楊文靜，崔淑芳

(海軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物學(xué)教研室，上海 200433)

裸鼴鼠分布于非洲東部地區(qū)[1]，營真社會性生活[2]。在動物分類學(xué)上屬于哺乳綱、嚙齒目、濱鼠科、裸鼴鼠屬、裸鼴鼠種[3]。體格大小與小鼠相近[4]，但是全身只有數(shù)十根毛發(fā)[5]。裸鼴鼠基因組有93%的區(qū)域與人類、小鼠、大鼠保持較好的共線性關(guān)系[6]。

裸鼴鼠具有多種獨(dú)特的生物學(xué)特性。例如，裸鼴鼠壽命可達(dá)30年[2]，是同等體型大小鼠的5 ～ 10倍[7]，在整個(gè)生命周期中不會出現(xiàn)衰老跡象，其肌肉結(jié)構(gòu)、血管彈性始終良好[8]，具有抗衰老特性；其對癌癥具有天生的抗性[9]，不論是從野生環(huán)境捕獲還是動物園飼養(yǎng)的裸鼴鼠，腫瘤發(fā)生率極低，目前僅有數(shù)只20歲以上的裸鼴鼠被發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生腫瘤；裸鼴鼠長期生活在氧含量僅有10% ～ 15%的環(huán)境中，終生具有生理性的耐低氧能力[10]。此外，裸鼴鼠還具有較強(qiáng)的疼痛耐受能力[11]。裸鼴鼠這些生物學(xué)特性已經(jīng)引起國內(nèi)外學(xué)者的高度關(guān)注。

但是由于沒有實(shí)驗(yàn)動物化，裸鼴鼠供給資源的缺失成為深入揭示裸鼴鼠生物學(xué)特性與應(yīng)用推廣的瓶頸。正是基于這一原因，本團(tuán)隊(duì)開始致力于裸鼴鼠標(biāo)準(zhǔn)化的研究及其資源平臺的建設(shè)，取得了良好效果?，F(xiàn)就近年來圍繞裸鼴鼠實(shí)驗(yàn)動物化及生物學(xué)特性機(jī)制研究開展的一系列工作做一系統(tǒng)闡述。

1 普通級封閉群裸鼴鼠種群建立

野生裸鼴鼠是像蜜蜂、螞蟻等昆蟲一樣營真社會性生活，每個(gè)群落幾十只到近百只，大群落方式生活[12]。目前國際上進(jìn)行裸鼴鼠飼養(yǎng)工作的機(jī)構(gòu)，如德克薩斯大學(xué)健康科學(xué)中心、日本 RIKEN 腦研究所等，均模擬野外生存狀態(tài)進(jìn)行群落模式飼養(yǎng)。但國外采用的真社會性繁殖方式不利于裸鼴鼠的生活環(huán)境、營養(yǎng)、微生物和遺傳質(zhì)量控制，制約著裸鼴鼠封閉群與近交系的建立。為了更好的實(shí)現(xiàn)規(guī)范化的實(shí)驗(yàn)動物裸鼴鼠種群和便于比較應(yīng)用，就必須有符合國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)動物法律法規(guī)要求的裸鼴鼠資源。因此，我們先后從國外引進(jìn)裸鼴鼠，從培育封閉群開始，開啟了裸鼴鼠標(biāo)準(zhǔn)化種群研究。

