戎亦驪，潘永明，黃俊杰，徐孝平，朱科燕，陳方明，陳民利

(浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心/比較醫(yī)學研究所，杭州 310053)

高血壓(hypertension)是一種最常見的復雜多因素的慢性疾病，其形成與遺傳和環(huán)境因素密切相關，導致正常血壓調節(jié)機制失代償所造成。因此，對高血壓的發(fā)病機制和防治研究一直是醫(yī)學領域研究的熱點。流行病學和大量臨床實踐表明高脂飲食和鹽的攝入量與高血壓發(fā)病率、平均血壓水平密切相關，已成為高血壓發(fā)病的主要環(huán)境因素[1]。

近來，關于高血壓疾病動物模型主要以大小鼠為主，多為自發(fā)性、鹽敏感性以及采用手術法結扎腎動脈而建立的高血壓模型[2-4]。這類模型遺傳背景較明確且性狀穩(wěn)定，但與人類的種屬差異較大。此外，轉基因動物模型如TGR(mREN2)27轉基因大鼠[5]及敲除血管緊張素轉化酶或血管緊張素II-1型受體基因的小鼠等，僅適宜探究特定基因在高血壓發(fā)病中的機制，不能完全反映人類高血壓疾病的發(fā)生，并對技術要求較高。而小型豬的心血管、消化代謝、解剖結構和分布等方面與人類十分相似，體型較小，易于飼養(yǎng)管理，是研究代謝性心血管疾病非常理想的動物模型。因此，本文利用小型豬作為研究對象，采用高脂高鹽飲食環(huán)境因素更能模擬人類自然狀態(tài)下高血壓發(fā)生進程，也能更好的適用于研究人類高血壓發(fā)生的病理機理，為高血壓的防控與治療提供新的研究手段和途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

普通級4 ～ 5月齡巴馬小型豬18只，雄性，體重為8 ～ 10 kg，由吳江市田宇生物科技有限公司提供【SCXK(蘇)2016-0006】，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心普通級實驗室【SYXK(浙)2013-0184】，環(huán)境溫度為(22±1)℃，相對濕度為45% ～ 65%。飼喂全價營養(yǎng)飼料和自由飲水，12 h/12 h明暗交替，所有小型豬的操作程序均符合浙江中醫(yī)藥大學動物實驗管理與倫理委員會要求(倫理批準號：ZLL-2016-160)。

1.1.2 主要儀器和試劑

血糖(GLU)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)等試劑盒均購自上海申能德賽診斷技術有限公司；內皮素1(ET-1)、腎素(renin)、血管緊張素II(Ang II)、水通道蛋白-2(AQP-2)、血管加壓素(AVP)、血管內皮生長因子(VEGF)等ELISA試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；全自動生化分析儀(7020，日立公司，日本)、連續(xù)光譜酶標儀(Thermo Varioskan Flash，Thermo Fisher 公司，芬蘭)；大動物無創(chuàng)生理信號遙測系統(tǒng)(EMKA公司，法國)，冷凍病理切片儀(CM1900，徠卡公司，美國)，全自動病理掃描切片儀(Nanozoomer S210，濱松公司，日本)。

1.2 方法

1.2.1 造模方法

適應性飼養(yǎng)觀察3周后，巴馬小型豬禁食不禁水12 h后前腔靜脈穿刺取血，測定肝腎功能、血脂等指標均無異常者后，按體重隨機分成正常對照組(normal control group, NC)、高脂組(high fat diet group, HF)和高脂高鹽組(high fat /high salt diet group, HFHS)，每組6只。NC組每天飼喂基礎飼料，HF組每天飼喂高脂飼料(1.5%膽固醇，15%油脂，10%蛋黃粉，73.5%基礎飼料)，HFHS組每天飼喂高脂高鹽飼料(4%食鹽，1.5%膽固醇，15%油脂，10%蛋黃粉，69.5%基礎飼料)，各組均按體重 2.5%的飼喂量分成兩等份，一日兩次，每2周稱重并調整飼喂量。造模期間每天觀察各組巴馬小型豬的精神行為、飲食飲水和糞便尿液，記錄造模24周時小型豬體重。造模24周后處死各組動物，取樣檢測。

