孫昌華，祝清芬，王娜，趙德明

(1. 中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 100193； 2. 山東省食品藥品檢驗研究院，濟南 250101； 3. 濟南極源生物科技有限公司，濟南 25000)

血脂是血漿或血清中所含的脂類，包括膽固醇(cholesterol, Ch)、三酰甘油(triglyceride, TG)、磷脂(phospholipid, PL)和游離脂肪酸(free fatty acid, FFA)等。膽固醇又分為膽固醇酯(cholesteryl ester, CE)和游離膽固醇(free cholesterol, FC)，兩者相加為總膽固醇(total cholesterol, TC)[1-2]。高血脂一般指高血脂癥，即由于脂肪代謝紊亂導致體內(nèi)血脂水平過高而引發(fā)的疾病，一般表現(xiàn)為高膽固醇血癥、高三酰甘油癥或兩者兼有(混合型高血脂癥)[3-4]。大量的流行病學、臨床和實驗研究皆證實，高血脂癥是動脈粥樣硬化的首要危險因素，與冠心病、腦血管疾病的發(fā)病率直接相關[5-7]，也可增加惡性腫瘤的發(fā)生風險[8-11]。高血脂癥及其并發(fā)癥連同其他一些非傳染性疾病如糖尿病等，已成為21世紀醫(yī)療衛(wèi)生領域的重要挑戰(zhàn)。

目前國內(nèi)外對南極磷蝦油對于機體健康影響的研究主要有以下幾個方面：從對血脂的影響來看，南極磷蝦油能顯著降低高脂血癥大鼠血清中的總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)和低密度脂蛋白(LDL-C)含量，降低動脈粥樣硬化指數(shù)(AI)，從而發(fā)揮調(diào)血脂的作用和抗氧化作用[12]。從對血糖的影響上來看，南極磷蝦油可以改善葡萄糖代謝，也可減少肝氧化損傷，降低丙二醛(MDA)含量，增加超氧化物歧化酶(SOD)含量[13]。從對心血管系統(tǒng)的影響來看，南極鱗蝦油通過降低總膽固醇，LDL-膽固醇和三酰甘油以及增加HDL-膽固醇而對心血管疾病風險因子發(fā)揮抑制作用[14]。從對血壓的影響來看，南極鱗蝦油可明顯減低高脂血癥動物模型的收縮壓(SBP)，但是對健康動物模型的收縮壓沒有顯著影響，其可能的機制在于南極鱗蝦油可以顯著提高血清中一氧化氮(NO)和總NO合成酶的水平[15]。從南極鱗蝦油的安全性上來看，機體對于南極磷蝦油增加血漿中的EPA和DHA的耐受性良好，沒有跡象表明對安全性參數(shù)有不良影響[16]。

動物實驗研究表明，多不飽和脂肪酸類中的二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)，可以有效預防和控制高血脂[17]，不飽和脂肪酸一方面可以促進膽固醇的代謝，降低血液中低密度脂蛋白膽固醇和血總膽固醇，另一方面可以軟化血管，維持毛細血管的健康，從而預防和治療高血壓、動脈硬化等心腦血管疾病[18-19]。南極磷蝦油由南極海域野生南極磷蝦提煉而成，含有豐富的磷脂、ω-3多不飽和脂肪酸(EPA、DHA)，其中磷脂含量高達40%，EPA含量在11.90% ～ 28.13%之間，DHA含量在6.91% ～ 13.70%之間；此外還含有蝦青素，維生素A、D、E，動物類黃酮素、甲殼素及微量元素等活性物質，安全無毒副作用[20]。在降低心、腦血管疾病發(fā)生率方面，預防和治療血脂異常是重要的措施之一。目前普遍使用的降脂藥物多以化學合成藥物為主，由于其成本高、價格昂貴，且多有反彈或副作用，不宜選為長期預防用藥。因此，從藥食兼用食物資源中尋找調(diào)脂功能食品，研究其調(diào)脂有效成分，開發(fā)副作用小、成本低，作用穩(wěn)定的保健食品，不失為解決降脂的一個有效方法。鑒于此，本課題對南極磷蝦油輔助降脂的預防與治療作用進行比較性研究，旨在驗證南極磷蝦油輔助降血脂的預防和治療作用，為南極磷蝦油的開發(fā)利用提供科學的試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

