于加倍，胡揚(yáng)，李燕春，梅濤，韓天雨，白學(xué)成，付鵬宇，朱镕鑫，車欣媛

(北京體育大學(xué)，北京 100084)

高原訓(xùn)練能夠提升運(yùn)動(dòng)員有氧運(yùn)動(dòng)能力的效果雖已得到普遍肯定，但大多數(shù)教練員在指導(dǎo)實(shí)踐過(guò)程中發(fā)現(xiàn)高原環(huán)境下運(yùn)動(dòng)員的骨骼肌力量下降明顯，其原因可能是低氧誘導(dǎo)的骨骼肌萎縮[1]。高原訓(xùn)練中肌肉的質(zhì)量丟失、力量下降不僅影響運(yùn)動(dòng)員動(dòng)作發(fā)揮，還削弱了高原訓(xùn)練的功效。在諸多運(yùn)動(dòng)方式中抗阻訓(xùn)練對(duì)于骨骼肌的刺激最強(qiáng)烈，具有激活骨骼肌蛋白合成通路、促進(jìn)肌纖維肥大、提高肌肉耐力及爆發(fā)力的作用[2-4]，而關(guān)于長(zhǎng)期低氧環(huán)境下抗阻訓(xùn)練是否有利于維持骨骼肌質(zhì)量及功能這方面的研究還未見(jiàn)報(bào)道。因此本研究摸索低氧環(huán)境下大鼠爬梯訓(xùn)練負(fù)荷及周期，旨在探究抗阻訓(xùn)練是否有利于防止低氧誘導(dǎo)骨骼肌萎縮的發(fā)生，為解決高原環(huán)境下肌力下降、維持訓(xùn)練效果等問(wèn)題提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)8 周齡雄性SD大鼠24 只，體重為(236.40±10.69)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供【SCXK(京)2015-0001】。無(wú)菌飼養(yǎng)和取材過(guò)程在北京體育大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行【SYXK(京)2016-0034】。按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食，動(dòng)物飼養(yǎng)房、低氧室和訓(xùn)練室均保持溫度在22 ～ 25℃，濕度50% ～ 80%，晝夜循環(huán)照明 (光照時(shí)間7:00-19:00)，并按照動(dòng)物使用原則給予人道關(guān)懷(動(dòng)物倫理審批號(hào)：IACUC2017009A)。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為4組：常氧安靜組(C)、常氧抗阻訓(xùn)練組(R)、低氧安靜組(H)和低氧抗阻訓(xùn)練組(HR)。

1.1.2 主要試劑和儀器

大鼠爬梯為本實(shí)驗(yàn)室參考國(guó)內(nèi)外研究自行打造(專利號(hào)：201521113887.1)，生理鹽水(石家莊四藥有限公司)，雙能X射線骨密度儀(Dual Energy X-ray Absorptiometry，美國(guó))，EDTA抗凝血采血管(Insepack，美國(guó))，天平(Sartorius, CP124S，美國(guó))，固定液(Servicebio, G1111，武漢塞維爾生物有限公司)，PBS(天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司)，石蠟(Leica Biosystems，美國(guó))，脫水機(jī)(武漢俊杰電子有限公司，JJ-12 J)，包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司，JB-P5)，切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司，RM2016，美國(guó))，防脫載玻片(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所，F(xiàn)ISH 0010)，正置光學(xué)顯微鏡(尼康，Nikon Eclipse E100，日本)。

1.2 方法

1.2.1 低氧環(huán)境及抗阻訓(xùn)練干預(yù)

低氧干預(yù)前進(jìn)行1周的適應(yīng)性訓(xùn)練，主要目的在于學(xué)習(xí)爬梯，適應(yīng)訓(xùn)練頻率。本研究采用自主打造的大鼠爬梯(專利號(hào)：201521113887.1)，爬梯長(zhǎng)度1.2 m，與地面夾角85°放置。預(yù)訓(xùn)期間無(wú)負(fù)重，大鼠每一次有效攀爬高度為1 m，通過(guò)適當(dāng)刺激大鼠尾部控制每次爬梯動(dòng)作在10 s內(nèi)完成，從而保證訓(xùn)練強(qiáng)度。隔天訓(xùn)練1次，每次訓(xùn)練進(jìn)行3組，每組5次爬梯，組間休息1 min。適應(yīng)性訓(xùn)練結(jié)束后低氧安靜(H)組和低氧抗阻訓(xùn)練組(HR)進(jìn)入模擬海拔高度為4000 m(氧濃度12.4%)的低氧房?？棺栌?xùn)練組(R)和HR組大鼠開始進(jìn)行持續(xù)4周的抗阻爬梯訓(xùn)練，HR組在低氧環(huán)境下進(jìn)行訓(xùn)練，訓(xùn)練頻率和要求與預(yù)訓(xùn)一致。每次訓(xùn)練之前稱量體重，具體訓(xùn)練負(fù)重見(jiàn)表1。

