黃俊杰，劉軍平，陳民利，朱科燕，陳誠(chéng)，呂濤，潘永明

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心，杭州 310053)

隨著社會(huì)發(fā)展和進(jìn)步，人類生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變，以及社會(huì)競(jìng)爭(zhēng)和工作壓力的陡增，使得冠心病、猝死、腦卒中等心腦血管疾病的發(fā)病率呈逐年上升，并伴有年輕化的趨勢(shì)，已嚴(yán)重威脅人類的生命健康安全。動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)。近來(lái)發(fā)現(xiàn)，自主神經(jīng)系統(tǒng)(autonomic nervous system, ANS)紊亂與AS有關(guān)，主要表現(xiàn)為過(guò)度激活交感神經(jīng)系統(tǒng)和副交感神經(jīng)張力降低為特點(diǎn)[1]，同時(shí)自主神經(jīng)還影響血管結(jié)構(gòu)的完整性和內(nèi)皮功能、炎癥及血壓，進(jìn)而影響AS[2]。此外，ANS的障礙可使心臟壓力反射控制能力受損，誘發(fā)心律失?；蜮繹3-4]。因此，干預(yù)ANS并促其恢復(fù)平衡，有望成為治療AS的新途徑。

目前評(píng)估自主神經(jīng)功能的方法主要包括心率變異性(heart rate variability, HRV)和心血管壓力反射敏感性(baroreflex sensitivity, BRS)兩種，其中HRV指逐次心搏間期變異的方法，能定量評(píng)估心臟自主神經(jīng)活性的客觀無(wú)創(chuàng)性檢測(cè)指標(biāo)，可反映交感神經(jīng)和迷走神經(jīng)活性的變化[5]；而BRS是指血壓變化所致反射性心率變化的敏感程度，主要反映迷走神經(jīng)調(diào)節(jié)的變化[6]。目前功能性健康食品在人類心腦血管疾病預(yù)防中已表現(xiàn)出較大的優(yōu)越性，而受到消費(fèi)者的青睞。蜂王漿(royal jelly, RJ)是天然的功能性健康食品，是由5 ～ 15 日齡工蜂頭部營(yíng)養(yǎng)腺(舌腺和顎腺)分泌出來(lái)的一種特殊乳漿狀物質(zhì)，并是蜂王及3 日齡內(nèi)幼蟲的專用食物。大量的研究顯示RJ具有廣泛的藥理作用，如抗衰老、抗自由基、降脂、抗炎和降血壓等[7-8]。而動(dòng)物模型是研究人類疾病病理機(jī)制和治療的主要研究手段之一，關(guān)于ANS在兔AS中作用以及RJ是否具有調(diào)控ANS的作用，目前均還不清楚。因此，本研究采用高脂高糖飲食建立兔AS模型，并基于HRV和BRS分析技術(shù)觀察自主神經(jīng)在兔AS中的作用及蜂王漿干預(yù)效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

普通級(jí)雄性成年日本大耳白兔，18 只，體重為1.8 ～ 2.0 kg，3 ～ 4 月齡，購(gòu)自新昌縣大市聚鎮(zhèn)欣健兔場(chǎng)【SCXK (浙)2015-0004】，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心普通級(jí)實(shí)驗(yàn)室【SYXK(浙)2013-0184】，室溫20 ～ 22℃，相對(duì)濕度40% ～ 60%，12 h/12 h明暗交替。所有操作均符合浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與倫理委員會(huì)要求(倫理批準(zhǔn)號(hào)：ZSLL-2016-114)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與主要試劑和儀器

蜂王漿，由浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院提供。總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)試劑盒，購(gòu)自上海申能德賽診斷技術(shù)有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)試劑盒，購(gòu)自南京建成生物工程研究所；苯腎上腺素(PE)，購(gòu)自上海禾豐制藥有限公司；硝普鈉(SNP)，購(gòu)自浙江佐力藥業(yè)股份有限公司。MedLab-U生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)(MedLab-U/8C，南京美易科技有限公司，中國(guó))，連續(xù)光譜酶標(biāo)儀(Thermo Varioskan Flash，Thermo Fisher公司，芬蘭)，全自動(dòng)生化分析儀(7020，日立，日本)，徠卡病理切片儀(RM2245， 徠卡公司，美國(guó))，全自動(dòng)病理掃描切片儀(Nanozoomer S210，濱松公司，日本)。

