fā)大鼠焦慮和抑郁樣行為。張聲生等[27-30]選用SPF級10日齡的SD雄性幼鼠，予0.1% IA與2.0% 蔗糖的混合液0.2 mL灌胃，連續(xù)6 d誘導(dǎo)FD模型，灌胃結(jié)束后各組大鼠正常飼養(yǎng)至7周齡，以夾尾刺激法[31-32]對模型組大鼠刺激1 周，實驗發(fā)現(xiàn)模型組大鼠3 h攝食量、胃排空率、胃順應(yīng)性、胃肌條收縮平均頻率和振幅變化率、胃體GHSR蛋白表達(dá)均顯著降低(P< 0.01)；模型組大鼠胃敏感性、胃及脊髓中5-HT含量及脊髓 c-fos mRNA表達(dá)均明顯升高(P< 0.05)。唐旭東等[33-35]選用10 日齡的SD雄性幼鼠，予0.1% IA與2.0%蔗糖的混合液0.2 mL灌胃，連續(xù)6 d誘導(dǎo)FD模型，灌胃結(jié)束后大鼠正常飼養(yǎng)至6 周齡予改良多平臺造模法[36]進(jìn)行疲勞誘發(fā)，連續(xù)14 d。實驗發(fā)現(xiàn)模型組大鼠體重、進(jìn)食量、飲水量、糖水偏好百分比、大鼠的抓握力、胃排空率、小腸推進(jìn)率、血清D-木糖排泄率、胃動素含量、胃體縱行肌肌條振幅(平均振幅、Max 振幅、Min 振幅、Max-Min振幅)、胃竇環(huán)行肌肌條振幅(Max 振幅、Max-Min 振幅、平均周期頻率)均明顯降低(P< 0.05)；大鼠胃敏感性、乳酸值、胃體縱行肌肌條平均周期頻率均明顯升高(P< 0.05)；而胃竇環(huán)行肌肌條平均振幅、Min 振幅無顯著性(P> 0.05)。黃穗平等[37-38]選用出生3 d的SPF級SD雄性幼鼠，于幼鼠10 ～ 16 d 時給予0.1% IA與2.0%蔗糖的混合液0.2 mL灌胃，以誘導(dǎo)FD模型，灌胃結(jié)束后大鼠正常飼養(yǎng)至8周齡后予采用水環(huán)境小平臺站立法聯(lián)合饑飽失常法[39-40]以誘導(dǎo)脾虛證FD模型，連續(xù)14 d，造模結(jié)束后，與正常組比較，模型大鼠體重、胃排空率顯著降低(P< 0.01)。

新生兒時期胃腸功能是一個特別脆弱的時間窗口，故對新生兒時期胃腸進(jìn)行輕度刺激可導(dǎo)致持續(xù)到成年期慢性胃過敏和運(yùn)動紊亂。因此，實驗中均選用幼鼠進(jìn)行，并以0.2 mL的0.1% IA與2.0%蔗糖的混合液連續(xù)灌胃6 d誘導(dǎo)FD模型。實驗發(fā)現(xiàn)，參與調(diào)節(jié)胃腸道運(yùn)動調(diào)控的重要神經(jīng)遞質(zhì)和旁分泌信號分子GHSR[41]水平明顯降低，故IA可能對GHSR具有抑制作用，從而造成胃腸動力及胃酸分泌功能障礙，進(jìn)而誘發(fā)FD。此外，在研究中發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及胃腸道5-HT、c-fos表達(dá)均明顯升高，5-HT、c-fos表達(dá)的升高均可影響神經(jīng)信號通路的改變而導(dǎo)致內(nèi)臟敏感性增高[42]，這可能與IA對腦腸軸及其調(diào)節(jié)的相關(guān)胃腸激素有密切相關(guān)[43]。故IA能較好地模擬出FD內(nèi)臟高敏感、胃順應(yīng)性降低、胃排空延緩三大病理機(jī)制，是建立FD的良好模型。

2.3 潰瘍性結(jié)腸炎

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是以局限于結(jié)腸的彌漫性黏膜炎癥為特征的慢性疾病[44]。據(jù)推測我國UC患病率約為11.6/10萬[45]，且具有一定的癌變傾向[46]，是當(dāng)前世界醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)、難點(diǎn)之一。故構(gòu)建契合UC發(fā)病特點(diǎn)動物模型對深入研究該病機(jī)制及藥物研發(fā)至關(guān)重要。IA可誘導(dǎo)結(jié)腸炎癥模型，且所誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎在黏膜損傷、炎癥、腹瀉及出血等癥狀與人類相似[24]，能相對較好模擬結(jié)腸病變的發(fā)病機(jī)理。

