杜小燕，李長龍，王冬平，陳振文*

(1. 首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，北京 100069； 2. 軍事醫(yī)學研究院實驗動物中心，北京 100071)

糖尿病是一個全球性健康問題，同樣也威脅著中國人的健康，中國患糖尿病人數(shù)居全球首位，且患病率達成年人口的11.6%[1-2]。Ⅱ型糖尿病是最常見的糖尿病類型之一，占糖尿病總?cè)藬?shù)的90%以上[3]，其發(fā)病特征為胰島素抵抗[4]。研究糖尿病機制和治療靶點離不開動物模型。現(xiàn)有的糖尿病動物模型主要包括自發(fā)型、實驗誘導型以及基因修飾型小鼠、大鼠以及小型豬等多種類型[5-6]。自發(fā)性糖尿病動物模型由于其自身的環(huán)境和遺傳因素共同作用使之成為最理想且最具應用價值的一類模型，但是這類模型由于種類少，受所有權或價格等一系列因素的限制而不易獲得。

長爪沙鼠是源自我國的實驗動物，后傳到日本和歐美等國家，因其腦底動脈Willis環(huán)、前列腺、眼、耳等具有獨特的解剖結(jié)構及其對微生物易感性、多種腫瘤易發(fā)等生理和行為學特征，已廣泛地應用于腦神經(jīng)、寄生蟲病、微生物、生殖、內(nèi)分泌、營養(yǎng)、代謝及藥理、腫瘤等諸多領域研究，被稱為“多功能”實驗動物[7]。長爪沙鼠作為一個潛在的糖尿病動物模型，早在1972年Boquist報道[8]發(fā)現(xiàn)長爪沙鼠群體中具有高血糖和肥胖特征動物個體，但是符合高血糖特性的動物比例較低(7.14%)。我們課題組在進行長爪沙鼠近交系培育過程中，在近交培育至F7代時偶然發(fā)現(xiàn)其中一個分支具有高血糖的特性，發(fā)生比例(21.33%)顯著高于Boquist的報道，經(jīng)過3代定向篩選后其發(fā)病率隨培育代數(shù)逐步提高，證明該動物糖尿病的發(fā)生具有遺傳性。在此基礎上，我們團隊通過長達8年的定向培育，成功培育到F20代，形成了一個自發(fā)性糖尿病長爪沙鼠模型品系，于2017年12月通過了專家鑒定為新的實驗動物品系。本文將近年來圍繞糖尿病長爪沙鼠群體的生物學特性和發(fā)病機制的一系列研究結(jié)果進行概述。

1 定向培育長爪沙鼠糖尿病模型近交系

采用快速血糖儀檢測成年長爪沙鼠空腹血糖(FPG)和口服葡萄糖耐量(PG2h)，將Boquist 報道的標準(FPG > 4.8 mmol/L和PG2h > 6.6 mmol/L)略有提高，以FPG > 5.2 mmol/L和PG2h > 6.8 mmol/L兩個指標篩選同窩動物進行近親繁殖，共檢測了2200多只動物，隨著這種定向篩選，F(xiàn)PG > 5.2 mmol/L動物從最初F7的41.33%上升到F20的 100%；PG2h > 6.8 mmol/L動物從F7的38.67%上升到F20的60%，兩者都符合糖尿病標準的動物從F7的21.33%上升到F20的60%，實現(xiàn)了定向培育自發(fā)糖尿病模型近交系的目標。通過對其繁殖性能的分析發(fā)現(xiàn)，其出生重(4.05±1.64)g，離乳重(32.49±5.99)g，略高于腦缺血近交系長爪沙鼠，但是胎間隔和胎仔數(shù)略低[9]，目前保有種子動物80余對。

2 長爪沙鼠糖尿病模型近交系生物學特性

2.1 不同年齡糖尿病長爪沙鼠空腹血糖(FPG)和膽固醇水平

為研究該近交系動物生理生化指標特點及其與年齡的相關性，我們檢測了12月齡、15月齡、18月齡、21月齡和24月齡及以上月齡的沙鼠血清中FPG和膽固醇水平，發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增長，1歲以上空腹血糖水平逐步升高(4.94，6.15，6.90，5.21，6.27 mmol/L)，但膽固醇在不同年齡段無明顯改變(3.77，3.71，4.84，4.00，3.67 mmol/L)。說明年齡對血糖的影響更大。

