張賀，陳薛，譚鄧旭，師長宏*

(1. 原沈陽軍區(qū)總醫(yī)院醫(yī)務部，沈陽 110015； 2. 空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心，西安 710032)

將患者的腫瘤組織移植于免疫缺陷小鼠，建立PDX(patient-derived xenograft, PDX)模型[1]較好地保持了原發(fā)瘤的異質(zhì)性[2]，在遺傳學[3]、病理學[4]和生物學特性[5]等方面具有較好的同質(zhì)性。利用PDX模型開展的腫瘤靶向藥物篩選對于臨床用藥具有較好的指導意義[6]，在腫瘤個體化治療中[7]顯示出良好的應用前景。標準化的PDX模型必須具有相應技術規(guī)范和質(zhì)量控制要求，用于化療藥物篩選必須建立規(guī)范化的療效評價體系。

1 PDX模型建立標準

來自臨床患者的新鮮腫瘤標本首次移植到免疫缺陷小鼠通常需要2 ～ 4月[8]才能成功生長，激素依賴類型腫瘤[9]用時會更長，如：前列腺癌[10]和乳腺癌[11]，而且移植成功率[12]各不相同。收獲小鼠體內(nèi)生長的移植瘤組織，并成功接種到另外的小鼠稱為移植瘤的傳代。通常PDX模型移植瘤傳至第三代能夠穩(wěn)定生長，生長曲線一致性較高，潛伏期趨于穩(wěn)定，成瘤時間不超過12周；收獲腫瘤組織，凍存于液氮內(nèi)，復蘇后重新移植于小鼠體內(nèi)，能夠穩(wěn)定生長[13]，提示模型建立成功[14]。為了保證與原發(fā)腫瘤的一致性，PDX模型傳代次數(shù)應不超過10代[15]。通常建立的P1代PDX模型不適用于藥物篩選研究，因為人源腫瘤異體生長狀態(tài)不穩(wěn)定，應選擇生長狀態(tài)穩(wěn)定的P3 ～ P8代模型進行實驗研究[16]。

2 PDX模型溯源性評價

移植瘤在小鼠體內(nèi)生長，鼠源性成分會逐步替代人源性成分[17]。為了保證多次傳代的PDX模型遺傳學和組織學特征與原發(fā)瘤的相似性，需要對模型進行溯源性評價。目前已報道的溯源性評價方法包括：組織形態(tài)學比較、測序分析、腫瘤特異性標志物檢測和STR分型，應結(jié)合不同實驗研究的目的選擇相應的PDX模型溯源方法。

2.1 組織形態(tài)學比較

通過組織學類型[18]和Lauren分類[19]等方法對移植瘤和原發(fā)瘤組織形態(tài)差異進行分析，判斷一致性。通常取患者腫瘤組織和PDX模型腫瘤組織固定、切片、染色后，選擇兩名以上病理學家判斷瘤組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)。在比較分析時不僅關注腫瘤的結(jié)構(gòu)特征，同時也要對特異性的間質(zhì)結(jié)構(gòu)進行分析。Pergolini等[20]對133例胰導管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)患者建立PDX模型，并連續(xù)傳至P10代。通過對比發(fā)現(xiàn)，胰導管腺癌獨特的腺腔樣結(jié)構(gòu)可以判斷腫瘤的不同分化程度，而且經(jīng)過連續(xù)傳代的移植瘤能夠保存不同分化程度的原發(fā)瘤特征；PDAC腫瘤基質(zhì)是由腫瘤相關的成纖維細胞和豐富的膠原蛋白組成，移植瘤包含α-平滑肌成纖維細胞，與對應患者的原發(fā)瘤相似；此外，天狼星紅染色顯示異種移植瘤的膠原主要由有序或無序的纖維組成，這些膠原亞型特征在相應的原發(fā)瘤上也有發(fā)現(xiàn)。這些結(jié)果證明PDAC的PDX模型保留了原發(fā)瘤組織學及其微環(huán)境特征。

2.2 測序分析

通過多個基因外顯子和RNA測序，可以確定原發(fā)瘤的遺傳特征是否在PDX模型異體生長和傳代期間發(fā)生變化；也可通過測序分析PDX模型的堿基突變特征、等位基因頻率和RNA表達水平方面是否與對應原發(fā)瘤具有相關性[21]，這些都稱為遺傳特征的一致性研究。Choi等[22]研究了726例胃癌(gastric carcinoma，GC)及TCGA(the Cancer Genome Atlas)數(shù)據(jù)庫相關的癌癥基因，發(fā)現(xiàn)所有癌癥相關基因在模型的建立和移植過程中都是穩(wěn)定的，mRNA測序分析顯示P0代模型和P3代模型之間的表達水平?jīng)]有顯著差異。比較P0和P3腫瘤之間的等位基因頻率時，發(fā)現(xiàn)這兩代腫瘤之間的等位基因頻率相關性良好。此外，726個癌癥相關基因的mRNA表達水平在P0代和P3代腫瘤之間相關性較好(R=0.99)，提示不僅基因的突變特征，而且相應基因的RNA表達水平在傳代中都是穩(wěn)定的。該研究證實胃癌PDX模型與原發(fā)瘤以及同代模型腫瘤之間的基因組差異不顯著，特別是對于已知的癌癥相關基因。

