莫偉彬，楊衍滔，郭艷菊，周彩華，邵曉云

(1. 廣西師范大學(xué)體育學(xué)院，廣西 桂林 541004； 2. 藥用資源化學(xué)與藥物分子工程國家重點(diǎn)實驗室 廣西 桂林 541004； 3. 桂林醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，廣西 桂林 541004)

胃腸運(yùn)動受腸道神經(jīng)系統(tǒng)和體液調(diào)節(jié)的影響，而長時間的激烈運(yùn)動或高強(qiáng)度運(yùn)動應(yīng)激常引起腸道屏障功能受損，腸道微生態(tài)系統(tǒng)紊亂[1]。益生菌是人和動物等宿主有益的微生物。在2001年FAO/WHO(聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織)將益生菌定義為“當(dāng)機(jī)體從膳食中攝入足夠的量，能夠?qū)C(jī)體或宿主產(chǎn)生有益作用的活性微生物”[2]。Del等[3]研究表明，益生菌能夠耐受機(jī)體組織內(nèi)胃液、膽汁和胰臟等分泌物黏附于腸道上皮細(xì)胞的活性微生物。最近研究還發(fā)現(xiàn)，益生菌在機(jī)體內(nèi)具有改善胰島素敏感性與降膽固醇[4]、增強(qiáng)腸道的消炎抗菌、抗氧化和提高肌肉的抗疲勞能力[5]等作用。目前通過益生菌干預(yù)運(yùn)動大鼠胃腸道調(diào)節(jié)激素和水通道蛋白-4 (aquaporim4, AQP4) 變化的研究較少。本研究建立6周的力竭運(yùn)動大鼠模型，觀察益生菌對運(yùn)動大鼠胃腸道功能的影響，為探討高強(qiáng)度運(yùn)動時益生菌對機(jī)體消化系統(tǒng)的影響提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

40只SPF 級SD雄性大鼠，10周齡，體重(250±10) g，購自桂林醫(yī)學(xué)院實驗動物中心【SCXK(桂)2013-0001】。飼養(yǎng)和實驗均在桂林醫(yī)學(xué)院實驗動物中心屏障環(huán)境中進(jìn)行【SYXK(桂)2013-0001】。飼養(yǎng)期間給予大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料及潔凈飲用水(均由桂林醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供)。飼養(yǎng)環(huán)境溫度20 ～ 26℃，濕度60%± 5%。所有操作均符合實驗動物倫理學(xué)要求 (倫理審批號：GLMC201703049)。

1.1.2 益生菌

研究材料為益生菌固體配劑(每100 g益生菌中含長雙歧桿菌1.2 × 1010CFU、兩歧雙歧桿菌1.9 × 1010CFU、嗜熱鏈桿菌3.2 × 109CFU、嗜酸乳桿菌4.6 × 109CFU、德氏乳桿菌保加利亞亞種3.0 × 109CFU)，購于哈爾濱美化生物技術(shù)股份有限公司 (批號：G20110198)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及益生菌灌服量

將大鼠隨機(jī)分為安靜對照組(NC)，運(yùn)動對照組(ME)，安靜給藥組(NCY)，運(yùn)動給藥組(MEY)。動物適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，運(yùn)動對照組和運(yùn)動給藥組進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練1周。每天訓(xùn)練前30 min采用專業(yè)灌胃器灌胃1次，其中安靜給藥組和運(yùn)動給藥組每日灌胃新配制的益生菌10.0 mL / (kg·d)，其中益生菌濃度為107CFU/mL[5]。對照組灌服等量生理鹽水，連續(xù)灌服給藥6周，1次/日，直到實驗結(jié)束。

1.2.2 動物模型與取材

運(yùn)動訓(xùn)練模型按Bedford[6-7]方案進(jìn)行設(shè)計，設(shè)定大鼠運(yùn)動跑臺的速度為19.3 m/min(76%的VO2max左右)，保持此強(qiáng)度至力竭，其中跑臺坡度為5o，每天訓(xùn)練1次，每周6 d，共6周。力竭判斷標(biāo)準(zhǔn)為大鼠四肢伏地，聲光電刺激不能繼續(xù)運(yùn)動。6周力竭訓(xùn)練結(jié)束后大鼠空腹24 h， 用烏拉坦溶液(濃度20%)按3 mL/kg腹腔注射麻醉后解剖，抽取主動脈血液5 mL，放入離心管中，待放2 h后，經(jīng)3500 r/min離心10 min (4℃)，取血清于EP管中，標(biāo)記，-80℃冰箱中保存。取血后迅速解剖取胃和腸，胃沿胃大彎處剪開分為二份，腸組織主要取結(jié)腸部分，然后用冰凍的生理鹽水清洗三次后，濾紙吸干，包裹后放入-80℃冰箱中待測。