1.2 方法

1.2.1 兔AS模型的建立

適應(yīng)性飼養(yǎng)2 周后，隨機(jī)分成3 組，即正常對(duì)照組(normal control group, NC group)、高脂高糖飲食組(high fat/high sugar diet group, HFHSD group)和蜂王漿組(royal jelly group, RJ group)，每組6 只。NC組飼喂普通飼料；HFHSD組飼喂高脂高糖飼料(飼料配方為：0.25%膽固醇，10%起酥油，30%蔗糖，59.75%基礎(chǔ)飼料)。根據(jù)研究[10]表明成年人每日進(jìn)食6 g蜂王漿，4周即可以有效降低血脂，按體表面積換算，每日給予兔400 mg/kg蜂王漿，故RJ組飼喂高脂高糖飼料同時(shí)每次給予 200 mg/kg 蜂王漿，一日兩次，連續(xù)造模12周。

1.2.2 血脂、SOD活性、MDA含量和NO水平的測(cè)定

造模12 周后，所有兔禁食不禁水12 h，然后取耳中動(dòng)脈肝素抗凝血4 mL，3000 r/min 離心15 min，分離血漿，在全自動(dòng)生化分析儀上測(cè)定血脂水平，包括 TC、TG、LDL-C、HDL-C水平，并計(jì)算動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)LDL-C/HDL-C比值。同時(shí)，按試劑盒說(shuō)明書在連續(xù)光譜酶標(biāo)儀上測(cè)定血漿SOD活性、MDA含量和NO水平的變化。

1.2.3 心電圖檢測(cè)及心率變異性(HRV)分析

造模12周后，各組兔胸部剃毛并貼上心電電極片，連接心電電極，穿上自制遙測(cè)馬甲，用EMKA無(wú)創(chuàng)生理信號(hào)遙測(cè)系統(tǒng)，檢測(cè)自由清醒活動(dòng)狀態(tài)下II導(dǎo)聯(lián)心電圖，連續(xù)監(jiān)測(cè)2 h，并按文獻(xiàn)[9]方法進(jìn)行HRV時(shí)域分析[包括RR間期、 RR間期的標(biāo)準(zhǔn)差(SDNN)、相鄰RR間期差值均方根(RMSSD)]和頻域功率譜分析[包括總功率(TP)、極低頻功率(VLF)、低頻功率(LF)、高頻功率(HF)]，然后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算LF和HF [ LFnu或HFnu=LF或HF/(TP-VLF)]以及LF/HF比值。

1.2.4 血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定和心血管壓力反射敏感性(baroreflex sensitivity, BRS)分析

造模12 周后，各組兔耳緣靜脈注射3% 戊巴比妥鈉溶液 30 mg/kg麻醉，待麻醉穩(wěn)定后，呈仰臥位固定，頸部剃毛消毒，行頸部正中切口，仔細(xì)分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、右側(cè)股動(dòng)脈，分別行頸總動(dòng)脈和股動(dòng)脈內(nèi)插管，管內(nèi)充滿50 U/mL肝素鈉生理鹽水溶液，將各動(dòng)脈插管分別與壓力換能器連接，并用MedLab-U/8C生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)記錄曲線變化，其中右側(cè)頸總動(dòng)脈插管插入到左心室內(nèi)，記錄心室內(nèi)壓曲線，觀察左室收縮壓(LVSP)、左室舒張末期壓(LVEDP)、左室內(nèi)壓最大上升速率(LV+ dp/dtmax)和左室內(nèi)壓最大下降速率(LV-dp/dtmax)指標(biāo)的變化；右側(cè)股動(dòng)脈插管記錄血壓曲線，觀察RR間期、收縮壓(SBP)的變化。待手術(shù)結(jié)束后，穩(wěn)定15 min后開始記錄上述指標(biāo)的變化。

心血管壓力反射敏感性(baroreflex sensitivity, BRS)測(cè)定，采用兔耳緣靜脈注射苯腎上腺素或硝普鈉升高或降低血壓，引起反射性RR間期的變化，以RR間期變化值與收縮壓(SBP)變化值的比值代表BRS值。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選定靜脈注射PE 5 μg/kg 升高血壓，引起反射性心動(dòng)過(guò)緩，反映壓力反射對(duì)升壓的敏感性；注射后待血壓恢復(fù)到基礎(chǔ)水平時(shí)，耳緣靜脈注射SNP 5 μg/kg降低血壓，反射性引起心動(dòng)過(guò)速，反映壓力反射對(duì)血壓降低的敏感性。