此外，利用基因表達圖譜進行數(shù)據(jù)分析，表明PDX 模型保留了絕大多數(shù)原發(fā)瘤的癌癥關鍵基因[23]、信號通路活性[24]及基因組特征[25]。但是，也有研究報道 PDX 模型發(fā)生了特有的核苷酸突變，導致一些基因消失或新發(fā)現(xiàn)，但發(fā)生幾率較低[26]。研究推測發(fā)生突變的原因是腫瘤適應異體生長環(huán)境而產(chǎn)生選擇性壓力導致的，或許由于原發(fā)瘤中存在低于可檢測范圍的亞克隆過度生長所致。Powell等[26]在乳腺癌PDX模型的研究中發(fā)現(xiàn)，p53、BTG2基因的聯(lián)合缺失會增加乳腺癌PDX模型移植瘤的生長速率，腫瘤的浸潤能力增強，同時，增大了移植瘤自發(fā)性轉(zhuǎn)移的潛能。類似的自發(fā)性轉(zhuǎn)移在其他的類型腫瘤PDX模型中也有報道[25]。

2.3 腫瘤特異性標志物的分析

人源性的特異性標志物檢測能夠確定移植瘤的來源[27]，進而比較移植瘤與原發(fā)瘤的一致性。Jason等[28]研究胰腺腺泡細胞癌(pancreatic acinar cell carcinoma，PACC)PDX模型，結(jié)果表明模型的組織學特征與患者胰腺癌組織學特征相似。通過免疫組織化學法檢測到人特異性線粒體表面蛋白和人核纖層蛋白A/C(lamin A/C)的表達，確認小鼠體內(nèi)的腫瘤組織是人類起源。特異性標志物的表達與某一類型腫瘤的發(fā)生密切相關，也是指導臨床診斷和治療策略的潛在分子靶點，比如肝癌中甲胎蛋白[29](alpha fetal protein，AFP)，胰腺癌中糖類抗原CA19-9[30]，以及前列腺癌的特異性抗原[31](prostate specific antigen，PSA)，都是特異性腫瘤主要的致癌驅(qū)動因素，由基因組或蛋白質(zhì)表達畸變(或兩者同時)驅(qū)動。因此，人體腫瘤和PDX模型之間以及PDX模型不同代際之間特異性標志物的一致性在評價靶向治療藥物的效用方面至關重要。Wang等[32]對胃癌PDX模型進行了遺傳標志物的檢測和分析。包括EGFR、HER2、HER3、PTEN、FGFR2和MET等6種基因，它們是GC臨床診斷和靶向治療的已知靶標。通過與對應患者腫瘤的比較，證明PDX模型較好的保持了人源GC的組織學和遺傳學特征；進一步檢測表明HER2是GC重要的分子靶標，檢測HER2表達量，可以比較GC原發(fā)腫瘤和PDX模型移植瘤之間的一致性。

2.4 STR分型檢測

在不同腫瘤類型的PDX模型中鼠源成分的替代速率是不同的[33]。一般認為經(jīng)過8 ～ 10次傳代以后，腫瘤組織的人源性不能保證[34]。短片段重復序列(short tandem repeat，STR)基因座檢測被稱作第二代DNA指紋技術，廣泛用于親子鑒定、個體識別、遺傳制圖、連鎖分析、疾病基因定位和物種多態(tài)性研究等領域[35]。STR序列廣泛存在于哺乳動物的基因組中，多態(tài)性程度高，通常由2 ～ 6個堿基構(gòu)成一個核心序列，核心序列串聯(lián)重復排列，重復數(shù)目的變化決定多態(tài)性。對于特定個體，染色體上某一位置的重復序列和重復次數(shù)是固定的，而對于不同的個體在相同位置的重復次數(shù)不同。由于人類基因組中這種重復序列非常多，通過檢測多態(tài)性，就可以明確區(qū)分個體的不同，確定親緣關系。通過聯(lián)合應用16個STR位點，個體識別率可達0.999 999 999 9。在PDX模型溯源中，分別提取原發(fā)瘤和移植瘤的DNA，通過STR分型比較二者遺傳位點的相似性和穩(wěn)定性。該方法操作簡單，準確度高，可迅速確定移植瘤組織的來源。

3 藥物的毒性與療效評價

3.1 藥物的毒性評價

PDX模型的給藥方案對于化療藥物的篩選及評價至關重要。人和小鼠的給藥劑量存在較大差別，必須按照人與鼠換算的劑量進行毒性評估，確定給藥劑量、方式和頻次。觀察小鼠的狀態(tài)，以及與治療相關[28](treatment related，TR)的副作用。如果臨床體征和尸體解剖能夠證明或最后一次給藥14 d以內(nèi)的動物死亡被稱為TR，該個體死亡前的數(shù)據(jù)將被統(tǒng)計；如果沒有證據(jù)顯示死亡與治療副作用有關，動物死亡被歸類為非治療相關[28](non-treatment related，NTR)，該個體數(shù)據(jù)將不被統(tǒng)計。最大耐受劑量[38](maximum tolerated dose，MTD)可接受毒性定義為試驗期間組平均體重損失小于20%，TR死亡率不超過10%。定期稱量小鼠體重[39](body weight，BW)，如果出現(xiàn)BW損失超過限度，說明劑量過大或頻率過高，該治療組暫停試驗，待恢復平均BW，使用較低劑量或較低頻次的給藥方案。