在封閉群裸鼴鼠的建立過程，裸鼴鼠的不育情況非常明顯：雄性不育個(gè)體的性激素水平、生殖器官臟器系數(shù)以及精子數(shù)量顯著低于可育個(gè)體[13]，這也是我們區(qū)分裸鼴鼠生育能力及建立選種育種標(biāo)準(zhǔn)，控制妊娠率的重要依據(jù)[14]。此外，我們通過建立裸鼴鼠體味混合技術(shù)、擇優(yōu)選擇合籠時(shí)機(jī)以及最佳的配種制度，克服了裸鼴鼠合籠率低下的障礙，最終成功建立了裸鼴鼠非近親的交配繁殖技術(shù)[15]。通過對裸鼴鼠生活習(xí)性等生物學(xué)特性、生長發(fā)育和飼養(yǎng)繁育規(guī)律開展研究，已經(jīng)掌握了裸鼴鼠一些主要的基礎(chǔ)生物學(xué)數(shù)據(jù)[16]。通過連續(xù)對不同代次的裸鼴鼠研究發(fā)現(xiàn)，母鼠性成熟的年齡為228 d左右，雄鼠約365 d左右，母鼠的發(fā)情周期為30 d，發(fā)情期可持續(xù)2 ～ 3 d，發(fā)情期母鼠通常晚上在睡眠、采食區(qū)交配。在制定裸鼴鼠種鼠選種和淘汰標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，按照實(shí)驗(yàn)動物封閉群培育方法，采用非近親的循環(huán)交配法，雌雄1∶1進(jìn)行交配。生產(chǎn)率80%以上，胎間隔平均110 d，每窩平均產(chǎn)仔數(shù)10只，每窩平均離乳數(shù)9只，離乳成活率平均85%以上，現(xiàn)已繁殖到第6世代。

參照國家嚙齒類實(shí)驗(yàn)動物遺傳標(biāo)準(zhǔn)，運(yùn)用微衛(wèi)星技術(shù)對每代裸鼴鼠進(jìn)行遺傳監(jiān)測[17]。針對所確立的25個(gè)高度多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行PCR檢測發(fā)現(xiàn)，種群平均雜合度為0.6435，具有較高多態(tài)性，所有位點(diǎn)HWE的χ2P值大于0.05，基因頻率趨于平衡狀態(tài)，符合實(shí)驗(yàn)動物封閉群標(biāo)準(zhǔn)。與此同時(shí)，采用國家標(biāo)準(zhǔn)《實(shí)驗(yàn)動物 微生物學(xué)等級及監(jiān)測》(GB 14922.2-2011)和《實(shí)驗(yàn)動物 寄生蟲等級及監(jiān)測》(GB 14922.1-2001)、高通量測序及自己建立的Q-PCR、間接ELISA等方法全面篩查裸鼴鼠微生物與寄生蟲攜帶情況，發(fā)現(xiàn)所培育裸鼴鼠不攜帶普通級嚙齒類實(shí)驗(yàn)動物所必須排除的微生物與寄生蟲，符合普通級實(shí)驗(yàn)動物標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)專家鑒定，成功建立了普通級封閉群裸鼴鼠種群。

通過全面篩查裸鼴鼠微生物與寄生蟲攜帶情況，對比不同環(huán)境設(shè)施條件下裸鼴鼠生長發(fā)育和繁殖生產(chǎn)的變化，比較三種不同的飼料配方對裸鼴鼠的血液學(xué)指標(biāo)、生長發(fā)育及繁殖性能的影響，篩選具有高特異性和高度多態(tài)性的微衛(wèi)星位點(diǎn)對裸鼴鼠種群進(jìn)行遺傳質(zhì)量監(jiān)測，建立了病毒Q-PCR檢測、寄生蟲間接ELISA檢測、微衛(wèi)星遺傳質(zhì)量檢測等技術(shù)方法，制定了裸鼴鼠遺傳質(zhì)量檢測、微生物學(xué)與寄生蟲學(xué)檢測等技術(shù)規(guī)范，編制了實(shí)驗(yàn)裸鼴鼠的微生物、寄生蟲等級監(jiān)測、封閉群裸鼴鼠遺傳質(zhì)量、環(huán)境設(shè)施、飼料營養(yǎng)質(zhì)量控制等五項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)的研究稿，這一工作的完成將使裸鼴鼠質(zhì)量控制及推廣應(yīng)用有規(guī)可循。