5 ～ 6周齡SPF級SD大鼠48只，雄性，體重150 ～ 160 g，購于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司【SCXK(魯)20140007】，飼養(yǎng)于山東省食品藥品檢驗研究院屏障環(huán)境動物實驗室【SYXK(魯)20130012】，環(huán)境溫度20 ～ 26℃，相對濕度40% ～ 70%，動物照明晝夜交替12 h/12 h。本實驗所有操作均符合中華人民共和國《實驗動物管理條例》及實驗動物倫理學要求(倫理審批號：IACUC2017-025)。

1.1.2 南極磷蝦油

濟南極源生物科技有限公司提供，極地紅寶牌南極磷蝦油，總磷脂44.265 g/100 g，EPA 12.59 g/100 g，DHA 8.03 g/100 g，蝦青素285.10 mg/kg。

1.1.3 高血脂飼料

高血脂飼料配方：15%豬油、20%蔗糖、5%酪蛋白、1.2%膽固醇、0.2%膽酸鈉、58.6%基礎飼料，北京科澳協(xié)力飼料有限公司制作【SCXK(京)2014-0010?！?/p>

1.1.4 試劑、耗材

戊巴比妥鈉，美國Sigma公司；蘇丹III、蘇木素、伊紅、二甲苯，國藥集團化學試劑；95%乙醇、無水乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉，天津康科德科技有限公司；甲醛，天津市科密歐化學試劑有限公司；膽固醇(TC)試劑盒、三酰甘油(TG)試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒，四川邁克生物股份有限公司；血液學檢測試劑，德國西門子公司；血清生化促凝管、一次性使用負壓采血管(EDTAK2)、一次性使用靜脈采血針，山東奧賽特醫(yī)療器械有限公司。

1.1.5 儀器

電子天平(Mettler Toledo AL204，梅特勒-托利多(上海)有限公司)；臺式冷凍離心機(Sigma 3-18KS，美國)；全自動生化分析儀(日立7180，日本日立)；全自動血液分析儀(2120i，德國西門子)；CV5030全自動封片機、Autostainer XL自動染色機、ASP 200S全自動封閉脫水機、EG1150C包埋機、RM2245半自動輪轉式切片機、HI1220烤片機、HI1210攤片機、CM1950冷凍切片機(Leica，德國)；蠟塊修復儀(JLX-201，天津市久圣醫(yī)療電子儀器有限公司)；電熱恒溫鼓風干燥箱(DHG-9070 A，上海培因實驗儀器有限公司)；生物顯微鏡(Olympus BX 51，日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組

SD大鼠購進后進入SPF級動物實驗室，檢疫3 ～ 5 d，基礎飼料喂養(yǎng)，檢疫期結束后動物不禁食、不禁水，尾靜脈采血，血液離心后檢測血脂四項(TC、TG、HDL-C、LDL-C)，依據(jù)檢測結果分組，各組均未見統(tǒng)計學差異。48只大鼠分為4組，12只/組，即空白對照組、高脂血癥模型組、南極磷蝦油預防組、南極磷蝦油治療組。

1.2.2 劑量設計

南極磷蝦油人體推薦量為3 g/d，以人體60 kg計，故人體推薦量為0.05 g/(kg.d)。通常受試物劑量設定以人體推薦量的5倍為其中的一個劑量組，按等差或等比另設兩個劑量組，高劑量組不超過人體推薦量的30倍[21-24]。本實驗蝦油預防組及治療組均以人體推薦量的30倍(最高劑量)為設計劑量即1.5 g/kg，給藥體積10 mL/kg。

