施蕾，林潔平，廖淑珍，招春飛，劉華鋒，潘慶軍

(湛江市慢性腎臟病防控重點實驗室，廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院腎臟疾病研究所，廣東 湛江 524001)

抗體是B淋巴細胞經抗原刺激而增殖分化為漿細胞后所產生的一種糖蛋白，主要介導體液免疫。單一B淋巴細胞系只產生針對一種特異性抗原決定簇的抗體，即單克隆抗體(簡稱單抗，monoclonal antibodies，mAbs)[1]。單抗具有結構均一、純度高、特異性強、效價高、交叉反應少、制備成本低等優(yōu)點。其生物學功能主要有[2]：(1)與抗原結合后募集免疫分子，如補體介導的細胞毒性作用(complement dependent cytotoxicity，CDC)、抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)等；(2)阻斷配體-受體相互作用或引發(fā)細胞內信號通路，如誘導凋亡，這種機制主要依賴于其與抗原(配體或受體)結合功能。當前，40多種單抗已被批準使用于臨床治療自身免疫性疾病、腫瘤和移植等，且有大量的單抗正在研發(fā)[3]。

1 全人源單抗的制備技術

1.1 人源化小鼠

1975年Kohler和Milstein[4]通過小鼠雜交瘤技術獲得了單抗。鼠源單抗會誘發(fā)患者機體的免疫應答，使其被快速清除，故治療效果較差。人源性單抗可減少鼠基因序列引起的免疫反應，提高治療的效能及安全性[5]。隨后開啟了人源化單抗制備的歷史。1977年，Abgenix公司(美國)使用轉基因技術制備出含人免疫球蛋白基因的轉基因小鼠(XenoMouse)[6]。2001年，Karpas等[7]從人多發(fā)性骨髓瘤細胞中篩選出一株細胞株，其能在體外保持穩(wěn)定的擴增能力，被命名為Karpas707細胞，擬用于融合人B細胞，進而制備全人源單抗，但至今相關報道甚少。全人源單抗作為一個新興技術正處于上升期，受到國內外醫(yī)藥領域研究者廣泛關注[8]。據(jù)報道，與抗體庫平臺技術相比，轉基因小鼠平臺技術在開發(fā)全人源抗體中更具優(yōu)勢，成為目前最具有優(yōu)勢的抗體藥物研發(fā)平臺。Medarex公司(隸屬于百時美施貴寶)的 HuMAb-MouseTM與Abgenix公司(隸屬于安進)的XenoMouse技術是目前最為成熟的轉基因小鼠技術。在此基礎上，Regeneron 的科學家設計了VelocImmuneTMmouse技術平臺進行抗體藥物的篩選，并且在此平臺上進一步構建了“共有輕鏈小鼠”(common light chain mouse)，利用這種小鼠產生的抗體的親和力較高[9]。但產生全人源單抗的轉基因小鼠的研發(fā)周期長，需要投入巨額的研發(fā)基金，迄今為止國內的轉基因小鼠核心技術平臺較少。目前，已有數(shù)種全人源單抗制備技術[10]。與此同時，針對治療性單抗的改造可增強其治療的安全性和有效性，如優(yōu)化單抗親和力成熟、改變單抗糖基化水平等。

1.2 噬菌體展示技術

1985年，Smith[11]第一次將外源基因插入絲狀噬菌體f1的基因III，使目的基因編碼的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌體表面，創(chuàng)建了噬菌體展示技術。隨后，Scott等[12]提出表面展示系統(tǒng)，Chiswell等[13]在此基礎上提出了噬菌體展示系統(tǒng)。此后30年間，研究者們在微流體噬菌體展示技術(microuidic-based phage display)的基礎上進行進一步研究開發(fā)，使其具有簡單、高效和低廉的優(yōu)點[14]。噬菌體展示技術用于單抗的制備，僅需獲得免疫球蛋白的基因序列，即可制備相應的抗體片段[15]；因此，可快速篩選單抗，避免了傳統(tǒng)雜交瘤方法的限制性和周期長等問題。根據(jù)使用的噬菌體類型不同，噬菌體展示系統(tǒng)被分為：絲狀(M13)噬菌體展示系統(tǒng)[16]、T7噬菌體展示系統(tǒng)[17]、lambda[18]或T4[19]噬菌體展示系統(tǒng)。目前，噬菌體抗體庫技術已經十分成熟，可篩選出高特異性、親和力強的抗體基因序列，進而制備全人源抗體。如雅培公司研發(fā)的抗腫瘤壞死因子(TNF)全人單抗Humira(修樂美)，用于治療關節(jié)炎等[10]。