1.2.3 大鼠激素指標(biāo)測定

采用酶聯(lián)免疫法測定胃腸激素指標(biāo),大鼠血清ghrelin(生長激素?；?試劑盒(貨號：hj-C1989); PYY(酪酪肽)試劑盒(貨號：hj-C8241); CCK(膽囊收縮素)試劑盒(貨號：C3558)、GLP-1(胰高血糖素樣肽)試劑盒(貨號：C1402); MTL(胃動素)試劑盒(貨號：C1749)和GAS(胃泌素)試劑盒(貨號：C1748)均由上海常斤生物科技有限公司提供,測定方法嚴(yán)格按照說明方法進(jìn)行。測定儀器為酶標(biāo)測定儀(型號：M1000，TeCAn，瑞士)。

1.2.4 大鼠胃腸組織AQP4 mRNA及蛋白表達(dá)的測定

(1)引物合成

大鼠AQP4與β-actin基因引物設(shè)計見表1(由上海生工設(shè)計合成)。

表1 引物序列與擴(kuò)增長度Table 1 Primer sequence and amplification length

(2)AQP4 mRNA檢測

首先，取胃腸組織各100 mg勻漿，各組織的測定嚴(yán)格按照Trizol說明提取總RNA；然后按Fermentas公司生產(chǎn)的反轉(zhuǎn)錄RT-PCR試劑盒說明書取胃腸組織各5.5 μL RNA合成cDNA，其條件:室溫反應(yīng)10 min；42℃，45 min；95℃，5 min；4℃，5 mi)。取各組織cDNA 2.5 μL，上下游引物各0.5 μL，去離子水10 μL，PCR Master Mix 10 μL進(jìn)行PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄，胃腸組織轉(zhuǎn)錄條件均為：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性45 s；55℃退火30 s；40個循環(huán)，72℃延伸5 min。最后，各取10 μL轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于1.5%的瓊脂糖凝膠模板電泳(110 V, 60 min)。用凝膠成像系統(tǒng)(Bioserss-l805型, BD公司, 美國，)分析其灰度值，其比值均采用胃腸組織AQP4 /β-actin來表示。

(3)Western blot 法

取大鼠胃腸組織各200 mg經(jīng)剪碎、液氮研磨并充分裂解后，離心(10 000 rpm/min) 5 min取上清液，胃腸組織均用BCA法測定濃度，各組織以25 μL上樣，經(jīng)10%的SDS-PAGE電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，恒定電流14 V，100 mA，轉(zhuǎn)印2 h后，封閉過夜，加入AQP4、β-Actin一抗過夜，加入二抗孵育1 h，ECL顯色和曝光。用凝膠成像系統(tǒng)對胃腸組織AQP4與β-Actin蛋白條帶的灰度掃描并用比值表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 益生菌對運(yùn)動大鼠胃腸激素含量的比較

ME組大鼠血清ghrelin和PYY含量均高于NC組(P< 0.01)，而ME組大鼠血清CCK、GLP-1、MTL和GAS含量均低于NC組 (P< 0.01)；NCY組大鼠血清ghrelin、PYY均低于ME組 (P< 0.01)但高于NC組，而CCK、GLP-1、MTL和GAS含量均高于ME組 (P< 0.01)；MEY組大鼠血清ghrelin高于NC組 (P< 0.05)而低于ME組 (P< 0.01)；MEY組大鼠血清PYY的含量低于ME組 (P< 0.01)；MEY組大鼠血清CCK含量低于NC組 (P< 0.05)而高于ME組 (P< 0.05)；MEY組大鼠血清GLP-1、MTL和GAS含量均高于ME組 (P< 0.01)。見表2。

表2 益生菌對運(yùn)動大鼠胃腸激素影響的比較Table 2 Comparison of effect of probiotics on the gastrointestinal hormones in the rats during n=10, pg/mL)

注：與NC組比較,“a”示P< 0.05，“b”示P< 0.01；與ME組比較,“c”示P< 0.05；“d”示P< 0.01。

Note. Compared with the NC group, “a” meansP< 0.05, “b” meansP< 0.01. Compared with the ME group, “c” meansP< 0.05, “d” meansP< 0.01.