2.2 長爪沙鼠糖尿病近交系血液生化指標、脂肪因子和采食量水平

采用自動生化分析儀檢測了血糖、三酰甘油、高密度脂蛋白和膽固醇，用ELISA檢測了insulin、adiponectin和leptin，計算胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment for insulin resistance, HOMA-IR)。結(jié)果顯示，高血糖動物3月齡時與正常血糖動物相比葡萄糖耐量顯著受損，insulin(13.61±8.03 vs 232.58±95.09) μU/mL、HOMA-IR(4.37±2.98 vs 70.17±31.32)、leptin(288.29±146.25 vs 22080.41±7346.33) pg/mL、空腹血糖(4.54±0.94 vs 9.02±2.40) mmol/L、三酰甘油(0.52±0.33 vs 4.47±4.06) mmol/L和膽固醇(2.52±0.33 vs 5.87±2.44) mmol/L在糖尿病動物中顯著升高，而血清adiponectin(23.75±4.64 vs 10.65±3.93) μg/mL水平下降。對該近交系動物進行胰島素耐量檢測的結(jié)果顯示，糖尿病組動物胰島素敏感性顯著降低，進一步證實了該模型近交系為Ⅱ型糖尿病模型。但對同年齡段糖尿病動物和對照組動物每天攝食量檢測后發(fā)現(xiàn)，二者采食量差異無顯著性(5.40±1.40 vs 4.86±1.86) g。這些結(jié)果說明該近交系表現(xiàn)出明顯的瘦素抵抗，瘦素血清水平的升高與體脂和肥胖直接關聯(lián)，對體重調(diào)節(jié)、能量消耗、食欲和進食等有重要作用，對保持肥胖特征和體重非常關鍵[10-11]。脂聯(lián)素的檢測結(jié)果進一步說明其降低常與胰島素抵抗、肥胖和Ⅱ型糖尿病相關[12]。但根據(jù)采食量檢測結(jié)果推斷長爪沙鼠糖尿病動物的發(fā)病不是由增加食物攝取導致的。

3 糖尿病長爪沙鼠胰腺、肝、腎和肌肉組織病理學變化

Ⅱ型糖尿病患者常伴有并發(fā)癥的發(fā)生，比如肝、腎、神經(jīng)系統(tǒng)和眼部并發(fā)癥[12-13]。我們對糖尿病長爪沙鼠進行了病理形態(tài)學檢測，HE染色結(jié)果顯示，在糖尿病長爪沙鼠胰腺、肝和腎中均出現(xiàn)不同程度的病變。肝發(fā)生明顯脂肪變性和局灶性壞死。腎在低倍鏡下可見腎被膜完整，腎小管結(jié)構清晰，小管內(nèi)偶見粉染蛋白樣物質(zhì)，可見個別腎小球發(fā)生固縮。高倍鏡下，固縮的腎小球體積變小，著色加深，毛細血管結(jié)構不清晰；部分腎小管上細胞腫脹，細胞界限不清晰，有的脫落到管腔中，部分細胞核固縮、碎裂、溶解至消失；間質(zhì)疏松、水腫，局部血管充血、出血。胰腺出現(xiàn)局部壞死現(xiàn)象。對肝組織的電鏡觀察結(jié)果顯示，糖尿病動物肝組織細胞內(nèi)脂滴顯著增多，有明顯的肝脂肪變性，且可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張和脫顆粒化以及線粒體腫脹。這些結(jié)果說明糖尿病沙鼠的肝、腎和胰腺均發(fā)生一定程度的組織損傷病變，并可能繼發(fā)于慢性糖尿病。