1.3 酵母展示技術

1997年，Boder與Wittrup[20]首次建立酵母展示系統(tǒng)，并且用遺傳學方法改進酵母菌株。酵母展示技術提高了細胞表面蛋白結合的親和力和穩(wěn)定性，最先使用于抗體的親和力成熟[20-21]。與噬菌體相比，酵母的顆粒足夠大，以致其可以使用流式細胞技術和熒光激活細胞分選進行篩選和分離[22]。大多數(shù)酵母細胞表面展示系統(tǒng)運用經典的糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol，GPI)錨定蛋白、凝集素和絮凝劑[23]。酵母展示系統(tǒng)常被用于scFv庫、Fab庫、IgG庫及ZZ結構域等抗體庫的構建[24]。

1.4 哺乳動物細胞表面展示技術

哺乳動物細胞是表達具有天然活性蛋白的重要宿主，Akamatsu等[25]利用哺乳動物細胞進行抗體的展示及篩選，從而獲得特異性抗體。中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)細胞是用于真核基因表達的最成功的哺乳動物細胞，是目前在生物工程上廣泛使用的哺乳動物細胞[26]。與噬菌體展示技術相比，外源蛋白更易在CHO細胞中合成并且分泌到培養(yǎng)基；重組蛋白能夠正確折疊、修飾、組裝多亞基蛋白并且其理化性質、生物學性質幾乎與天然蛋白相似[27]。但外源基因在CHO表達系統(tǒng)中比在酵母展示系統(tǒng)中的表達效率低且重組蛋白的生產成本高，故通過改進CHO細胞表達技術，如調控表達技術、優(yōu)化載體和基因、改造宿主細胞等，從而提高外源基因的表達效率，這在生物技術的發(fā)展中具有很高的應用價值[28]。

1.5 單個B細胞分選技術

近年，單個細胞分選技術引起廣泛關注。Hu等[29]用CD19、IgG和HA特異性BCR標記聯(lián)合篩選抗原特異性記憶B細胞，該技術有效地增加了高親和力抗原特異性全人源單抗的獲取。Smith等[30]發(fā)現(xiàn)了一種快速制備全人源單抗的方法，即將單細胞RT-PCR與嵌套式PCR組合獲取抗體的基因信息。與噬菌體展示相比，該方法可提高抗體的有效性和產量。目前，基于該技術已制備出抗流感、抗炭疽病毒和抗肺炎球菌全人源抗體。另外，Nogales-Gadea等[31]運用一種更簡單、可直接制備全人源單抗的技術即，運用EB病毒感染人記憶B細胞同時加入Toll樣受體9(Toll-like receptor 9，TLR9)激動劑的方法，制備全人源單抗：首先，分離外周血PBMC，運用分選技術獲得B細胞，再用EB病毒感染使之永生化，在感染過程中加入TLR9激動劑激活，持續(xù)培養(yǎng)后，篩選最優(yōu)活性的B細胞，隨后運用PCR技術進行測序和克隆[32]。

近年來，研究者們運用微流體PCR和DNA測序技術可從大量細胞中分析單個細胞，Ramsk?ld等[33-34]開發(fā)出一種的Smart-Seq基因測序法，可顯著改善轉錄組的覆蓋范圍，精確分析臨床相關單細胞中的基因表達情況?；诖思夹g，Picelli等[35]開發(fā)出與Smart-seq相比更經濟、高效的Smart-seq2技術[36]。

目前，單細胞抗體納米孔(SCAN)技術是第一個能夠定量單個B細胞分泌抗體水平的技術，可直接檢測分泌的自身抗體，明確其抗原特異性和產生自身抗體的細胞，具有高通量、高敏感性和高特異性。Esfandiary等[37]運用SCAN技術檢測來自單個B細胞的同型特異性抗SSA/Ro60和抗SSB/La的自身抗體，并可定量B細胞分泌兩種抗體的水平。

2 全人源單抗的改造策略

當前，市售治療性單抗多屬于IgG類(IgG1和某些IgG2和IgG4亞型)。IgG其發(fā)揮功能主要依賴Fab段的抗體中和作用、Fc介導的補體激活作用(誘發(fā)補體依賴的細胞毒作用，CDC)、活化的FcγR(FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa)誘導ADCC以及新生兒Fc受體(FcRn)介導的半衰期改變等。人IgG以重鏈的差異(γ1、γ2、γ3、γ4)分為4個亞型：IgG1(60% ～ 70%)、IgG2(15% ～ 20%)、IgG3(5% ～ 10%)、IgG4(4% ～ 6%)。目前，研究者們通過以下幾個方面對單抗的療效進行優(yōu)化。