1.2.2 觀察指標

(1)生化指標測定

取造模后24 周各組巴馬小型豬的前腔靜脈肝素抗凝血3 mL，分離血漿，測定血糖(GLU)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)。

(2)無創(chuàng)血壓測定

在造模8周、16周和24周時，對巴馬小型豬進行為期3 d的吊床適應訓練，然后固定在吊床適應15分鐘后，采用袖套法用EMKA無創(chuàng)生理遙測系統(tǒng)監(jiān)測小型豬尾部動脈血壓，分析收縮壓(SBP)和舒張壓(DBP)。

(3)ET-1、Renin、Ang-II、AQP-2、AVP和VEGF含量測定

按ELISA試劑盒說明書，檢測造模后24周時各組血漿中內皮素1(ET-1)、腎素(Renin)、血管緊張II(Ang II)、水通道蛋白-2(AQP-2)、血管加壓素(AVP)和血管內皮生長因子(VEGF)的水平。

(4)肝、腎重量和病理組織學觀察

造模結束后，用3%戊巴比妥鈉溶液1.0 mL/kg耳緣靜脈注射麻醉后并放血處死小型豬，取各組小型豬的肝及左右兩側腎并稱重，同時取部分肝和腎組織進行冰凍切片，切片厚度為8 μm，進行油紅O染色，觀察肝及腎病理變化和脂質沉積情況。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 一般觀察和生化檢測

由表1可見，在造模期間，NC組小型豬的精神行為良好，毛色光澤，飲食飲水和糞便尿液等均無明顯異常，且體重呈正常模式增長；HF組小型豬的精神行為良好，毛色油膩，飲食飲水和糞便尿液均未見明顯異常，但體重顯著高于NC組(P< 0.01)；另外，HFHS組小型豬的精神行為尚可，毛色油膩且枯燥，飲食飲水和糞便尿液亦未見異常，體重亦明顯高于NC組(P< 0.05)。與NC組比，HF組和HFHS組小型豬TC和CREA水平均顯著增加(P< 0.05,P< 0.01)；同時HFHS組BUN水平亦顯著降低(P<0.05)，其余指標各組間差異均無顯著性(P> 0.05)。

表1 血糖血脂和肝腎功能Table 1 Blood glucose and lipids, and liver and kidney function of the n=6)

注：與NC組比，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with the NC group,*P< 0.05,**P< 0.01.

2.2 血壓變化

由圖1可見，在造模期間，NC組SBP和DBP均穩(wěn)定在一定的水平，未見明顯的變化。但造模8周后HF組和HFHS組小型豬的血壓均明顯升高，其中HFHS組造模8周時SBP已超過130 mmHg且DBP達到80 mmHg以上，已達到臨床1級高血壓標準，造模至24周時SBP能繼續(xù)穩(wěn)定在130 mmHg以上且DBP有繼續(xù)升高并達到95 mmHg以上，而HF組SBP在高脂飼喂24周時血壓剛達到130 mmHg且DBP亦超過90 mmHg以上；且HFHS組SBP和DBP的上升曲線均高于HF組。與NC組比，造模后24周時SBP和DBP均顯著高于NC組(P< 0.05，P< 0.01)。

注：A和B分別為造模8,16,24周時各組收縮壓和舒張壓的變化曲線；C和D分別為造模24周時各組收縮壓和舒張壓變化。與NC組比，*P< 0.05,**P< 0.01。(下圖同)圖1 收縮壓及舒張壓變化Note. Figures A and B are the changes of systolic pressure and diastolic pressure in each group at 8, 16, and 24 weeks after modeling, respectively. Figures C and D are the changes of systolic pressure and diastolic pressure in each group at 24 weeks after modeling. Compared with the NC group,*P< 0.05,**P< 0.01.(The same in the following Figures)Figure 1 Changes of systolic and diastolic blood pressures in the minipigs