2 裸鼴鼠生物學(xué)特性及機(jī)制研究

2.1 基礎(chǔ)生物學(xué)特性

參照《裸鼴鼠生物學(xué)特性數(shù)據(jù)采集規(guī)程》，系統(tǒng)采集了包括三個(gè)世代8個(gè)系統(tǒng)的23項(xiàng)解剖學(xué)數(shù)據(jù)，12項(xiàng)生長繁殖指標(biāo)，9項(xiàng)血液生理學(xué)指標(biāo)，13項(xiàng)血液生化指標(biāo)等數(shù)據(jù)，并系統(tǒng)闡述了裸鼴鼠全身各大臟器的解剖學(xué)及組織學(xué)結(jié)構(gòu)特征，為裸鼴鼠質(zhì)量控制及推廣使用提供了重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。研究中發(fā)現(xiàn)，裸鼴鼠血紅蛋白含量和紅細(xì)胞含量都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于同期小鼠，這也從一方面提示了裸鼴鼠低氧耐受的生理學(xué)基礎(chǔ)[18]。

2.2 裸鼴鼠耐低氧特性及機(jī)制研究

裸鼴鼠長期生活在地下2 m左右的環(huán)境中，由于穴居密度高，與外界氣體交換不順暢，洞穴中空氣的二氧化碳含量很高，而氧含量極低 (10% ～ 15%)。這樣的空氣環(huán)境對于其他任何一種哺乳動物來說都可能是致命的，會導(dǎo)致大腦損傷以及其他各器官系統(tǒng)的病理性改變，甚至危及生命[19]。而裸鼴鼠卻未見任何缺氧性疾病發(fā)生，說明裸鼴鼠具有極強(qiáng)的耐低氧能力。研究發(fā)現(xiàn)，裸鼴鼠心臟每搏輸出量較大[20]，泵血能力較強(qiáng)；肺臟導(dǎo)氣部非常發(fā)達(dá)，各級氣管擴(kuò)張程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于C57BL/6 J小鼠；骨骼肌中肌紅蛋白含量約為小鼠的1.5倍，骨骼肌中微血管密度顯著高于C57BL/6 J小鼠[21]，從而提高了骨骼肌在低氧條件下的功能，這些特點(diǎn)使裸鼴鼠更適合低氧環(huán)境。

大鼠海馬組織糖氧剝奪12 ～ 24 h后，神經(jīng)元凋亡比例超過裸鼴鼠數(shù)倍，而裸鼴鼠海馬組織中神經(jīng)元凋亡率能夠始終保持不變，表明裸鼴鼠海馬組織具有較強(qiáng)的低氧耐受能力[19]。

裸鼴鼠海馬組織NMDA受體的水平高出小鼠7倍以上，我們知道NMDA受體參與神經(jīng)系統(tǒng)的多種重要生理功能，高表達(dá)的NMDA受體可能是保證裸鼴鼠低氧耐受的機(jī)制之一[22]。進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)，離體裸鼴鼠海馬組織經(jīng)3%的低氧刺激后，細(xì)胞內(nèi)Ca2+波動幅度只有小鼠的三分之一，這有助于避免氧濃度波動造成鈣超載，誘發(fā)細(xì)胞凋亡的風(fēng)險(xiǎn)。這些研究表明裸鼴鼠活體組織具有較強(qiáng)的低氧耐受能力[23]。

我們在細(xì)胞水平研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的裸鼴鼠肝星形細(xì)胞具有較高的增殖活性及較低的凋亡比例[24]。并且高濃度的氯化鈷(缺氧損傷誘導(dǎo)劑)處理后，其細(xì)胞凋亡率與對照組相比差異也不顯著。由此可見，裸鼴鼠成體、組織及細(xì)胞水平均保持良好的耐低氧特性，對裸鼴鼠獨(dú)特的耐低氧機(jī)制進(jìn)行研究，可能為制定低氧環(huán)境醫(yī)學(xué)保護(hù)措施提供一些新思路。