4 長爪沙鼠糖尿病發(fā)生的分子機制初探

4.1 糖尿病相關候選基因的克隆與同源性分析

為了研究該長爪沙鼠糖尿病發(fā)生的遺傳學基礎，我們進行了糖尿病相關候選基因的研究。用3’/5’RACE法克隆了長爪沙鼠Glut4、Leptin、Adiponectin、Akt和CAPN10基因的全長cDNA序列，其全長cDNA序列分別為1486 bp、634 bp、1169 bp、2363 bp和2467 bp，并在GenBank中注冊，分別為Glut4(KT377191)、Akt(KT377189)、Leptin(KT377190)、Adiponectin(KT377188)、CAPN10(KT377192)。我們對5個候選基因序列與小鼠、大鼠和人進行同源性分析并繪制了進化樹，發(fā)現(xiàn)Glut4(88.6%、91.4%和91.2%)、Leptin(80.4%、87.5%和87.1%)、Adiponectin(81.2%、90.1%和87.5%)、Akt和CAPN10(83.9%、90.1%和87.5%)的cDNA序列與大鼠、小鼠和人具有高度同源性，其中Akt表現(xiàn)出最高同源性(在人、小鼠和大鼠中分別為91.0%、90.9%和96.1%)；Leptin(78.7%、85.8%和84.6%)、Adiponectin(84.1%、93.1%和88.6%)、Akt(98.1%、99.4%和99.6)和CAPN10(81.1%、93.4%和92.8%)的蛋白序列與大鼠、小鼠和人也表現(xiàn)出了高度的相似性，而Glut4的同源性較低(在人、小鼠和大鼠中分別為24.5%、24.0%和23.8%)。

4.2 長爪沙鼠胰腺、肌肉、肝和腎等組織中候選基因的表達水平

為深入了解該模型動物糖尿病發(fā)生機制，我們用免疫組化方法對克隆的5個候選基因在腎、胰腺、肝、脂肪和肌肉中的表達水平進行了測試。結(jié)果顯示，在糖尿病動物腎和胰腺組織中Adiponectin的表達均明顯降低；Glut4在腎組織中表達下降；Akt在腎中表達下降。為進一步判定發(fā)生胰島素抵抗的器官或組織，分析該模型動物糖尿病相關基因的表達差異和遺傳特征，分析其可能的調(diào)控途徑和它們之間的關聯(lián)，我們又運用Realtime-PCR和Western blot方法對這5個基因在胰腺、肌肉、肝、腎和脂肪5種組織中的mRNA水平和蛋白水平進行了分析。Western blot結(jié)果顯示，糖尿病動物在肌肉組織中Leptin表達升高，而Adiponectin表達下降；Realtime-PCR結(jié)果顯示，肌肉組織中adiponectin表達下降，CAPN10表達有下降趨勢。

有研究報道稱脂聯(lián)素是一種增加葡萄糖吸收的脂肪因子，肌肉組織是其靶器官[14]，可通過AMP依賴性蛋白激酶途徑刺激葡萄糖吸收和脂肪酸氧化，從而導致血清膽固醇升高[15]。科學家研究發(fā)現(xiàn)瘦素也可以通過AMPK途徑調(diào)節(jié)脂肪酸氧化[16]。脂聯(lián)素也可以在血中胰島素水平降低狀態(tài)下通過保存脂肪組織質(zhì)量調(diào)節(jié)瘦素水平[17]。在肝中，adiponectin通過脂聯(lián)素受體1(adipoR1)激活AMPK和PPARα從而降低肝脂肪生成和增加β氧化[18]。在腎中，adiponectin與受體結(jié)合激活AMPK，從而保護腎不受高脂飼料誘導的影響[19]。我們的結(jié)果也顯示，兩種基因在腎或肌肉中的表達與對照不同，表明瘦素和脂聯(lián)素參與了長爪沙鼠Ⅱ型糖尿病的發(fā)生。另外我們還檢測了CAPN10基因，其在骨骼肌中mRNA表達呈下降趨勢，這與報道CAPN10參與葡萄糖代謝并在骨骼肌中表達呈下降趨勢一致[20-21]，說明長爪沙鼠糖尿病的發(fā)生和CAPN10有關，也進一步證明骨骼肌可能是長爪沙鼠糖尿病發(fā)病的一個主要靶器官。