2.1 親和力成熟

通過優(yōu)化單抗的親和力，能相應地提高單抗的有效性，減少其不良反應。研究者將一些構建抗體庫的方法應用到抗體庫技術中以便產生更大庫容量的突變抗體庫，或模擬體內親和力成熟的顯著突變或熱點突變基因構建小容量庫，從而篩選出高親和力的特異性抗體[2, 38]。

2.2 糖基化修飾

糖基化修飾在抗體的功能調節(jié)中起著關鍵作用[39]。大部分IgG分子僅在每個Fcγ2區(qū)域Asn-297存在一個保守的N-糖基化修飾位點，約20%在IgG可變區(qū)有第二個N-糖基化位點，所有位點都位于重鏈[40]。糖基化能夠影響Fc段的結構和穩(wěn)定性，而Fc 糖基化修飾能夠調節(jié) IgG 的效應功能，包括ADCC、CDC以及半衰期。因此，IgG的Fc糖鏈對抗體與各種受體的最佳結合、抗體對病原體的有效清除，以及治療性抗體的臨床應用都是必不可少的[41]。

正常人IgG的Fc寡糖主要為核心巖藻糖基化的復雜雙天線型，多因為末端糖的半乳糖基化和唾液酸化而產生異質性。核心巖藻糖缺失可顯著增強IgG的ADCC，原因在于核心巖藻糖基化缺失的抗體與FcγRIIIA的親和力顯著增強[42]。但在一些治療應用上，減少或消除ADCC活性也是必要的。Gong等[43]發(fā)現(xiàn)抗-CD20單抗，IgG4非巖藻糖基化水平 < 30%，IgG4抗體與其受體的結合力是最弱的。這表明，非巖藻糖基化IgG4能夠降低其效應功能，增加單抗的治療效果。末端半乳糖基化也顯著影響IgG功能，半乳糖殘基的缺失與類風濕性關節(jié)炎的發(fā)病相關[44]，Liu等[45]認為在單抗中較低水平的末端半乳糖能夠降低CDC活性。末端唾液酸化在哺乳動物表達系統(tǒng)產生的單抗主要有兩種類型：N-乙酰神經氨酸(NeuAc)和N-羥乙基神經氨酸(NeuAc), 后者是人類唾液酸的形式。Scallon和Anthony等[46-47]發(fā)現(xiàn)提高IgG Fc的唾液酸含量能夠降低ADCC的活性，使其與細胞表面抗原結合活性降低。此外，人類IgG中還存在少量無巖藻糖Fc糖鏈(含或不含二等分乙酰葡糖胺)和少量高甘露糖結構。Anthony等[47]發(fā)現(xiàn)含有末端乙酰葡糖胺基化的IgG可與血清甘露糖結合蛋白結合并激活補體。Zhou等[48]用甘露糖抑制劑(kifunensine)處理CHO細胞，干預某血管瘤單抗糖鏈的合成，發(fā)現(xiàn)高甘露醇處理可提高單抗的療效。

2.3 Fc受體改造

研究者發(fā)現(xiàn)Fc受體與多種抗體依賴性疾病相關，是治療性抗體藥物在治療過程中的關鍵靶點，單抗的Fc段能夠通過介導其效應功能提升其功效[49-50]。目前，市售治療性單抗多為IgG1亞型，其Fc段效應功能較高，然而，有著功能多樣性的IgG1同型和IgG亞型通過增加穩(wěn)定性，如將兩種抗體同型的氨基酸序列進行交換(cross-isotypes)，以提高臨床安全性，減少不良事件的發(fā)生[43, 51]。

在IgG亞型中，雖然IgG4含量最少，但IgG4型抗體最具生物學獨特性[52]，其鉸鏈區(qū)獨特的結構決定其缺乏激活補體[53]和結合Fc受體的能力[54]，在不需要Fc段效應功能的治療性抗體開發(fā)方面是主要選擇，如自身免疫性疾病系統(tǒng)性紅斑狼瘡和類風濕性關節(jié)炎等[55]。故用非巖藻糖基化IgG4同型抗體替代IgG1亞型單抗，能夠增加單抗的臨床療效[43]。但Bruhns等[54]發(fā)現(xiàn)，IgG4抗-CD28抗體用于臨床試驗時，在志愿者體內發(fā)現(xiàn)IgG4復合物與FcγRIIA及FcγRIIIA結合的沉積物，可引起多器官功能障礙。這意味著，治療性抗體也存在潛在的風險，需要針對性的修飾或改造，以降低或避免這種風險。