1.2.5 病理組織學(xué)觀察

(1)主動(dòng)脈粥樣斑塊面積分析

將實(shí)驗(yàn)兔安樂(lè)死后，仔細(xì)分離主動(dòng)脈根部至腹主動(dòng)脈末端的血管，清除血管周邊附屬脂肪組織，在中性甲醛中固定24 h，然后水洗，縱向剖開血管，經(jīng)70%乙醇2 min，蘇丹IV(蘇丹IV 5 g + 70% 乙醇500 mL + 丙醇 500 mL)染色15 min，數(shù)碼拍照，用Image J 軟件分析動(dòng)脈粥樣硬化面積。

(2)主動(dòng)脈血管HE染色

取主動(dòng)脈弓遠(yuǎn)端血管環(huán)5 mm，放入中性甲醛中固定24 h以上，梯度乙醇脫水、石蠟包埋、連續(xù)切片，厚度為6 μm，行HE染色，用全自動(dòng)病理掃描切片儀掃描切片，用Image Pro Plus 6.0 軟件測(cè)量血管內(nèi)中膜的厚度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組體重和血脂水平的變化

造模12 周后，各組兔的體重差異均無(wú)顯著性(P> 0.05)，但與正常對(duì)照組比，高脂高糖飲食組兔血漿TC、TG、LDL-C、HDL-C水平以及LDL-C/HDL-C比值均顯著升高(P< 0.05)；與高脂高糖飲食組比較，蜂王漿組能明顯降低TC、TG、LDL-C水平以及LDL-C/HDL-C比值(P< 0.05,P< 0.01)(表1)。

表1 各組體重和血脂水平的變化Table 1 Changes of body weight and blood lipid levels of the

注：與正常對(duì)照組比，△P< 0.05；與高脂高糖飲食組比，*P< 0.05，**P< 0.01.(下表，圖同)

Note. Compared with the NC group,△P< 0.05. Compared with the HFHSD group，*P< 0.05,**P< 0.01.(The same in the following Figures and Tables)

2.2 各組血漿SOD活性、MDA含量和NO水平的變化

與正常對(duì)照組比，高脂高糖飲食組兔血漿SOD活性和NO水平均顯著下降(P< 0.05)，而MDA含量則顯著升高(P< 0.01)；與高脂高糖飲食組比，蜂王漿組兔血漿SOD活性和NO水平均有明顯升高(P< 0.05，P< 0.01)，而MDA含量則顯著降低(P< 0.05)(圖1)。

2.3 各組心臟血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)的變化

與正常對(duì)照組比，高脂高糖飲食組兔LVEDP均顯著升高(P< 0.05，P< 0.01)，而LVSP、LV +dp/dtmax 和 LV -dp/dtmax則顯著降低(P< 0.05，P< 0.01)；與高脂高糖飲食組比，蜂王漿組能明顯降低LVEDP(P< 0.05，P< 0.01)，并能顯著升高 LVSP、LV +dp/dtmax和LV -dp/dtmax(P< 0.05，P< 0.01)(圖2)。

圖1 各組血漿SOD活性、MDA含量和NO水平的變化Figure 1 Changes of plasma SOD activity, MDA content and NO level in the n=6)

圖2 各組心臟血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)的變化Figure 2 Changes of cardiac hemodynamic parameters in the n=6)

2.4 各組心率變異性(HRV)參數(shù)的變化

與正常對(duì)照組比，高糖高脂飲食組RR間期、SDNN、RMSSD、TP和HFnu指標(biāo)均明顯降低(P< 0.05,P< 0.01)，LFnu和LF/HF比值明顯升高(P< 0.05)；與高糖高脂飲食組比， 蜂王漿組能明顯提高SDNN、RMSSD、TP和HFnu指標(biāo)(P< 0.05,P< 0.01)，顯著降低LFnu和LF/HF比值(P< 0.05)，而對(duì)RR間期差異無(wú)顯著性(P> 0.05)(圖3)。