圖2 ET-1、Renin、Ang-II、AQP-2、AVP和VEGF含量Figure 2 The contents of ET-1 (A), renin (B), Ang II (C), AQP-2 (D), AVP (E) and VEGF (F) in the minipigs

2.3 ET-1、Renin、Ang-II、AQP-2、AVP和VEGF含量

由圖2可見，與NC組比，HF組除ET-1含量顯著升高(P< 0.05)外，其余指標亦有升高趨勢，但差異無顯著性(P> 0.05)，而HFHS組的ET-1、Renin、Ang-II、AQP-2、AVP的含量均顯著升高(P< 0.05，P< 0.01)，且VEGF含量亦有升高趨勢，但差異無顯著性(P> 0.05)。

2.4 肝、腎指數(shù)與組織病理學觀察

由圖3A/C可見，與NC組比，HF組和HFHS組小型豬肝和腎臟指數(shù)均顯著增加(P< 0.05，P< 0.01)；油紅“O”染色顯示，NC組肝、腎未見明顯的脂質沉積和異常的病理改變，HF組和HFHS組小型豬肝肝小葉和腎間質中均有脂質沉積，但HF組肝和腎組織中脂肪沉積均高于HFHS組(圖3B/D)；同時HF組和HFHS組小型豬腎小球直徑增大，腎小管擴張和腎小動脈管壁增厚； HFHS組腎內有明顯的炎癥細胞浸潤(圖3B)。

注：圖A為各組腎臟系數(shù)，圖C為各組肝臟系數(shù)，圖B和圖D為腎組織及肝組織油紅O染色，黑色箭頭所示為脂質沉積。圖3 肝、腎指數(shù)與組織油紅“O”染色病理變化Note. A. The kidney coefficient in each group. C. The liver coefficient in each group. B,D. Pathological changes of kidney and liver in each group, oil red O staining. The black arrow shows lipid deposition.Figure 3 Liver and kidney coefficients and pathological changes revealed by oil red “O” staining

3 討論

隨著人們生活水平的提高和飲食方式的改變，高脂、高鹽飲食在當前人類飲食譜中普遍存在，但隨之而來的各種代謝性疾病的發(fā)生率呈高發(fā)趨勢，如高血壓、高血脂和冠心病等，嚴重影響著人類的生命健康。在我國，北方和寒冷地區(qū)的人群鹽攝入量高于南方和沿海地區(qū)，其人群的平均血壓及高血壓患病率也相應較高[6]。另一方面長期攝入高脂食物的人易發(fā)生肥胖，而肥胖的人皮下脂肪會增厚，使毛細血管擴充，血液循環(huán)量相對增加，在心率正常的情況下，心搏出量大為增加，長期負擔過重則會誘發(fā)左心肥厚，從而引起血壓升高[7]。由此可見，高鹽和高脂的攝入與高血壓患病率均密切相關，故從環(huán)境因素—飲食的角度，研究并建立高血壓疾病動物模型，對高血壓疾病的預防和干預具有重要意義。本研究采用高脂高鹽飲食建立巴馬小型豬高血壓模型，本研究發(fā)現(xiàn)小型豬高脂高鹽飲食后表現(xiàn)出體重增加、TC和CREA水平均顯著升高，BUN水平降低，并出現(xiàn)肝、腎指數(shù)升高等生理變化，表明高脂高鹽飲食能導致小型豬脂質代謝和腎代謝功能的紊亂，并在誘導8周后SBP達到(131.67±5.27)mmHg，DBP達到(86.15±3.67)mmHg，已達到最新美國高血壓指南中高血壓1期的標準[SBP：(130～139) mmHg/DBP：(80～89) mmHg為1級高血壓][8]，繼續(xù)造模至24周時SBP略有上升且維持在130 mmHg以上，同時DBP水平持續(xù)升高并達到(95.17±3.68)mmHg；同時本研究發(fā)現(xiàn)單純高脂飲食誘導后小型豬血壓亦有所增高，但病程發(fā)展較緩慢，直到造模至24周時才達到高血壓1級標準，即SBP為(130.18±4.51)mmHg，DBP為(90.44±2.56)mmHg。由此可見，高脂高鹽飲食能明顯縮短小型豬高血壓造模時間，加速血壓升高。

