徐榮剛，王霞，王芳，孫錦，毛德才，喬歡歡，賈豫，朱芮葆，彭娉，劉魯萍，倪建泉

(清華大學醫(yī)學院，北京 100084)

果蠅具有易于飼養(yǎng)、生命周期短、繁殖能力強、染色體簡單、突變表型多且易于觀察等諸多優(yōu)點，并且可以進行品系資源庫的開發(fā)、保存和大批量的功能篩選，是科研領(lǐng)域最為經(jīng)典、最為重要的模式生物之一。此外，果蠅中的基因與人類高度同源，因此以果蠅為模型進行干細胞調(diào)控和人類疾病等相關(guān)研究不僅成本低，而且不受倫理上的限制。利用果蠅作為模式生物，人們?nèi)〉昧艘幌盗兄卮蟮目蒲谐晒?，并多次獲得諾貝爾獎，幫助人們更好地理解動物的遺傳發(fā)育、新陳代謝等過程，揭示人類疾病的致病機理并提供治療方法。然而，在研究過程中經(jīng)常受到遺傳工具和果蠅品系的限制，無法實現(xiàn)目的基因的有效調(diào)控，進而阻礙實驗的深入開展。為了解決這一問題，我們在果蠅中先后開發(fā)并優(yōu)化了CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)、CRISPR/dCas9介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)和下一代轉(zhuǎn)基因RNAi技術(shù)。同時，利用這些新穎的遺傳學技術(shù)，我們構(gòu)建了相應(yīng)的果蠅品系資源庫，覆蓋了果蠅中的大部分基因，使清華大學果蠅中心成為世界上最大的果蠅品系資源庫之一。這些遺傳工具和果蠅品系資源被國內(nèi)外果蠅研究領(lǐng)域的實驗室廣泛使用，推動了相關(guān)研究的快速開展。

1 果蠅中CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)

基因編輯技術(shù)是進行生物醫(yī)學研究最為重要的一種技術(shù)手段，能夠有效調(diào)控靶基因的表達，促進更多的研究成果。最開始的基因編輯技術(shù)是通過X射線等高能粒子、甲基磺酸乙酯(ethylmethylsulfone, EMS)等化學誘變劑以及轉(zhuǎn)座子等進行基因突變，但這些方法只是隨機突變，且可能出現(xiàn)多個突變位點，后續(xù)的鑒定工作異常繁瑣[1]。隨后的鋅指核酸酶(zinc-finger nucleases, ZFN)和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like (TAL) effector nucleases, TALEN)基因編輯技術(shù)雖然具有了靶向性，但需要體外構(gòu)建針對靶基因的模塊化識別蛋白，步驟繁瑣，成本較高[1]。近些年，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)快速發(fā)展并逐漸成為基因組突變的理想方法。CRISPR/Cas9系統(tǒng)主要由Cas9和sgRNA兩部分組成，其中Cas9蛋白具有核酸酶的活性，能夠切割DNA雙鏈，而sgRNA可以引導(dǎo)Cas9蛋白到達靶標區(qū)域[2]。該系統(tǒng)的特異性由位于sgRNA5’端的20個核苷酸的靶標序列決定，所以在該系統(tǒng)中只需要改變sgRNA上20個核苷酸的序列就可以實現(xiàn)靶向不同基因的目標，實現(xiàn)了簡便、特異、高效、經(jīng)濟的基因編輯。

為了將CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用到果蠅中，我們構(gòu)建了在果蠅生殖細胞穩(wěn)定表達Cas9蛋白的轉(zhuǎn)基因品系，只需要在該轉(zhuǎn)基因果蠅中注射表達sgRNA的質(zhì)粒就能實現(xiàn)高效的靶基因突變，由此形成了特異性靶向果蠅生殖細胞的可遺傳突變系統(tǒng)。此外，我們評估了使用不同的啟動子和載體骨架表達sgRNA對于突變效率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用U6B人工合成啟動子載體取得了接近100%的突變效率[3]。這一系統(tǒng)只在生殖細胞系中發(fā)揮作用，因此克服了體細胞突變引起的毒性，并且使獲得可遺傳突變體的成本降低、時間縮短、效率更高。在該系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，通過突變Cas9核酸酶的結(jié)構(gòu)域，我們構(gòu)建了表達Cas9 nickase的轉(zhuǎn)基因果蠅。Cas9 nickase只切割DNA單鏈，因此在單個sgRNA引導(dǎo)下不會產(chǎn)生突變，而利用2個反向的sgRNA則可以最大程度地避免脫靶效應(yīng)，高特異性地構(gòu)建基因定點突變[4]。在利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進行基因組編輯的過程中，sgRNA的標靶效率是編輯成敗的關(guān)鍵。因此，我們在CG含量、脫靶條件、注射濃度等方面對sgRNA的參數(shù)進行了系統(tǒng)的優(yōu)化。這些改進使我們能夠通過一次胚胎注射，首次實現(xiàn)多個基因的同時誘導(dǎo)突變，并顯著提高了同源重組修復(fù)的效率[5]。多次實踐結(jié)果表明，我們開發(fā)并優(yōu)化的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)是果蠅基因編輯領(lǐng)域最先進、最高效的系統(tǒng)，具有特異性高、成本低、并且可以半高通量構(gòu)建突變體等優(yōu)勢[6-7]。該系統(tǒng)自開發(fā)以來就受到廣泛使用，這種強大的遺傳學方法已經(jīng)在果蠅各個研究領(lǐng)域發(fā)揮重要的作用。