圖3 各組心率變異性參數(shù)的變化Figure 3 Changes of HRV parameters in the n=4)

2.5 各組心血管壓力反射敏感性BRS的變化

與正常對(duì)照組比，PE或SNP誘導(dǎo)高脂高糖飲食組兔心血管壓力反射敏感性BRS值明顯降低(P< 0.01)；與高脂高糖飲食組比，蜂王漿組能提高PE或SNP誘導(dǎo)的心血管壓力反射敏感性BRS值(P< 0.05)(圖4)。

注：A：PE誘導(dǎo)各組血壓反應(yīng)曲線代表圖，B：SNP誘導(dǎo)各組血壓反應(yīng)曲線代表圖，C：PE和SNP誘導(dǎo)心血管壓力反射敏感性(BRS)值的變化.圖4 各組BRS的變化Note. A. Blood pressure response curve of each group induced by 5 μg/kg PE. B. Blood pressure response curve of each group induced by 5 μg/kg SNP. C. Changes of baroreflex sensitivity (BRS) value induced by PE or SNP. Figure 4 Changes of baroreflex sensitivity (BRS) in the n=6)

2.6 各組主動(dòng)脈病理組織學(xué)評(píng)估

蘇丹IV染色顯示，NC組無(wú)明顯的紅色脂質(zhì)沉積和AS斑塊，高糖高脂飲食組有明顯的紅色脂質(zhì)沉積和AS斑塊，與NC組比較差異有顯著性(P< 0.01)；與高糖高脂飲食組比，蜂王漿組能明顯減少脂質(zhì)沉積和AS斑塊(P< 0.01)(圖5 A和圖5B)。另外，HE染色顯示，NC組主動(dòng)脈內(nèi)膜結(jié)構(gòu)完成且薄，高糖高脂飲食組主動(dòng)脈內(nèi)膜增生明顯，并有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，AS斑塊明顯向管腔內(nèi)凸出，可見大量的泡沫細(xì)胞，中內(nèi)膜結(jié)構(gòu)模糊；而蜂王漿組能明顯減少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和泡沫細(xì)胞等病理改變(圖5C)。定量分析顯示，與NC組比，高糖高脂飲食組內(nèi)膜斑塊面積/管腔面積和內(nèi)中膜厚度明顯增加(P< 0.01)(圖5D)；與高糖高脂飲食組比，蜂王漿組能明顯降低內(nèi)膜斑塊面積/管腔面積和內(nèi)中膜厚度(P< 0.05)(圖5E)。

注：A：各組主動(dòng)脈蘇丹IV染色代表圖，B：主動(dòng)脈斑塊面積百分比，C：各組主動(dòng)脈血管HE病理組織代表圖 (×1.25)及其黑色方框內(nèi)的放大圖(×10)， D: 內(nèi)膜斑塊面積/管腔面積，E：各組內(nèi)中膜厚度。圖5 各組主動(dòng)脈病理組織學(xué)評(píng)估Note. A. The representative images of aorta by Sudan IV staining of each group. B. The percentage of aortic plaque area by Sudan IV staining. C. Representative histopathological image of aortic rings by H&E staining (×1.25) and the enlarged view in the black square frame (× 10). D. Intimal plaque area/ lumen area. E. Intima-media thickness.Figure 5 Histopathological evaluation of aorta in the n=5～6)

3 討 論

本研究以高脂高糖飲食誘導(dǎo)日本大耳白兔AS模型，其主要表現(xiàn)為血脂水平(TC、TG、LDL-C、HDL-C)明顯升高，表明存在明顯的脂質(zhì)代謝紊亂，蘇丹IV染色主動(dòng)脈顯示具有明顯的脂質(zhì)沉積和AS斑塊，同時(shí)HE病理染色顯示血管內(nèi)膜增生明顯，并有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，AS斑塊明顯向管腔內(nèi)凸出，可見大量的泡沫細(xì)胞，中內(nèi)膜結(jié)構(gòu)模糊等病理表現(xiàn)，提示AS模型成立。

AS的發(fā)生與脂質(zhì)代謝異常密切相關(guān)，其中LDL-C具有明顯的致AS作用。本研究結(jié)果顯示HFHSD組TC、TG、LDL-C水平以及LDL-C/HDL-C比值均明顯升高，而給予蜂王漿后能明顯降低上述指標(biāo)，這與 Guo等[10]和Zamami等[11]等研究結(jié)果較為一致，表明蜂王漿能降低TC、LDL-C和TG水平。