2.2 大鼠胃腸組織AQP4 mRNA表達(dá)

ME組大鼠胃腸組織AQP4 mRNA表達(dá)均低于NC組 (P< 0.01或P< 0.05)；NCY大鼠胃腸組織AQP4 mRNA表達(dá)均高于ME組(P< 0.01)；MEY 組大鼠胃腸組織AQP4 mRNA表達(dá)均高于ME組(P< 0.01或P< 0.05)，但低于NC組，其中MEY 組大鼠胃腸組織AQP4 mRNA表達(dá)與NC組比較差異無顯著性。見圖1、表3。

2.3 大鼠胃腸組織AQP4蛋白表達(dá)

ME組大鼠胃腸組織AQP4蛋白表達(dá)均低于NC組(P< 0.01)，NCY和MEY組大鼠胃腸組織AQP4蛋白表達(dá)均高于ME組(P< 0.01)。見圖2、表3。

圖1 各組大鼠胃腸組織AQP4 mRNA 產(chǎn)物電泳圖Figure 1 Electrophoresis of AQP4 mRNA product in gastric and intestine tissues each group of rats

圖2 各組大鼠胃腸組織AQP4蛋白表達(dá)Figure 2 AQP4 protein expression in the stomach and intestinal tissues in each group of rats

組別Groups胃水通道蛋白-4 mRNA Stomach AQP4 mRNA腸水通道蛋白-4 mRNA Intestinal AQP4 mRNA胃水通道蛋白-4蛋白 Stomach AQP4 protein腸水通道蛋白-4蛋白Intestinal AQP4 protein安靜對照組NC1.32±0.091.40±0.102.16±0.181.96±0.05運(yùn)動對照組ME0.45±0.13b0.91±0.06 a1.31±0.15 b1.07±0.16b安靜給藥組NCY1.38±0.07d1.45±0.16 d2.19±0.16d1.98±0.13d運(yùn)動給藥組MEY1.27±0.10d1.29±0.21 c1.96±0.05d1.91±0.16 d

注：與NC組比較，“a”示P< 0.05，“b”示P< 0.01；與ME組比較，“c”示P< 0.05；“d”示P< 0.01。

Note. Compared with the NC group, “a” meansP< 0.05, “b” meansP< 0.01. Compared with the ME group, “c” mensP< 0.05, “d” meansP< 0.01.

3 討論

胃腸道作為機(jī)體內(nèi)的內(nèi)分泌器官，存在著大量的微生物菌群，腸道細(xì)菌量達(dá)到1014個以上，在機(jī)體內(nèi)具有相互依賴、制約和維持胃腸道平衡[8]。有研究表明，腸道正常菌群受到破壞時，易引起菌群失調(diào)，導(dǎo)致便秘[9]、胃腸道功能失調(diào)或腫瘤[10]等各類胃腸道疾病。益生菌是人和動物等宿主有益的微生物，對保護(hù)機(jī)體組織中胃和腸道方面具有重要的作用。Schwartz等[11]和Barbara等[12]研究表明，益生菌能夠調(diào)節(jié)腸道炎癥患者的腸道菌群平衡，穩(wěn)定腸道黏膜的屏障和減少胃腸道菌群移位的發(fā)生。Jensen等[13]證明了益生菌與消化性潰瘍和慢性胃炎中的幽門螺桿菌存在拮抗作用，并且能夠抑制幽門螺桿菌的黏附和修復(fù)胃黏膜。因此，研究益生菌干預(yù)運(yùn)動大鼠胃腸道激素具有重要的意義。