Rachmilewitz等[24]以6% IA 0.1 mL溶于1 mL 1%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液注入體量為200 ～ 250 g的SD雄性大鼠回腸，結(jié)果成功誘導(dǎo)UC模型，為UC的發(fā)病機(jī)制研究提供了一個潛在的動物模型。Levine等[47]選用雄性Wistar大鼠，以3% IA 0.1 mL溶于1 mL 1% CMC-Na溶液給大鼠灌腸，發(fā)現(xiàn)IA組結(jié)腸可見混合性炎性滲出物的局灶性淺表黏膜潰瘍，部分表現(xiàn)出隱窩膿腫在固有層的顯著炎性浸潤，與對照組比較，IA組炎癥嚴(yán)重程度的參數(shù)，炎癥面積、肉眼炎癥嚴(yán)重程度和顯微鏡下結(jié)腸炎評分均顯著升高(P< 0.05)；Hajj等[48]6% IA 0.1 mL溶于1 mL 1%CMC-Na溶液給大鼠灌腸，并于灌腸48 h后接種0.2 mL含有4×108個大腸埃希菌(EPEC)菌落單位的懸浮液，每周灌腸1次，實驗周期30 d。與對照組相比，模型組大鼠體重增長率明顯降低(P< 0.05)；而肉眼觀察潰瘍評分、MPO活性評分、TNF-α的表達(dá)顯著升高(P< 0.05)。表明使用IA和腸致病性大腸埃希菌構(gòu)建的UC模型，非常類似于人類UC的發(fā)病情況；Deng等[49]以6% IA 0.1 mL溶于1 mL 1% CMC-Na溶液灌腸建立成年UC SD雌性大鼠模型，與對照組相比，IA組的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、內(nèi)皮抑制素、血管抑制素、TNF-α顯著增加(P< 0.05)。Cai等[50]選用SPF級、體重150 ～ 160 g的雌性SD大鼠以6% IA 0.1 mL溶于1 mL 1% CMC-Na溶液灌腸建立UC模型，大鼠出現(xiàn)腹瀉、血便、倦怠、毛發(fā)無光澤、體重下降，結(jié)腸局部擴(kuò)張，多有連續(xù)廣泛的潰瘍，HE染色可見黏膜層腺體紊亂、腺體減少、透壁炎癥及潰瘍，腸組織中的 MPO 活性升高。

綜上所述，在IA誘導(dǎo)UC模型的研究中，單次劑量3%或6% IA即可誘導(dǎo)良好的重現(xiàn)性結(jié)腸損傷，無論是肉眼觀察還是鏡下觀察均可發(fā)現(xiàn)明顯炎癥。VEGF可增加結(jié)腸黏膜的血管通透性，以致?lián)p傷部位的炎癥細(xì)胞浸潤，從而促進(jìn)持續(xù)的慢性炎癥[51]；TNF-α是一種原型促炎細(xì)胞因子和在涉及潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制中各種炎性過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。實驗發(fā)現(xiàn)大鼠結(jié)腸中VEGF、TNF-α顯著增加，或表明IA可能通過上調(diào)VEGF、TNF-α的表達(dá)以促進(jìn)炎性浸潤，從而誘導(dǎo)UC的發(fā)生。此外，有研究指出[51]，在IA灌腸后1至2 h即可觀察到血管通透性增加、大量的黏膜水腫等最初表現(xiàn)，6 ～ 12 h可致糜爛和潰瘍，7 ～ 14 d則表現(xiàn)為廣泛的急性和慢性炎癥。故可根據(jù)時段獲取相應(yīng)形態(tài)學(xué)病變組織樣品用于相應(yīng)研究，IA誘導(dǎo)UC模型具有一定優(yōu)勢。

3 小結(jié)

IA是一種烷基化試劑，其作用于胃腸組織大分子組織蛋白使其發(fā)生烷基化而喪失生理功能，導(dǎo)致胃腸壁組織的損傷及胃腸動力的改變，以誘導(dǎo)CG、FD、UC的發(fā)生。IA建立的消化系統(tǒng)疾病動物模型具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)劑量濃度較低，使用濃度在0.07% ～ 6% 不等；(2)造模時間較短，一般在1 ～ 7 d左右；(3)能誘導(dǎo)胃腸黏膜及功能改變，可基本模擬CG、FD、UC等消化系統(tǒng)疾病發(fā)病病理生理機(jī)制；(4)可誘導(dǎo)焦慮抑郁狀態(tài)，以用于心理精神因素與消化系統(tǒng)疾病關(guān)系的相關(guān)研究；(5)為中醫(yī)構(gòu)建“病證結(jié)合”動物模型提供了良好的前期基礎(chǔ)。但其中仍然存在一定的問題，需要我們重視。因動物種屬、體質(zhì)量、IA劑量、實驗周期與麻醉狀態(tài)等因素的差異，對動物的胃腸道損傷、功能改變的程度及時效也不盡相同，因而影響著造模成功與否。而在以往的實驗研究中，多應(yīng)用此類動物模型進(jìn)行相應(yīng)病理機(jī)制的分子生物學(xué)研究，但較少對IA進(jìn)行藥理學(xué)研究。如何制定標(biāo)準(zhǔn)的造模參數(shù)，保證模型的穩(wěn)定性及相應(yīng)實驗的可行性與準(zhǔn)確性，需要我們對IA誘導(dǎo)動物模型的造模影響因素進(jìn)行深入的探討，以為消化系統(tǒng)疾病的研究提供更為科學(xué)可靠的動物模型。