王歡，江莉

精子發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的多因素調(diào)控過程，二倍體的精原細(xì)胞經(jīng)過一系列生化、生理和形態(tài)學(xué)的改變，形成單倍體精子。染色體異常、基因調(diào)控異常，環(huán)境因素、感染因素、免疫因素、內(nèi)分泌失調(diào)，以及其他疾病如精索靜脈曲張、輸精管阻塞、抗精子抗體、隱睪癥、逆行射精、睪丸癌、繼發(fā)睪丸創(chuàng)傷等，可導(dǎo)致精子發(fā)生障礙從而引起男性不育。其中，弱精子癥是最常見的男性不育癥類型，指精液中前向運(yùn)動(dòng)的精子數(shù)量（A類和B類）低于50%或快速直線前向運(yùn)動(dòng)的精子數(shù)量低于25%的病癥，主要特征表現(xiàn)為精子活力差，前向運(yùn)動(dòng)能力低。約70%的不育男性存在不同程度的弱精子癥［1］，至今對(duì)其發(fā)病機(jī)制尚未能確切闡明。目前普遍認(rèn)為，基因調(diào)控異常是弱精子癥發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。近年來，微小RNA（microRNA，miRNA）功能的研究正在不斷深入，其主要研究熱點(diǎn)包括細(xì)胞的增殖分化和凋亡、胚胎發(fā)育、癌癥發(fā)生和惡變、病毒感染等。在男性不育研究領(lǐng)域，研究者們一致認(rèn)為，miRNA通過調(diào)控其特異的靶基因轉(zhuǎn)錄和翻譯而影響精子發(fā)生過程。在此，本文對(duì)miRNA在弱精子癥發(fā)病機(jī)制中參與調(diào)控作用的研究進(jìn)行綜述。

1 睪丸組織中的miRNA

miRNA是單鏈、內(nèi)源性的非編碼小分子RNA，長(zhǎng)度為22～24個(gè)核苷酸。miRNA基因在細(xì)胞核內(nèi)通過RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生初始轉(zhuǎn)錄本，即pri-miRNA，然后在Drosha RNase酶的作用下剪切為60～70 bp的miRNA前體（pre-miRNA），pre-miRNA通過核內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin-5轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，再由Dicer進(jìn)一步剪切成為成熟的miRNA。這些成熟的miRNA與靶向mRNA的3'非編碼區(qū)（3'UTR）堿基互補(bǔ)配對(duì)，在轉(zhuǎn)錄后對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行負(fù)向調(diào)控，從而引起靶向mRNA的降解或翻譯抑制［2］。miRNA主要是對(duì)內(nèi)源性mRNA進(jìn)行修飾，并且在表達(dá)上具有發(fā)育時(shí)序性和組織特異性，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和凋亡等過程。

miRNA在哺乳動(dòng)物的睪丸、附睪、精原細(xì)胞、精子和精漿中廣泛表達(dá)［3］。2013年，YANG等［4］首次用Solexa高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)人類睪丸miRNA，發(fā)現(xiàn)770個(gè)已知的miRNA和5個(gè)新的miRNA。采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）對(duì)這些miRNA進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明，檢測(cè)到的miRNA在人睪丸中均有表達(dá)，以let-7家族的表達(dá)最為明顯，其中l(wèi)et-7f-5p、let-7a-5p、let-7c、let-7b-5p、let-7g-5p的表達(dá)最為豐富。

miRNA在靈長(zhǎng)類動(dòng)物的成熟和未成熟睪丸組織存在差異表達(dá)。部分miRNA在靈長(zhǎng)類動(dòng)物未成熟睪丸組織中高度表達(dá)，而在成熟睪丸組織中不表達(dá)［5］，如hsa-miR-154；而有些miRNA在靈長(zhǎng)類動(dòng)物成熟睪丸組織中高表達(dá)，而在未成熟睪丸組織中不表達(dá)，如hsa-miR-34b、hsa-miR-34c、hsamiR-449、has-miR-124a、hsa-miR-449 等。