表1 抗阻訓(xùn)練負(fù)重表Table 1 Resistance training load

圖1 大鼠爬梯Figure 1 The rat resistance ladder training

1.2.2 DEXA體成分測(cè)試(Body composition)

低氧和訓(xùn)練結(jié)束后對(duì)大鼠進(jìn)行體成分測(cè)試。末次訓(xùn)練后恢復(fù)1 d，斷食12 h排空腸胃，腹腔注射3%戊巴比妥鈉(3 mL/kg)并采用雙能X射線(DEXA)骨密度儀進(jìn)行測(cè)試。將大鼠完全麻醉后俯臥位放于測(cè)試臺(tái)上，整理大鼠臥姿，使其脊柱保持正中，四肢打開放于體側(cè)。掃描結(jié)束后生成報(bào)告，得到大鼠體重、瘦體重、脂肪總量和瘦體重百分比等數(shù)值。

1.2.3 骨骼肌濕重(Skeletal muscle wet weight)

體成分測(cè)試后大鼠腹主動(dòng)脈取血處死，迅速分離大鼠比目魚肌、腓腸肌、趾長(zhǎng)伸肌、肱二頭肌，并注意用手術(shù)刀剔除肌腱等結(jié)締組織，用濾紙吸除多余的組織液和血液，稱量骨骼肌濕重并記錄，保留小數(shù)后4位。稱量后將肌肉置于固定液中，注意防止?fàn)坷〗M織。

1.2.4 肌纖維橫截面積(Muscle fiber cross-sectional area，CSA)

組織體積與固定液體積比約為3∶7, 將組織修剪為長(zhǎng)寬均為5 mm左右的組織塊，放于標(biāo)記好的包埋盒中。脫水和透明方案如待蠟塊完全凝固后，制作石蠟切片。蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin and eosin staining，HE)浸染切片，顯微鏡觀察染色效果，中性樹膠封片。每組的比目魚肌、腓腸肌、趾長(zhǎng)伸肌、肱二頭肌各選取6張切片，10×10倍鏡下拍照，選取清晰細(xì)胞完整視野，用Image J軟件分析50個(gè)肌纖維細(xì)胞的橫截面積值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 抗阻訓(xùn)練有利于維持低氧環(huán)境下大鼠瘦體重

體成分結(jié)果顯示，H組大鼠平均體重低于C組，差異具有顯著性(P< 0.01)。H組平均瘦體重低于C組，差異具有顯著性(P< 0.01)；HR組瘦體重高于H組，差異具有顯著性(P< 0.01)；HR組脂肪低于C組，差異具有顯著性 (P< 0.01)；HR組瘦體重百分比高于H組，差異具有顯著性(P< 0.05)。

表2 干預(yù)后各組大鼠體成份Table 2 Body composition of the rats after intervention

注：H組與C組相比差異具有顯著性，**P< 0.01；HR組與H組相比差異具有顯著性，&&P< 0.01；HR組與C組相比差異具有顯著性，##P< 0.01。

Note. Very significant Differences were observed when the group H compared with the group C,**P< 0.01. The group HR was significantly higher than the group H,&&P< 0.01. The values of group HR were significantly lower than the group C,##P< 0.01.