1.2.3 建立高脂血癥大鼠模型

保健食品技術指導原則要求造模期為1 ～ 2周[21-24]，本研究的造模期為12 d。造模前14 d內(nèi)，蝦油預防組大鼠連續(xù)給予蝦油、基礎飼料喂養(yǎng)；空白對照組、高脂血癥模型組、蝦油治療組大鼠均給予基礎飼料。造模期12 d內(nèi)，蝦油預防組大鼠連續(xù)給予蝦油，高血脂飼料喂養(yǎng)；空白對照組大鼠給予基礎飼料；高脂血癥模型組大鼠給予高血脂飼料；蝦油治療組大鼠給予蝦油，高血脂飼料喂養(yǎng)。造模結束后動物不禁食、不禁水，眼靜脈叢取血，血液離心后檢測TC、TG、HDL-C、LDL-C，依據(jù)結果判斷各組動物造模情況。

1.2.4 實驗處理

造模成功后，高脂血癥模型組、蝦油預防組和治療組繼續(xù)喂養(yǎng)高血脂飼料，蝦油預防組和治療組均給予相同體積的蝦油；空白對照組喂養(yǎng)基礎飼料，給予相同體積的蒸餾水。給藥30 d后不禁食、不禁水，10%戊巴比妥鈉麻醉后腹主動脈采血，檢測血脂四項及血液學指標。動物主要組織臟器稱重，4%中性甲醛溶液固定，石蠟切片，HE染色及蘇丹Ⅲ染色鏡檢。

1.2.5 結果判定

輔助降低血脂功能判定：TC、TG、HDL-C、LDL-C血脂四項指標中，模型對照組與空白對照組相比，血清TG升高，血清TC或LDL-C升高，差異均有顯著性，判定模型成立。各劑量組與模型對照組相比，任一劑量組血清TC或LDL-C降低，差異均有顯著性，同時各劑量組比較，血清TG不顯著高于模型對照組，各劑量組血清HDL-C不顯著低于模型對照組，可判定該受試樣品輔助降低血清TC功能動物實驗結果陽性[21-24]。

1.3 統(tǒng)計方法

2 結果

2.1 高脂血癥大鼠模型的建立

高脂血癥模型組、蝦油治療組動物血清LDL-C與空白對照組比較升高明顯，差異有顯著性(P< 0.01)，TC、TG、HDL-C與空白對照組比較TC、TG升高，HDL-C降低，差異有顯著性(P< 0.05)，結合高脂造模結果判定標準，說明本次試驗高脂血癥模型組、蝦油治療組造模成功。蝦油預防組動物血清TG與空白對照組比較升高明顯，差異有顯著性(P< 0.05)，TC、HDL-C、LDL-C與空白對照組比較變化不明顯，差異無顯著性(P> 0.05)，不符合高脂血癥模型標準，初步證明蝦油預防給藥有輔助降血脂TC、HDL-C、LDL-C的作用。(表1)

2.2 南極磷蝦油對SD大鼠臟器系數(shù)的影響

空白對照組與高脂血癥模型組比較，高脂血癥模型組肝臟器系數(shù)明顯升高，差異有顯著性(P< 0.01)，結合肝大體病變及組織病理學檢查結果，表明高脂血癥模型組造模成功。蝦油預防組、治療組與高脂血癥模型組相比，其他各臟器系數(shù)差異無顯著性(P> 0.05)。(表2)

表1 高脂血癥大鼠模型的建立Table 1 Establishment of the rat model of hyperlipidemia

注：各劑量組與空白對照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note.*P< 0.05,**P< 0.01, each dose group compared with the blank control group.

表2 南極磷蝦油對SD大鼠臟器系數(shù)的影響Table 2 Effect of Antarctic krill oil on the organ coefficient of SD rats

注：各劑量組與高脂血癥模型組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note.*P< 0.05,**P< 0.01, each dose group compared with the hyperlipidemia model group.