LUO等［3］通過高通量測(cè)序比較長(zhǎng)白公豬精子發(fā)生的3個(gè)主要階段的miRNA表達(dá)譜，分別構(gòu)建了睪丸、附睪和精子3個(gè)小RNA文庫(kù)，共獲得3 821個(gè)編碼4 761個(gè)成熟miRNA的前體發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其中有23個(gè)miRNA*。3個(gè)文庫(kù)中共同表達(dá)的miRNA有710個(gè)，而764個(gè)（16.05%）miRNA在睪丸特異表達(dá)，1 416個(gè)（29.74%）miRNA在附睪特異表達(dá)，784個(gè)（16.47%）miRNA在精子特異表達(dá)。檢測(cè)到的4 761個(gè)miRNA中，有1 447個(gè)是5'鏈miRNA，1 434個(gè)是3'鏈miRNA，其余1 880個(gè)（940對(duì)）miRNA是姐妹鏈，這些成對(duì)的姐妹鏈來自相同的前體，占總成熟序列miRNA的1/3，而且同對(duì)姐妹鏈之間相互獨(dú)立，具有各自的階段特異性表達(dá)。該研究證實(shí)了miRNA及其對(duì)應(yīng)的miRNA*來自同一前體，這是miRNA在睪丸表達(dá)的特征。由此可見，miRNA在睪丸組織及其不同發(fā)育階段的表達(dá)存在特異性，說明miRNA對(duì)精子發(fā)生、發(fā)育有著不可或缺的作用。

2 miRNA與精子發(fā)生

與體細(xì)胞相比，miRNA在原始生殖細(xì)胞（primordial germ cells，PGCs）、精原干細(xì)胞（spermatogonial stem cell，SSCs）和精原細(xì)胞中有更高的表達(dá)水平［6-7］。因此，miRNA被認(rèn)為是生殖細(xì)胞發(fā)育的強(qiáng)有力調(diào)節(jié)器。哺乳動(dòng)物的PGCs來源于胚胎外胚層，人類PGCs可能在原腸胚時(shí)期（約第17天的胚胎）形成。在4周時(shí)，原始生殖細(xì)胞位于鄰近卵黃囊壁靠尿囊處，通過后腸遷移到生殖嵴（胚胎性腺）［8］，并隨著性腺的不斷分化而迅速增殖。因而，PGCs是各型生殖細(xì)胞的祖細(xì)胞，是哺乳動(dòng)物生命周期得以延續(xù)的關(guān)鍵第一步。目前明確在PGCs特異表達(dá)的有miR-290-295、miR-17-92基因簇和miR-302家族等，miR-302家族包括miR-302a-3p/-5p、miR-302d-3p、miR-302c-3p，其已驗(yàn)證的靶基因是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（CDKN1A）［7］。精子發(fā)生的持續(xù)進(jìn)行依賴于小亞群未分化的具有干細(xì)胞功能的精原細(xì)胞，即SSCs。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-20、miR-21、miR-34c、miR-135a、miR-146a、miR-182、miR-183、miR-221/222、miR-204、miR-465a-3p、miR-465b-3p、miR-465c-3p、miR-465c-5p、miR-544在 人SSCs特異表達(dá)，參與調(diào)控SSCs的自我更新和分化［9］。轉(zhuǎn)染miR-221/222抑制物后，小鼠未分化的SSCs池?cái)?shù)量下降，引起與生殖細(xì)胞衰老相關(guān)的功能障礙，但不引起細(xì)胞凋亡［10］。HUSZAR等［11］研究miRNA介導(dǎo)的基因調(diào)控在維持精原細(xì)胞未分化狀態(tài)及其誘導(dǎo)分化的作用，發(fā)現(xiàn)miR-146在未分化的精原細(xì)胞中高表達(dá)，參與調(diào)控維甲酸誘導(dǎo)的小鼠精原細(xì)胞分化，其中一部分由Med1（維甲酸受體的輔調(diào)節(jié)因子）介導(dǎo)。miR-17-92基因簇是含有共同miRNA位點(diǎn)的4個(gè)不同miRNA家 族（miR-17、miR-18、miR-19、miR-25）， 可 能 參 與SSCs的早期分化，也在未分化的精原細(xì)胞中表達(dá)，在分化過程中表達(dá)下調(diào)。miR-17-92基因簇能下調(diào)E2F1基因，避免精子發(fā)生過程中減數(shù)分裂的細(xì)胞凋亡。DDX4 Cre誘導(dǎo)miR-17-92基因簇使生殖功能障礙，睪丸體積減小和質(zhì)量減輕［12］。敲除miR-17-92基因簇的成年小鼠出現(xiàn)生殖功能障礙和異常的睪丸表型（如睪丸嚴(yán)重萎縮，精原細(xì)胞、SSCs丟失，生殖細(xì)胞凋亡和精子生成減少）［13］。