本研究發(fā)現(xiàn)高鹽和高脂飲食雖無明顯引起小型豬肝功能的異常，但本研究采用相同的喂養(yǎng)方式且小型豬吃這兩種飲食能量和代謝情況也相差無幾，卻意外發(fā)現(xiàn)HFHS組小型豬的體重增長卻低于HF組，這是否提示鹽飲食對消化效率有著相對顯著的影響，鹽可能減少機體對食物中脂肪的吸收，而這一現(xiàn)象在油紅O病理染色中也同樣觀察到HFHS組肝和腎脂肪沉積均低于HF組；而這結果與Benjamin 等[9]發(fā)現(xiàn)鈉飲食能抑制高脂飲食小鼠的體重較為一致，表明鈉降低消化道對食物中脂肪的吸收有關。

大量的研究已證實，腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)在調節(jié)血壓和水鹽代謝環(huán)節(jié)中起著樞紐作用，其中Ang II是維持和升高血壓的關鍵核心因子，不僅能引起血管的收縮，還能促進細胞增殖以及細胞外基質的增多，并能誘導血管壁產生氧化應激，導致血管內皮功能的紊亂等[10-11]。本研究中同樣觀察到高脂高鹽飲食后小型豬體內血漿內皮素-1、腎素和血管緊張素II水平均明顯升高，但單純高脂飲食組僅表現(xiàn)出血漿內皮素-1水平的升高，對腎素和血管緊張素II水平雖有升高趨勢但未見明顯差異，這也表明高鹽的因素加入不僅促進高脂飲食誘導的血管內皮功能紊亂，還激活了RAS系統(tǒng)，導致高血壓的發(fā)生。

近來研究發(fā)現(xiàn)高脂高鹽飲食或鹽飲食能促進大鼠腎的損傷[12-13]，并在鹽性高血壓大鼠中腎AQP-2表達明顯增加[14]。腎是調節(jié)機體水平衡的主要器官，其AQPs含量最為豐富，而AQP-2僅見于腎集合管主細胞管腔側膜及胞內囊泡內，是水通道蛋白家族中的主要成員之一，是腎重吸收水分、尿液濃縮、調節(jié)水平衡的關鍵蛋白，也是腎內外參與水代謝有關紊亂性疾病重要的分子基礎[15]。因此，AQP-2在調節(jié)機體腎水平衡時發(fā)揮重要的作用。但最近發(fā)現(xiàn)血管加壓素(AVP)靶向通過環(huán)磷酸腺苷(cAMP)機制調節(jié)AQP-2的表達，進而影響水的重吸收，導致水鈉潴留[16]，故AQP-2是AVP依賴性水通道蛋白，且加壓素受體2能通過激活蛋白激酶A，調節(jié)腎集合管對水的通透性[17]。在本研究中發(fā)現(xiàn)長期高脂高鹽飲食后小型豬的腎指數(shù)增加且CREA水平也明顯升高，腎間質有脂質沉積，腎小管擴張以及腎小動脈管壁增厚和腎小球直徑增加等病理改變，這些異常改變證實了高脂高鹽飲食能導致靶器官腎損傷。進一步發(fā)現(xiàn)高脂高鹽飲食后小型豬血漿AQP-2和AVP水平也出現(xiàn)顯著性升高，而在高脂組中差異無顯著性，提示高脂高鹽飲食能激活小型豬機體的AVP系統(tǒng)，導致水鈉潴留增加，進一步使得舒張壓升高，促進血壓上升。