3.2 腫瘤體積變化趨勢

腫瘤體積的變化趨勢可以直觀反映藥物的治療效果，通過對比治療組與對照組腫瘤體積的差異來評價。根據(jù)實驗動物福利及倫理要求[38]，當腫瘤體積過大，影響動物正常的生理活動時，應停止試驗。同時，腫瘤體積和重量呈正相關，隨著腫瘤體積的增加，其重量占小鼠體重的比例越高，通過體重評價藥物毒性作用的可行性就越低。在實驗中應設定腫瘤體積增長的上限值，Cuppens等[39]選擇1500 mm3，Winters等[40]選擇1000 mm3，作為實驗研究的終點。受藥物作用影響，腫瘤增長過慢或呈減小趨勢，理論上達到體積上限時間過長或無法達到，在體積變化趨勢能夠說明藥物療效時即可終止試驗。

3.3 TGD數(shù)學模型

在測量腫瘤體積時由于測量人員自身的差異易導致數(shù)據(jù)出現(xiàn)偏差，形成人為的系統(tǒng)誤差。采用TGD(tumor growth delay)數(shù)學模型[28]評價治療效果能夠最大限度的減小系統(tǒng)誤差，比較準確地評價腫瘤生長情況。模型公式為：

TGD=T-C

TTE(time to endpoint)值表示達到治療終點的時間，以d為單位；endpoint volume表示各時間節(jié)點的腫瘤體積及設定的腫瘤終點體積，以mm3為單位。T表示某治療組TTE值的中位數(shù)，C表示對照組TTE值的中位數(shù)，均以d為單位，TGD值與對照組差異呈正相關。治療效果被定義為腫瘤生長相對延遲，其含義為治療組與對照組相比TTE中值的增加，或是相對比率百分數(shù)。TGD值(或是%TGD)越大，表明與對照組相比差異越大，治療效果越好。而且通過m值可以準確判斷腫瘤的生長趨勢，值越大表明腫瘤生長速度越快，若m值為負數(shù)，表明腫瘤體積呈減小趨勢。采用TGD數(shù)學模型法評價藥物的治療效果，與單一觀察腫瘤體積變化趨勢的方法相比擁有很多的優(yōu)點。①通過曲線能夠準確模擬出每一個試驗對象全治療周期移植瘤的生長情況，治療效果可以通過具體的量化數(shù)值進行評價，提高了評價體系的準確性；②對每一個時間節(jié)點腫瘤體積取對數(shù)，并繪制回歸曲線，能夠最大限度的減少人為因素的系統(tǒng)誤差，提高了評價體系的可信性；③單純的體積變化往往因趨勢的波動而無法準確判斷腫瘤的生長情況，引入回歸曲線斜率m值能夠準確判斷腫瘤增長或減小趨勢，提高了評價體系的預判性。

4 小結(jié)與展望

PDX模型在腫瘤研究中發(fā)揮了積極的作用，使用PDX模型進行藥物篩選的研究幾乎都顯示出了改善臨床效果的預期性[41]。但由于自身缺陷，免疫缺陷鼠不能真實模擬免疫系統(tǒng)在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，一定程度上限制了模型的應用。特別是以提高機體免疫力為目的的抗癌藥物，選擇PDX模型進行藥物篩選局限性顯而易見。有研究通過移植人體免疫組織成功創(chuàng)建了“人源化”小鼠模型[42,43]，彌補了上述缺陷，拓展了腫瘤免疫治療方面的進展。另外，患者腫瘤異體生長時，鼠源間質(zhì)為移植瘤提供生長所需的各類營養(yǎng)物質(zhì)，此時腫瘤新生成的血管不同于人體的血管。對于有物種區(qū)別的抗血管生成類抗癌藥物[37]，利用PDX模型進行藥物篩選往往難以達到理想效果。

在腫瘤研究領域PDX模型的應用將會越來越廣。如：PDX模型可以用于鑒定腫瘤生物標記物，發(fā)現(xiàn)新的藥物作用靶點，進而開發(fā)全新的抗腫瘤藥物；利用PDX模型分析患者特定的治療反應和預后的不同，并將患者分為不同亞群，開發(fā)新的腫瘤臨床診斷方法，建立新的個體化治療方案；利用PDX模型探尋患者腫瘤異質(zhì)性的分子機制，根據(jù)個體化機制差異，精準預測臨床藥物療效，推進腫瘤的精準化治療；建立全球化的腫瘤異種移植模型數(shù)據(jù)庫[44]，共享PDX模型研究成果與信息，提高腫瘤的臨床治愈率。未來，隨著對PDX模型研究及應用的不斷發(fā)展和推進，精準和優(yōu)化的癌癥個體治療方案將使更多患者受益。