在精子發(fā)生的不同細(xì)胞階段，miRNA的表達(dá)也有所不同。從睪丸組織分離的細(xì)胞群，如支持細(xì)胞、精原細(xì)胞、粗線期精母細(xì)胞、圓形/長(zhǎng)形精子細(xì)胞和精子，有28種睪丸特異miRNA共同表達(dá)，表明在精子發(fā)生過程中減數(shù)分裂后期和單倍體生殖細(xì)胞是miRNA產(chǎn)生的主要來源［14］。COMAZZETTO等［15］探討了miRNA通路在精子發(fā)生有絲分裂后期的作用，發(fā)現(xiàn)Dicer酶的表達(dá)在粗線期精母細(xì)胞達(dá)到最大值。越來越多關(guān)于Dicer酶與生殖細(xì)胞的研究也證實(shí)了miRNA對(duì)精子發(fā)生調(diào)控信號(hào)的重要性［16］。敲除Dicer的睪丸組織處于細(xì)胞增殖和/或分化的早期階段，延緩了精子發(fā)生過程，同時(shí)干擾miRNA的正常機(jī)制，長(zhǎng)形精子細(xì)胞形態(tài)和活力發(fā)生異常［16-17］。

目前研究較多的是miR-34家族，該家族的miRNA有共同的種子序列GGCAGUG，在雄性生殖細(xì)胞特異表達(dá)，是生殖細(xì)胞進(jìn)行減數(shù)分裂所必需。HILZ等［18］研究確定了miR-34b/c是哺乳動(dòng)物精子發(fā)生所需的第1個(gè)miRNA位點(diǎn)。隨著減數(shù)分裂的開始，miR-34家族的表達(dá)也急劇增加。敲除miR-34家族基因的小鼠可導(dǎo)致不育，此外，這些小鼠很少能產(chǎn)生成熟的精子。miR-34b/c的缺失并沒有阻止精子發(fā)生本身，但干擾了正常發(fā)育階段之間的轉(zhuǎn)換，最終導(dǎo)致精子計(jì)數(shù)低、精子形態(tài)畸形和活力異常。miR-34c主要在減數(shù)分裂的后期形成，參與精子發(fā)生。miR-34c的靶基因TGIF2，其下調(diào)后促進(jìn)TGFB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，而該通路參與了精子發(fā)生過程中粗線期精母細(xì)胞和圓形精子細(xì)胞的形成［19］。除了miR-34家族，miR-29家族是第2個(gè)發(fā)現(xiàn)的在精子發(fā)生過程也有重要作用的miRNA家族，且miR-29家族參與生殖細(xì)胞減數(shù)分裂前和減數(shù)分裂時(shí)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用比miR-34家族介導(dǎo)得更為廣泛。miR-29家族可能在減數(shù)分裂過程中主要對(duì)雙鏈DNA斷裂進(jìn)行修復(fù)，此外還能調(diào)節(jié)多種細(xì)胞外基質(zhì)成分，對(duì)生殖細(xì)胞基底膜動(dòng)力學(xué)發(fā)揮一定作用［20］。