2 果蠅中CRISPR/dCas9介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)

增強基因表達是進行基因功能研究最常用的技術(shù)手段之一，傳統(tǒng)方式主要通過表達由外源載體攜帶的目的基因的cDNA[8]，但是其克隆步驟繁瑣，成本高，不能同時表達多個基因，并且只過表達cDNA的方式不能反映基因自身的表達模式，容易產(chǎn)生假陽性的結(jié)果。將CRISPR/Cas9系統(tǒng)中Cas9蛋白的核酸酶活性突變之后，CRISPR/Cas9系統(tǒng)會失去切割DNA的能力，但是其識別和結(jié)合DNA的能力不受影響。如果在核酸酶活性缺失的Cas9蛋白(dCas9)C端融合轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，在sgRNA的引導(dǎo)下，就可以在基因座的原位增加目標基因的轉(zhuǎn)錄。而且，針對不同的基因只需要改變sgRNA序列即可，可以實現(xiàn)簡單、高效的轉(zhuǎn)錄激活，適合大規(guī)模、高通量的激活操作。

為了開發(fā)果蠅中CRISPR/dCas9介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)，我們與哈佛大學的研究組合作在果蠅體內(nèi)首次開發(fā)了dCas9-VPR轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)，并證明該系統(tǒng)可以激活目的基因的表達并產(chǎn)生特定的表型[9-10]，為果蠅體內(nèi)gain-of-function研究提供了重要的技術(shù)支持。盡管這一系統(tǒng)可以激活目的基因轉(zhuǎn)錄而產(chǎn)生表型，但是其激活效果仍然較低，往往需要兩個sgRNA才能實現(xiàn)高效的轉(zhuǎn)錄激活，增加了系統(tǒng)的成本和復(fù)雜性。另外，這個系統(tǒng)需要三個獨立的元件，Gal4、UAS:dCas9-VPR和sgRNA，使用時需要復(fù)雜的遺傳整合。為了解決上述問題，我們研發(fā)了下一代CRISPR/dCas9轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)，flySAM，利用自剪切肽T2A同時表達兩個融合的激活蛋白dCas9-VP64和MCP-p65-HSF1，并將UAS:dCas9-activator 和sgRNA整合到一個載體。結(jié)果表明flySAM顯著提升了系統(tǒng)的激活效率，在一個sgRNA的驅(qū)動下就可以實現(xiàn)高效的激活，產(chǎn)生比dCas9-VPR系統(tǒng)更嚴重的表型。flySAM系統(tǒng)只需要一次遺傳雜交就可以完成轉(zhuǎn)錄激活，并且可以同時激活多個基因的表達[11]。更重要的是，以flySAM轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)為基礎(chǔ)的基因組范圍的轉(zhuǎn)基因過表達資源庫正在構(gòu)建中，這將是世界上第一個果蠅轉(zhuǎn)基因過表達資源庫，這一品系資源庫將為整個果蠅研究領(lǐng)域提供重要的技術(shù)資源，推動相關(guān)研究的快速開展。

3 新一代轉(zhuǎn)基因RNAi技術(shù)