2.3 南極磷蝦油對SD大鼠血清血脂的影響

2.3.1 南極磷蝦油對SD大鼠血清TC的影響

空白對照組血清TC與高脂血癥模型組比較，高脂血癥模型組明顯升高，差異有顯著性(P< 0.01)，符合高脂血癥造模成功標準。蝦油預防給藥能使大鼠血清TC降低，與高脂血癥模型組比較差異有顯著性(P< 0.05)。蝦油治療組動物血清TC與高脂血癥模型組比較未見降低，差異無顯著性(P> 0.05)，說明蝦油治療給藥降低TC作用不明顯。(表3)

2.3.2 南極磷蝦油對SD大鼠血清TG的影響

空白對照組血清TG與高脂血癥模型組比較，高脂血癥模型組明顯升高，差異有顯著性(P< 0.01)，蝦油預防組及蝦油治療組血清TG與高脂血癥模型組比較未見降低，差異無顯著性(P> 0.05)，說明蝦油降低TG的作用不明顯。(表3)

2.3.3 南極磷蝦油對SD大鼠血清HDL-C的影響

空白對照組、蝦油預防組及蝦油治療組血清HDL-C與高脂血癥模型組比較未見升高，差異無顯著性(P> 0.05)，說明蝦油升高HDL-C作用不明顯。(表3)

2.3.4 南極磷蝦油對SD大鼠血清LDL-C的影響

空白對照組血清LDL-C與高脂血癥模型組比較，高脂血癥模型組明顯升高，差異有顯著性(P< 0.01)。蝦油預防組血清LDL-C與高脂血癥模型組比較呈降低趨勢，差異有顯著性(P< 0.05)，說明蝦油預防給藥對大鼠血清中的LDL-C具有降低作用。蝦油治療組動物血清LDL-C與高脂血癥模型組比較降低趨勢不明顯，差異無顯著性(P> 0.05)，說明蝦油治療給藥降低LDL-C的作用不明顯。(表3)

2.4 南極磷蝦油對SD大鼠血液學指標的影響

空白對照組、蝦油預防組、蝦油治療組與高脂血癥模型組比較各檢測指標變化不明顯，差異無顯著性(P>0.05)，說明蝦油對動物體內(nèi)血液學各項檢測指標影響不明顯。(表4)

表3 南極磷蝦油對SD大鼠血清血脂的影響Table 3 Effect of Antarctic krill oil on the serum lipids in SD rats

注：各劑量組與高脂血癥模型組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note.*P< 0.05,**P< 0.01, each dose group compared with the hyperlipidemia model group.

表4 南極磷蝦油對SD大鼠血液學指標的影響Table 4 Effect of Atarctic krill oil on the hematological parameters in SD

注：各劑量組與高脂血癥模型組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note.*P< 0.05,**P< 0.01, each dose group compared with the hyperlipidemia model group.

2.5 南極磷蝦油對SD大鼠肝病理學檢查的影響

2.5.1 大體病理學檢查結果

實驗各組大鼠經(jīng)麻醉腹主動脈采血處死解剖進行大體病理學檢查，空白對照組肝呈暗紅色，邊緣較尖，肝體積與高脂血癥模型組比較未見明顯增大；高脂血癥模型組肝呈灰白色，體積增大，邊緣鈍圓，呈檳榔肝狀，屬于典型的脂肪肝；蝦油預防組及治療組動物肝呈淡紅色，其色澤改變不明顯。

2.5.2 組織病理學檢查結果

(1)大鼠肝的病理學檢查結果 空白對照組肝未見鏡下病變，肝小葉結構清晰，肝細胞索排列整齊，細胞質均勻紅染，細胞核清晰且位于細胞中央。高脂血癥模型組大鼠肝呈彌漫性脂肪變性，肝細胞排列紊亂，胞質內(nèi)見大小不等的脂滴空泡，胞核被擠向邊緣且體積增大，肝竇閉鎖，肝小葉結構的輪廓模糊不清，提示高脂血癥模型組動物造模成功。蝦油預防組和治療組大鼠肝結構完整，與高脂血癥模型組相比較肝細胞排列整齊，肝細胞脂肪變性的范圍小且程度輕，提示蝦油預防組和治療組具有改善高血脂大鼠肝細胞脂肪變性的作用，且預防組的效果較為明顯。見圖1。

注：A. 空白對照組，B. 高脂血癥模型組，C. 蝦油預防組，D. 蝦油治療組。圖1 肝組織的病理學改變(HE染色)Note. A. Blank control group. B. hyperlipidemia model group. C. Krill oil prevention group. D. Krill oil treatment group.Figure 1 Histological changes in the rat liver tissues(HE staining)