2011年，Nature文獻(xiàn)報(bào)道了華大基因通過基因測序獲得的一系列可能與裸鼴鼠低氧耐受相關(guān)的基因[6]。我們進(jìn)一步運(yùn)用低氧艙裝置控制氧氣濃度，對低氧處理的裸鼴鼠骨骼肌樣本運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組測序，進(jìn)行差異基因的高通量篩選，獲得表達(dá)上調(diào)基因1450個(gè)，下調(diào)基因971個(gè)，其中可能存在相互作用的基因24個(gè)[25]。我們利用流式細(xì)胞術(shù)及CCK8檢測法對低氧情況下表達(dá)上調(diào)較為顯著的三個(gè)基因STMN1、JIP1、JNK3進(jìn)行了機(jī)制研究，發(fā)現(xiàn)STMN1、JIP1、JNK3分別被沉默掉之后，裸鼴鼠肌肉成纖維細(xì)胞低氧情況下的增殖速率顯著降低，凋亡比例顯著升高[26]。進(jìn)一步采用免疫共產(chǎn)沉淀等檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子HIF1通過調(diào)節(jié)MAPK8IP1在低氧情況下裸鼴鼠肌肉成纖維細(xì)胞的增殖凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用[26]。

2.3 抗腫瘤特性及機(jī)制研究

小鼠因其壽命短暫，繁殖力強(qiáng)，易患腫瘤而常常在腫瘤發(fā)病學(xué)研究中被作為模式生物。但是利用小鼠開展的腫瘤學(xué)研究為抗腫瘤研究提供有的數(shù)據(jù)有一定的局限性。而裸鼴鼠作為一種壽命長達(dá)三十年以上的哺乳動物本身就具有較強(qiáng)的抗腫瘤特性[27]，以裸鼴鼠為模型研究其抗腫瘤機(jī)制，將為腫瘤的防治提供重要的借鑒。

美國羅徹斯特大學(xué)Andrei Seluanov團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，裸鼴鼠皮膚成纖維細(xì)胞具有明顯的“早期接觸抑制”現(xiàn)象[28]，這是否是裸鼴鼠防止細(xì)胞過度增殖，進(jìn)而防止腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制呢？進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)裸鼴鼠成纖維細(xì)胞分泌高分子質(zhì)量的透明質(zhì)酸(HMM-HA)，比人類及小鼠HA質(zhì)量高5倍。一旦清除HMM-HA裸鼴鼠細(xì)胞變得容易癌變[9]。裸鼴鼠這種獨(dú)特的透明質(zhì)酸又是否可以應(yīng)用到腫瘤防治？這些都是我們未來值得研究的問題。

免疫系統(tǒng)與機(jī)體的衰老、腫瘤等疾病的發(fā)生與發(fā)展有著密不可分的聯(lián)系[29]，從免疫學(xué)的角度或許可以解釋裸鼴鼠抗腫瘤的原因。我們著重研究了裸鼴鼠的固有免疫反應(yīng)。我們在對裸鼴鼠的免疫器官進(jìn)行組織學(xué)和電鏡觀察發(fā)現(xiàn)其脾臟中巨噬細(xì)胞數(shù)量較小鼠多，該結(jié)果經(jīng)流式檢測得到了驗(yàn)證。通過對比裸鼴鼠和小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬功能，發(fā)現(xiàn)裸鼴鼠巨噬細(xì)胞的吞噬率高于小鼠[30]。分別采用polyI:C或者LPS刺激裸鼴鼠巨噬細(xì)胞，IFN-β或TNF-α的表達(dá)量較小鼠顯著上調(diào)[30]。然而裸鼴鼠樹突狀細(xì)胞與NK細(xì)胞對外源刺激物(LPS、polyI:C和D-GalN)反應(yīng)不敏感，主要表現(xiàn)在刺激之后IFN-β、TNF-α等細(xì)胞因子變化不顯著。這就提示在固有免疫反應(yīng)的研究中，裸鼴鼠以巨噬細(xì)胞的免疫應(yīng)答為主。當(dāng)然，免疫系統(tǒng)不僅僅是固有免疫，因此對裸鼴鼠獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的研究還有待深入，其中某些關(guān)鍵分子的發(fā)現(xiàn)可能用于人類自身，這將有助于提高人類的免疫能力，為預(yù)防和治療腫瘤、老年疾病等提供新的靶點(diǎn)與策略[31]。