ANS紊亂與心肌梗死、冠心病、心力衰竭患者發(fā)生心源性猝死密切相關(guān)。自主神經(jīng)能調(diào)節(jié)血管收縮舒張。同樣本研究也發(fā)現(xiàn)高脂高糖飲食能明顯降低兔的LVSP、LV+dp/dtmax、LV-dp/dtmax，升高LVEDP，提示高脂高糖飲食引起心臟收縮舒張功能減退，而給予蜂王漿后能明顯改善心臟的收縮舒張功能。為進(jìn)一步證實(shí)高脂高糖飲食對(duì)兔ANS的影響，本研究分別采用HRV和BRS進(jìn)行雙重評(píng)估。HRV可反映ANS對(duì)心率的調(diào)控作用，其時(shí)域指標(biāo)和頻域指標(biāo)均可反映交感和副交感神經(jīng)的活動(dòng)及其平衡調(diào)控關(guān)系，以及評(píng)價(jià)由于ANS失衡參與的各種心律紊亂及其影響疾病預(yù)后[12]。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，高脂高糖飲食后兔的RR間期、SDNN、RMSSD、TP、和HFnu指標(biāo)均明顯降低，LFnu和LF/HF指標(biāo)明顯身高，提示高脂高糖飲食能引起日本大耳白兔HRV的降低，同時(shí)交感/副交感神經(jīng)張力平衡發(fā)生紊亂，而這與冠心病、高血壓、心力衰竭、腦卒中等均伴有HRV降低較為一致[12]。蜂王漿干預(yù)后能明顯升高SDNN、RMSSD、TP和HFnu指標(biāo)，降低LFnu和LF/HF比值，提示蜂王漿能夠糾正高脂高糖飲食引起的ANS平衡紊亂。另外，血管壓力反射調(diào)節(jié)(BRS)作為一種負(fù)反饋調(diào)節(jié)是心血管調(diào)控的主要機(jī)制之一，反映血壓變化所致的心率反射性變化的敏感程度，研究表明BRS功能低下與許多心血管疾病有關(guān)[13]。本試驗(yàn)研究表明，高脂高糖飲食后對(duì)PE和SNP所致血壓變化程度均明顯降低，表明高脂高糖飲食所致脂質(zhì)代謝異常導(dǎo)致心血管調(diào)控能力的降低，發(fā)生ANS紊亂，主要表現(xiàn)為HRV和BRS指標(biāo)的降低，使得迷走神經(jīng)活性減退，心血管系統(tǒng)應(yīng)變能力降低，共同促進(jìn)參與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。但蜂王漿干預(yù)后能顯著提高PE和SNP所致BRS值，進(jìn)一步說(shuō)明了蜂王漿改善自主神經(jīng)功能的作用。

另外，氧化應(yīng)激也會(huì)導(dǎo)致交感神經(jīng)活動(dòng)過(guò)度增加，使ANS平衡發(fā)生紊亂。SOD活性的變化可間接反映機(jī)體清除氧自由基能力，同時(shí)MDA含量可反映機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的程度。本研究結(jié)果顯示，高脂高糖飲食能明顯引起兔機(jī)體血清SOD活性下降和MDA含量升高，而蜂王漿能明顯升高SOD活性并降低MDA含量的作用。Honda 等[14]研究表明蜂王漿及其相關(guān)物質(zhì)能延長(zhǎng)線蟲壽命，提示蜂王漿可能含有延壽因子。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)蜂王漿能明顯提高D-半乳糖所致衰老小鼠血清、腦和肝臟組織中的SOD和過(guò)氧化氫酶(CAT)活性，降低丙二醛(MDA)含量，起到延緩衰老的作用[15]。這與本研究結(jié)果較為一致，表明氧化應(yīng)激可能參與兔ANS的紊亂，而蜂王漿可能通過(guò)抗氧化反應(yīng)，促其恢復(fù)ANS平衡。

綜上所述，高脂高糖飲食能加劇氧化應(yīng)激和心臟自主神經(jīng)功能紊亂，促進(jìn)AS發(fā)生；蜂王漿干預(yù)后能抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，調(diào)整自主神經(jīng)功能，延緩AS病變。