胃腸道激素ghrelin、PYY肽、CCK、GLP-1、MTL和GAS對機(jī)體的胃腸道調(diào)節(jié)具有重要的生理作用[14-15]。Wu等[16-17]研究表明，ghrelin具有保護(hù)腸道功能屏障和降低乳酸的堆積等功能。Ashby等[18]和Sloth等[19]研究發(fā)現(xiàn)，PYY是抑制食欲作用的多肽，在機(jī)體內(nèi)具有調(diào)節(jié)能量、減緩腸胃的排空和胃酸分泌的增多。CCK屬CCKRs中G蛋白偶聯(lián)受體的家族成員，具有調(diào)節(jié)腸胃功能和抑制食欲的作用[20-21]。GLP-1屬腸源性腸促胰島素激素，具有抑制胃排空和增加腸道葡萄糖的轉(zhuǎn)化[22]。MTL是由22個氨基酸組成的多肽，具有增加胃腸動力的收縮和刺激胃蛋白酶的分泌[23]。GAS是重要的胃腸道調(diào)節(jié)因素，具有加快胃腸道蠕動、刺激胃酸分泌、促進(jìn)胃內(nèi)因子和膽汁的分泌等作用[23-24]。胃腸道調(diào)節(jié)激素的含量能夠反映胃腸道功能的狀態(tài)，調(diào)節(jié)激素的正常分泌能夠保證胃腸道的消化、吸收和排泄等，以免發(fā)生胃腸道功能失調(diào)。常保榮等[25]研究發(fā)現(xiàn),有氧運(yùn)動能夠提高大鼠血清ghrelin含量，提高大鼠胃排空速率，改善身體成份。有研究表明，節(jié)食減肥引起機(jī)體ghrelin水平升高，PYY和GLP-1的含量受到抑制[26-27]。運(yùn)動結(jié)合飲食干預(yù)后胃腸調(diào)控激素ghrelin水平升高，而PYY水平不變[28]。王茹等[14]對肥胖青少年進(jìn)行為期4周的高住低練與膳食干預(yù)后，實驗組青少年胃腸道調(diào)控激素ghrelin、PYY和GLP-1含量升高，CCK含量有所降低。蔣波等[29]在窒息新生兒飲食中添加益生菌后發(fā)現(xiàn)， 窒息新生兒補(bǔ)充益生菌后體內(nèi)的激素MTL和GAS含量逐漸恢復(fù)到正常的水平，同時表明添加益生菌有利于新生兒腸道的恢復(fù)。本研究發(fā)現(xiàn)，力竭運(yùn)動后大鼠血清ghrelin和PYY含量均顯著升高，這與Martins等[30]研究結(jié)果一致，提示力竭運(yùn)動使機(jī)體糖原的消耗導(dǎo)致能量代謝負(fù)平衡有關(guān)，加速了胃的排空。通過補(bǔ)充益生菌溶液后發(fā)現(xiàn)，大鼠血清ghrelin和PYY含量均高于安靜對照組但與運(yùn)動組比較有一定的差異性，提示這可能是由于益生菌溶液保護(hù)胃腸道在運(yùn)動中發(fā)生異常，防止胃腸道功能紊亂。研究還發(fā)現(xiàn)，力竭運(yùn)動后大鼠血清CCK、GLP-1、MTL和GAS含量均低于安靜對照組。而CCK屬抑制食欲因子，血清中CCK含量的下降表明胃腸分泌量下降，機(jī)體能量消耗加大，食欲增強(qiáng)[7]。力竭運(yùn)動中GLP-1和MTL含量的下降這與鄭必海等[31]研究結(jié)果一致，這可能是由于力竭運(yùn)動引起機(jī)體內(nèi)氧的缺乏，GLP-1和MTL分泌量增加，加速了胃腸動力的排空和能量的消耗，易引起胃腸道黏膜損傷。GAS的下降這可能是由于胃酸分泌增多和能量的消耗存在一定的關(guān)系。通過補(bǔ)充益生菌溶液后發(fā)現(xiàn)，大鼠血清CCK、GLP-1、MTL和GAS含量均有上升的趨勢，逐漸恢復(fù)到安靜時的水平。提示益生菌溶液可能起到調(diào)節(jié)胃腸激素，使胃腸動力和胃液分泌等功能趨于正常，保護(hù)胃腸道損傷和運(yùn)動紊亂。但胃腸道調(diào)節(jié)激素機(jī)制還有待深入研究。

水通道蛋白-4(AQP4)屬水通道蛋白(AQP)特異性轉(zhuǎn)運(yùn)水跨膜蛋白家族成員之一，它的表達(dá)主要存在于胃壁和結(jié)腸組織中[32]；具有維持胃腸道水液代謝平衡、免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞遷移等生理功能[33]。Hardin等[34]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠和人體中的結(jié)腸損傷都與AQP4表達(dá)下調(diào)和AQP4參與了結(jié)腸液體的分泌相關(guān)。楊鵬等[35]研究發(fā)現(xiàn)，活動性胃炎和胃黏膜腺體萎縮與AQP4表達(dá)下調(diào)有關(guān)。趙琴等[36]研究表明，胃和十二指腸有炎癥和腹瀉時，AQP4表達(dá)下降，胃腸道水的重吸收減少，胃腸黏膜的電解質(zhì)失調(diào)，但通過補(bǔ)充藤黃后胃腸道AQP4表達(dá)升高，胃腸道的通透性增加。本研究發(fā)現(xiàn)，力竭運(yùn)動后大鼠胃腸組織AQP4 mRNA和蛋白表達(dá)均低于安靜對照組，提示長時間的力竭運(yùn)動可能導(dǎo)致大鼠胃腸組織黏膜功能受損和胃腸道調(diào)節(jié)激素分泌異常，從而引起胃腸道水液代謝失調(diào)。通過補(bǔ)充益生菌溶液后發(fā)現(xiàn)，大鼠胃腸組織AQP4 mRNA和蛋白表達(dá)均增加，提示AQP4表達(dá)在益生菌的作用下增加可能參與了胃腸水代謝的過程，調(diào)節(jié)了胃腸激素分泌，保證了胃腸道功能的正常。但益生菌溶液在不同強(qiáng)度運(yùn)動方式下對機(jī)體產(chǎn)生的機(jī)制還有待深入研究。