2.2 骨骼肌濕重

由表3骨骼肌濕重結(jié)果發(fā)現(xiàn)，常氧下抗阻訓(xùn)練干預(yù)使R組比目魚肌濕重高于C組，差異具有顯著性(P< 0.05)。低氧環(huán)境下可以觀察到H組腓腸肌濕重低于C組且差異具有顯著性(P< 0.05)，H組趾長(zhǎng)伸肌濕重低于C組，差異具有顯著性(P< 0.05)，表明低氧刺激可導(dǎo)致骨骼肌一定程度的萎縮。HR組肱二頭肌濕重高于H組，差異具有顯著性(P< 0.05)。

2.3 肌纖維橫截面積的比較

由表4和圖1可知，在低氧的刺激下，H組的趾長(zhǎng)伸肌肌纖維橫截面積低于C組，差異具有顯著性(P< 0.01)。而抗阻訓(xùn)練抑制肌纖維萎縮的效果可以在肱二頭肌中觀察到，HR組肱二頭肌橫截面積高于H組，結(jié)果差異具有顯著性(P< 0.01)。

表3 干預(yù)后大鼠骨骼肌濕重比較Table 3 Wet weight of rat skeletal muscles after the intervention

注： R組與C組相比差異具有顯著性，§P< 0.05； H組與C組相比差異具有顯著性，*P< 0.05，**P< 0.01； HR組與H組相比差異具有顯著性，&P< 0.05。

Note.Significant difference was observed when the group R was compared with the group C,§P< 0.05. Group H was significantly lower than the group C,*P< 0.05,**P< 0.01. The value of group HR was higher than the group H,&P< 0.05.

表4 干預(yù)后大鼠骨骼肌肌纖維橫截面積對(duì)比(單位：100× mm2)Table 4 Changes of the skeletal muscle fiber cross-sectional area after intervention(Unit：100 × mm2)

注：H組與C組相比差異具有顯著性，**P< 0.01； HR 組與H組相比差異具有顯著性，&P< 0.05。

Note. The group H was significantly lower than group C,**P< 0.01. The value of group HR was higher than the group H,&P< 0.05.

圖2 低氧及抗阻訓(xùn)練干預(yù)下比目魚肌、腓腸肌、趾長(zhǎng)伸肌和肱二頭肌的肌纖維橫截面HE染色切片，10×40倍鏡下拍照(Bar=50 μm)Figure 2 Histological sections of soleus, gastrocnemius muscle, extensor digitorum longus and biceps brachii after hypoxia and resistance training (HE staining, Bar=50 μm)

3 討論

大鼠進(jìn)入低氧環(huán)境4周后，發(fā)現(xiàn)低氧安靜組與常氧安靜組相比，大鼠體重和瘦體重分別下降了9.6%和12.9%，而腓腸肌和趾長(zhǎng)伸肌的濕重也顯著降低(分別下降了2.6%和13.0%)，其中趾長(zhǎng)伸肌橫截面積下降了12.9%，具有明顯差異。以上結(jié)果表明持續(xù)4周低氧(氧濃度12.4%)刺激確實(shí)可誘導(dǎo)發(fā)生大鼠骨骼肌萎縮，此結(jié)果與Martin等[5]報(bào)道的研究結(jié)果相似。 進(jìn)行4周的抗阻訓(xùn)練后，低氧抗阻訓(xùn)練組與低氧安靜組相比，瘦體重和瘦體重百分比分別提高了7.9%和5.7%并具有顯著性差異，肱二頭肌的濕重及肌纖維橫截面積都明顯提高(分別提高7.7%和21.6%)，表明抗阻訓(xùn)練能有效刺激肌纖維肥大并抵抗低氧誘導(dǎo)的骨骼肌萎縮。此外，可以觀察到常氧訓(xùn)練組的腓腸肌濕重顯著高于常氧安靜組，這也符合Faulkner等[6]的關(guān)于抗阻訓(xùn)練對(duì)骨骼肌影響的研究結(jié)果。

高原訓(xùn)練具有提高比賽成績(jī)的效果雖然已得到普遍肯定，但是調(diào)查表明在進(jìn)入高原環(huán)境后運(yùn)動(dòng)員的肌肉力量丟失嚴(yán)重，這與高原低氧誘導(dǎo)的骨骼肌萎縮相關(guān)[6]。骨骼肌是人體最大的組織結(jié)構(gòu)，約占體重的40% ～ 50%，也是控制身體運(yùn)動(dòng)的主要器官。骨骼肌萎縮主要表現(xiàn)為骨骼肌質(zhì)量減少[7]、肌肉功能下降[8]、骨骼肌橫截面積下降[9]、以及肌纖維橫截面積減小[10]。在早期關(guān)于登山項(xiàng)目研究中提到，高原環(huán)境下運(yùn)動(dòng)能力下降、肌萎縮現(xiàn)象可能與營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)[11]，但是更多研究表明低氧環(huán)境是造成骨骼肌萎縮的主要誘因。Hoppeler等[12]報(bào)道長(zhǎng)期暴露于高原環(huán)境下會(huì)發(fā)生體重和肌肉總量的下降，并在8000 m 海拔的低氧刺激會(huì)導(dǎo)致大腿橫截面積萎縮約17%。Hulst等[13]認(rèn)為骨骼肌萎縮情況與低氧劑量(包括氧濃度和適應(yīng)時(shí)間)相關(guān)。