(2)大鼠肝冷凍切片脂肪染色(蘇丹Ⅲ染色)組織病理學檢查結果 空白對照組肝細胞排列整齊，匯管區(qū)周圍肝細胞內(nèi)偶見少量橘紅色脂滴，范圍小且程度輕，其它區(qū)域肝細胞內(nèi)未見明顯的橘紅色脂滴沉積。高脂血癥模型組肝細胞排列紊亂，肝細胞內(nèi)積聚大量橘紅色脂滴，肝細胞脂肪變性范圍廣且程度重。蝦油預防組和治療組大鼠肝與高脂血癥模型組相比較，肝細胞排列整齊，肝細胞內(nèi)的橘紅色脂滴呈減少趨勢，蝦油預防組較為明顯。見圖2。

3 討論

醫(yī)學研究已經(jīng)證實，高血脂是導致心血管疾病的關鍵因素，隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快及人們飲食結構的改變，高血脂低齡化趨勢日趨明顯。因此，預防和治療血脂及其心腦血管疾病已成為公共衛(wèi)生學領域的一個重大課題。近年來保健食品行業(yè)發(fā)展迅猛，人們對養(yǎng)生保健越來越重視，希望在無副作用的前提下，選擇服用一些具有調(diào)節(jié)血脂作用的保健食品成為了許多人的首選。

人體必需脂肪酸主要有兩大類，一類是以α-亞麻酸為母體的ω-3系列多不飽和脂肪酸；另一類是以亞油酸為母體的ω-6系列多不飽和脂肪酸。國內(nèi)外對多不飽和脂肪酸的降脂機理研究比較多[25-31]，ω-3多不飽和脂肪酸屬于人體必需脂肪酸，主要包括二十碳五烯酸(eicosapentanoic acid, EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexanoic acid, DHA)。人體自身合成EPA、DHA的效率極低，必須從日常膳食中攝取，海洋動物是ω-3脂肪酸最好的天然來源[32]。許多研究表明，血液中較高濃度的EPA和DHA會促進人類身體健康，因此血液中ω-3脂肪酸的積累就顯得尤為重要[33]。許多科學研究還證明，ω-3有益于預防和治療冠心病、糖尿病、類風濕、皮炎、癌癥、抑郁癥、神經(jīng)分裂癥、癡呆、過敏、哮喘、腎病和慢性阻塞性肺病等[32,34]。南極磷蝦油中ω-3多不飽和脂肪酸EPA和DHA含量很高，并以ω-3磷脂的形式存在[35-36]。DHA還具有改善記憶的顯著作用[37]。魚油中含有的ω-3脂肪酸以三酰甘油的形式存在，不溶于水，不易被吸收、利用[32]。南極磷蝦油中的ω-3脂肪酸大部分以磷脂的形式存在，即ω-3脂肪酸附著于磷脂上，能與水混合，這種生物活性復合分子在通過胃后就可以直接進入小腸完全吸收，增加了生物利用度，并最終提高了ω-3:ω-6脂肪酸比例[38]。實驗顯示，南極磷蝦油生物活性復合分子的生物利用度為95% ～ 98%，而魚油的生物利用度僅61% ～ 64%，主要原因是南極磷蝦油含的是磷脂脂肪酸，而魚油含的幾乎是100%的三酰甘油[39-40]。Kevin等[41]、Stine等[42]的研究也充分說明磷蝦油中的ω-3脂肪酸更易被人體所吸收，具有更高的生物利用效率。

本文實驗結果表明，南極磷蝦蝦油預防組和治療組在1.5 g/kg相同劑量條件下，蝦油預防給藥可使大鼠血清TC、LDL-C降低，差異有統(tǒng)計學顯著性；肝病理學檢查結果提示，蝦油預防給藥對于改善肝細胞脂肪變性的效果較為明顯，綜合分析，蝦油預防給藥具有輔助降低血脂TC的作用，有很高的開發(fā)利用價值，在未來的保健食品領域顯示廣闊的應用前景。