我們選取了黃曲霉素和烏拉坦等化學(xué)致癌劑來研究裸鼴鼠抗癌能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠在化學(xué)誘變3個(gè)月后開始發(fā)生肺腫瘤，白細(xì)胞數(shù)目顯著下降，誘變5個(gè)月后腫瘤發(fā)生率高于50%；而裸鼴鼠誘變5個(gè)月后仍然保持健康的生理狀態(tài)，血液指標(biāo)無顯著變化。在細(xì)胞水平證實(shí)在化學(xué)致癌因素存在的條件下，裸鼴鼠細(xì)胞能夠保持較低水平的慢性炎癥因子的分泌，這就大大降低了細(xì)胞由慢性炎癥導(dǎo)致癌變的可能性。我們采用Co60 γ射線輻照活體動物，發(fā)現(xiàn)在6 Gy劑量的輻照條件下，裸鼴鼠30天存活率能夠達(dá)到100%，而小鼠只有30%。輻照之后小鼠的T淋巴細(xì)胞CD4+/CD8+降低顯著，呈現(xiàn)顯著的免疫抑制情況，而裸鼴鼠輻照后CD4+/CD8+比例升高，輔助性T淋巴細(xì)胞和殺傷性淋巴細(xì)胞呈現(xiàn)高度激活狀態(tài)。證明裸鼴鼠具有較高的抗輻射致癌因素攻擊能力(待發(fā)表)。

此外，自噬與衰老、癌癥、耐低氧均有著密切的關(guān)系。因此我們推測自噬可能是裸鼴鼠維持抗衰老、抗腫瘤、耐低氧等生物學(xué)特性的重要機(jī)制[32]。我們采用Western Blot、電鏡、免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，幼年及成年裸鼴鼠(8月齡)肝臟、肺臟、腎臟等器官中[32]自噬相關(guān)基因(LC3 II)表達(dá)及自噬體數(shù)量顯著高于同期 C57/BL6J 小鼠。此外，在饑餓、過氧化氫刺激不利條件下，裸鼴鼠細(xì)胞LC3 II表達(dá)量顯著升高，同樣饑餓處理裸鼴鼠自噬升高幅度是小鼠的1.5倍，并且裸鼴鼠幼年到老年不同階段，自噬水平保持穩(wěn)定，證明裸鼴鼠自噬調(diào)節(jié)能力及穩(wěn)定性顯著高于小鼠[33]。采用自噬抑制劑干預(yù)自噬水平，細(xì)胞凋亡率升高，這些數(shù)據(jù)說明裸鼴鼠自噬條件有利于裸鼴鼠細(xì)胞生存[32]。目前，干預(yù)自噬調(diào)節(jié)抑制腫瘤發(fā)生是國際上較活躍的研究課題之一，裸鼴鼠較高的自噬調(diào)節(jié)能力及穩(wěn)定性是研究自噬抵抗腫瘤發(fā)生的理想模型。借助這種模型我們可能揭示新的自噬調(diào)控手段，甚至有望篩選到用于腫瘤的防治自噬特異性的藥物[33]。

3 結(jié)語

我們近年來圍繞裸鼴鼠資源開發(fā)與相關(guān)生物學(xué)特性機(jī)制研究方面做了一些工作。盡管取得一定成效，但距離成規(guī)模地保存各級各類標(biāo)準(zhǔn)化裸鼴鼠種群，系統(tǒng)揭示裸鼴鼠抗腫瘤、耐低氧的機(jī)制的目標(biāo)，還有很漫長很艱難的路程。憑一己之力，我們可能永遠(yuǎn)也走不到終點(diǎn)。因此，我們由衷期盼更多的科研機(jī)構(gòu)關(guān)注與加盟我們平臺，優(yōu)勢互補(bǔ)，聯(lián)手攻關(guān)。尤其是在機(jī)制與應(yīng)用研究方面，需要各學(xué)科、各專業(yè)研究團(tuán)體的參與。我們堅(jiān)信，隨著標(biāo)準(zhǔn)化裸鼴鼠資源平臺條件建設(shè)的不斷完善，裸鼴鼠機(jī)制與應(yīng)用研究的機(jī)構(gòu)不斷增加，裸鼴鼠將在我國生命科學(xué)與生物醫(yī)藥研究各領(lǐng)域中發(fā)揮出越來越突出的支撐作用。