在諸多訓(xùn)練方法中抗阻訓(xùn)練對(duì)刺激骨骼肌生長(zhǎng)的效果最明顯[14]，抗阻練習(xí)目前作為一種抵抗或減緩由衰老、疾病導(dǎo)致肌肉萎縮的非藥物手段已廣泛應(yīng)用于治療中，Perry等[15]對(duì)調(diào)控Ⅱ型糖尿病患者骨骼肌萎縮的蛋白代謝通路進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)力量訓(xùn)練具有抑制萎縮進(jìn)程蔓延的作用；Bondi等[16]以脊髓型肌萎縮小鼠為研究對(duì)象探究治療方法，也認(rèn)為除了開發(fā)新型的藥物身體運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練是抵抗骨骼肌萎縮的重要方法。那么，抗阻訓(xùn)練是否具有抵抗低氧環(huán)境誘導(dǎo)骨骼肌萎縮的效果，將成為解決高原環(huán)境肌力下降的關(guān)鍵。

由于人體實(shí)驗(yàn)具有局限性，很難進(jìn)行深入的相關(guān)分子機(jī)制研究，因此建立成熟的動(dòng)物模型是相關(guān)研究的前提。大鼠爬梯式的抗阻訓(xùn)練相對(duì)于坡度跑臺(tái)更接近人體的力量訓(xùn)練模式，并且更容易控制訓(xùn)練負(fù)荷。本研究前期造模過(guò)程中，共進(jìn)行了三次低氧及抗阻訓(xùn)練對(duì)大鼠骨骼肌影響的摸索，分別進(jìn)行9，14和28 d的低氧抗阻訓(xùn)練干預(yù)后，并觀測(cè)大鼠體重、體成分、骨骼肌濕重、肌纖維橫截面積的變化，發(fā)現(xiàn)模擬海拔4000 m低氧環(huán)境下持續(xù)進(jìn)行4周的抗阻訓(xùn)練后低氧抗阻訓(xùn)練組的瘦體重和部分骨骼肌濕重、肌纖維橫截面積相對(duì)于低氧安靜組明顯提高，表明低氧環(huán)境下進(jìn)行抗阻訓(xùn)練能有效預(yù)防骨骼肌萎縮的發(fā)生。

Kido等[17]研究發(fā)現(xiàn)大鼠進(jìn)行長(zhǎng)期的抗阻訓(xùn)練可使骨骼肌蛋白合成通路IGF-1(insulin-like growth factor-1，胰島素樣生長(zhǎng)因子)/Akt(protein kinase B，蛋白激酶B)的激活從而使骨骼肌肥大。Son等[18]則發(fā)現(xiàn)訓(xùn)練SD大鼠進(jìn)行抗阻練習(xí)可引起跖肌的明顯肥大，而Aguiar等[19]也同樣在對(duì)大鼠進(jìn)行了8 ～ 12周的深蹲訓(xùn)練后發(fā)現(xiàn)其后肢肌纖維橫截面積提高。本研究結(jié)果與以上研究結(jié)果相似，表明抗阻訓(xùn)練有利于低氧環(huán)境下大鼠瘦體重的維持。而上肢肱二頭肌的濕重和肌纖維橫截面積明顯提高，可能與大鼠爬梯時(shí)上肢的提拉作用相關(guān)。

綜上所述，抗阻訓(xùn)練有助于預(yù)防低氧誘導(dǎo)骨骼肌萎縮的發(fā)生，爬梯形式的抗阻練習(xí)可刺激大鼠肱二頭肌的肥大。在本研究的基礎(chǔ)上可進(jìn)一步探究抗阻練習(xí)影響低氧誘導(dǎo)骨骼肌萎縮發(fā)生的分子機(jī)制，不僅有助于探尋有效的訓(xùn)練方法，還將明確低氧造成骨骼肌萎縮的關(guān)鍵調(diào)控因子，為藥物開發(fā)提供靶點(diǎn)。