5 發(fā)現(xiàn)了肥胖型和非肥胖型糖尿病長爪沙鼠模型群體

臨床數(shù)據(jù)顯示，糖尿病患者具有肥胖和非肥胖兩種類型[22]，同樣健康個體也有肥胖和非肥胖之分[23]。我們在糖尿病近交系的培育中幸運地發(fā)現(xiàn)糖尿病長爪沙鼠也具有類似特征，根據(jù)體重范圍將成年體重60 ～ 75 g之間的動物定義為非肥胖動物，≥94 g的成年動物定義為肥胖動物；選取1 ～ 1.5歲的動物進行MRI、葡萄糖耐量、胰島素耐量和胰島素釋放的檢測，根據(jù)體重和血糖將沙鼠分為non-obesity non-diabetes (NOND)、obesity non-diabetes (OND)、non-obesity diabetes (NOD)和obesity diabetes (OD)共4組，各組體重結(jié)果顯示，OND和OD組體重顯著高于NOND和NOD組(超出55.6%)，MRI檢測NOND、OND、NOD和OD各組脂肪分布的結(jié)果說明，OND和OD組相對脂肪面積遠高于NOND和NOD組。對4組動物進行葡萄糖耐量、胰島素耐量和胰島素釋放量的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OND組葡萄糖耐量正常、胰島素耐量受損和胰島素釋放正常；NOD組葡萄糖耐量受損、胰島素耐量正常而胰島素釋放增加；OD組葡萄糖耐量受損、胰島素耐量受損且胰島素釋放增加，這些結(jié)果和我們對臨床病人分組檢測的結(jié)果非常相似，也和臨床報道一致，即消瘦型糖尿病不存在向心性肥胖所以不存在胰島素抵抗，同樣在消瘦型糖尿病中脂肪分布也發(fā)生改變[24]，肥胖糖尿病個體有更嚴重的異位和內(nèi)臟脂肪堆積，且胰島素抵抗較嚴重[25]。

6 長爪沙鼠NOND、OND、NOD和OD型動物各部位脂肪組織分布和細胞體積變化

利用動物模型的優(yōu)勢，我們收集了皮下脂肪、性腺周圍脂肪、腎周圍脂肪、腸系膜脂肪和胰腺脂肪進行稱重，計算不同部位脂肪占體重或總脂肪的百分比，進行統(tǒng)計分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)整體為肥胖動物即OND和OD組總脂肪和不同部位脂肪重量增加，而NOD組皮下和腎周圍脂肪與NOND組相比顯著增加；各部位脂肪占體重的百分比與各部位脂肪重量結(jié)果趨勢相一致；但是各部位脂肪量和總脂肪量比值則發(fā)生了改變，皮下脂肪/總脂肪量比在2個肥胖組(OND和OD組)顯著低于2個正常體重組，腎周脂肪占總脂肪量比在3個疾病組均稍高于正常對照組，而性腺周圍脂肪在OND和OD組占總脂肪的百分比下降。這說明皮下脂肪在肥胖時對總脂肪量的貢獻率顯著降低，而腎周脂肪與疾病的出現(xiàn)有關。

用HE染色方法對NOND、OND、NOD和OD 4組動物皮下、性腺和腎周脂肪細胞大小進行檢測。Image J分析結(jié)果顯示，肥胖個體即OND和OD組皮下、性腺周圍和腎周圍脂肪細胞大小均增加，且與NOND和NOD相比具有顯著差異。皮下和腎周圍脂肪細胞大小在NOD組中與NOND相比具有增大趨勢(HE結(jié)果)但無統(tǒng)計學差異。有報道認為成年時期機體脂肪細胞數(shù)量是固定的，即使是在肥胖狀態(tài)下，脂肪細胞的總量在兒童和青少年期被確定，因此兒童期根據(jù)機體的需要可能是總數(shù)量改變的唯一機會[26]。這些結(jié)果說明，肥胖組無論是否糖尿病，其各部位脂肪量增加和脂肪擴張的原因主要是各部位脂肪細胞增大導致的。也進一步驗證了肥胖組動物總的和不同部位脂肪重量增加，NOD組皮下和腎周圍脂肪與NOND組相比增加。

7 結(jié)語

筆者團隊培育出的自發(fā)性長爪沙鼠糖尿病模型近交系，已確定其為Ⅱ型糖尿病。它不但豐富了我國實驗動物資源，同時為糖尿病這一全球重大疾病的研究提供了寶貴的動物模型資源。尤其是肥胖和非肥胖糖尿病長爪沙鼠的發(fā)現(xiàn)和亞型分類，為研究人類肥胖、非肥胖糖尿病和肥胖糖尿病的機制與藥物開發(fā)提供良好模型材料，必將推動糖尿病發(fā)病機制研究、藥物研發(fā)和評價以及臨床不同亞型糖尿病的精準治療研究的進程。