Andy Fire和Craig Mello因為發(fā)現(xiàn)雙鏈RNA (double-stranded RNA, dsRNA)可以結(jié)合與其互補的mRNA，并引發(fā)目的mRNA的降解，而獲得了2006年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎，這一發(fā)現(xiàn)是RNAi技術(shù)不斷發(fā)展和完善的奠基性工作[12]。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，當dsRNA被注射到線蟲或果蠅等模式動物體內(nèi)后，會被蛋白酶Dicer切割成大小為21 bp的siRNAs，siRNA促使RNA沉默復(fù)合體與目的mRNA結(jié)合，催化mRNA的剪切降解或干擾翻譯過程，進而敲低目的基因的表達[12]。RNAi技術(shù)自從出現(xiàn)開始就得到了廣泛的關(guān)注并快速發(fā)展，能夠簡單、高效地敲低目的基因，是較為理想的基因調(diào)控技術(shù)，適合大規(guī)模的基因篩選操作。如果將RNAi技術(shù)與Gal4/UAS系統(tǒng)結(jié)合到一起，就可以實現(xiàn)在特定的組織器官、特定的發(fā)育階段敲低目的基因，使條件性調(diào)控基因表達成為可能。在果蠅中為了實現(xiàn)條件性的基因敲低，最開始的轉(zhuǎn)基因RNAi技術(shù)是通過P-element整合并構(gòu)建UAS-dsRNA的轉(zhuǎn)基因果蠅，但這種隨機插入的方式會產(chǎn)生較高的假陰性和假陽性結(jié)果[13-14]。隨后通過開發(fā)phiC31介導(dǎo)的定點整合以及利用UAS-shRNA取代dsRNA的方式，在一定程度上降低了RNAi技術(shù)的假陰性和假陽性，并可以在果蠅體細胞和生殖細胞中實現(xiàn)高效的RNAi[15-17]。

然而，隨著使用的深入，現(xiàn)存的轉(zhuǎn)基因RNAi技術(shù)的一些不足逐漸暴露出來，例如對于高表達基因的低效敲低造成的假陰性結(jié)果；即使沒有Gal4的驅(qū)動，基礎(chǔ)啟動子本底表達的shRNA水平也比較高，會產(chǎn)生假陽性的結(jié)果；不能同時敲低多個目的基因的表達，阻礙對蛋白質(zhì)復(fù)合體以及功能冗余基因的研究等。為了解決這些問題，提高轉(zhuǎn)基因RNAi技術(shù)的效率、特異性和多靶點特性，我們獨立探索并成功開發(fā)了新一代的轉(zhuǎn)基因RNAi技術(shù)。新一代的轉(zhuǎn)基因RNAi技術(shù)，與之前的轉(zhuǎn)基因RNAi技術(shù)相比，其干擾效率高、毒副作用小、特異性高、應(yīng)用面廣、能夠高效地敲低高表達基因，并且首次突破性地實現(xiàn)了多個基因的同時調(diào)控，該項技術(shù)已經(jīng)獲得了國家發(fā)明專利。利用新一代轉(zhuǎn)基因RNAi技術(shù)，我們構(gòu)建了與人類疾病相關(guān)基因的轉(zhuǎn)基因RNAi品系資源庫，包含各細胞信號通路基因、RNA結(jié)合蛋白基因以及蛋白激酶基因等。這一技術(shù)及其相應(yīng)的果蠅品系資源庫將會受到果蠅研究領(lǐng)域的廣泛使用，有助于相關(guān)研究的快速發(fā)展。

4 清華大學果蠅資源中心

清華大學果蠅中心自2011年建立以來，一直面向國內(nèi)外科研機構(gòu)提供轉(zhuǎn)基因果蠅品系和技術(shù)支持，并在維護現(xiàn)有品系的同時，不斷研發(fā)新穎的果蠅遺傳學技術(shù)，不斷擴大果蠅品系資源庫，使清華果蠅中心成為世界上最重要的果蠅技術(shù)與資源中心之一[18]。首先，為了方便果蠅研究領(lǐng)域的實驗室開展研究，我們利用自主研發(fā)的生殖細胞特異的CRISPR/Cas9基因定點編輯技術(shù)構(gòu)建了100余株與人類疾病基因同源的突變體品系，這些突變體是在果蠅研究過程中最常用的品系，將大大加快相關(guān)研究的開展速度。其次，利用最新研發(fā)的新一代轉(zhuǎn)基因RNAi技術(shù)，我們又構(gòu)建了3500余株與人類高度同源且與疾病相關(guān)基因的轉(zhuǎn)基因RNAi品系，包含了各細胞信號通路基因、RNA結(jié)合蛋白基因以及重要蛋白復(fù)合體的基因?，F(xiàn)如今清華大學果蠅中心共存有一萬多株轉(zhuǎn)基因RNAi的果蠅品系，覆蓋了果蠅中的大部分基因，能夠滿足國內(nèi)外果蠅研究領(lǐng)域的大部分使用需求。另外，利用實驗室最新研發(fā)的果蠅中CRISPR/dCas9介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)，我們也已經(jīng)構(gòu)建了一千余株轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄激活果蠅品系。我們將利用新開發(fā)的CRISPR/dCas9介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)和新一代轉(zhuǎn)基因RNAi技術(shù)繼續(xù)擴大清華果蠅中心的品系資源庫，努力將清華果蠅中心建成世界上最大、資源最豐富的果蠅資源庫，并爭取成為國家級模式動物果蠅中心。