精子發(fā)生過程中基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控是極其活躍的，表明miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)在精子發(fā)生翻譯水平中發(fā)揮了潛在作用。miRNA介導(dǎo)過渡蛋白（TPs）和魚精蛋白（PRM）翻譯水平的調(diào)控，而TPs和PRM表達(dá)的正確時(shí)機(jī)是晚期精子發(fā)生中組蛋白-PRM成功轉(zhuǎn)型的關(guān)鍵。TP2和PRM2 mRNA是睪丸特異miR-469的靶基因，miR-469抑制粗線期精母細(xì)胞和圓形精子細(xì)胞TP2和PRM2蛋白的表達(dá)，在翻譯水平對(duì)mRNA的降解有輕微影響［21］。PLCXD3蛋白在人和小鼠中呈組織特異性表達(dá)，在精子發(fā)生后期，miR-34c-3p能降低PLCXD3翻譯水平，導(dǎo)致睪丸功能障礙［22］。

3 miRNA與弱精子癥

越來越多的研究表明，正常的精子發(fā)生與生精障礙的miRNA具有不同的表達(dá)模式，這些差異表達(dá)的miRNA可為明確弱精子癥的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)，也可作為診斷弱精子癥新的生物標(biāo)志物基礎(chǔ)。2013年ABU-HALIMA等［23］通過高通量miRNA微陣列平臺(tái)分別檢測(cè)弱精子癥、少弱精子癥患者和正常組精液，與正常組比較發(fā)現(xiàn)，弱精子癥組有50個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)，27個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)，其中miR-30a、miR-24、miR-1274a和miR-4286差異顯著；少弱精子癥組有42個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)，44個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)，其中miR-200c、miR-34b*、miR-15b、miR-34c-5p、miR-449a、miR-16 和miR-19a差異顯著。弱精子癥組和少弱精子癥組有34個(gè)miRNA共同表達(dá)，包括27個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)和7個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)，其中miR-141、miR-193b、miR-26a、miR-29a、miR-429、miR-200a、miR-99a、miR-363、miR-34b、miR-197和miR-122表達(dá)差異顯著。2016年ABU-HALIMA等［24］研究發(fā)現(xiàn)，與正常組精漿比較，少弱精子癥患者有36個(gè)miRNA表達(dá)顯著差異，其中7個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)，以miR-1275表達(dá)最顯著；29個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)，以miR-26b表達(dá)最顯著。

弱精子癥以新鮮精液中精子前向運(yùn)動(dòng)能力低和精子活力差為特點(diǎn)。正常情況下，精子活力是在附睪獲得的，是精子從陰道遷移到輸卵管、穿透卵丘、參與受精的重要?jiǎng)恿?。在維持人類精子活力的過程中，線粒體在提供能量方面起著舉足輕重的作用［25］。而miRNA介導(dǎo)的基因表達(dá)是調(diào)控線粒體功能的重要機(jī)制之一。線粒體相關(guān)的miRNA為線粒體功能潛在的調(diào)控因子，這些miRNA由核基因組和線粒體基因組編碼，可以調(diào)節(jié)核基因編碼的線粒體相關(guān)蛋白，也可以轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體中，從而調(diào)控線粒體基因表達(dá)，參與多種疾病的發(fā)生。在男性不育方面，精漿中線粒體相關(guān)miRNA，即sp-miRNA（seminal plasma miRNA）在弱精子癥中起著重要作用。ZHOU等［26］通過匯集TLDA芯片檢測(cè)嚴(yán)重弱精子癥患者精液，發(fā)現(xiàn)136個(gè)sp-miRNA表達(dá)顯著改變，同時(shí)篩選出與線粒體功能密切相關(guān)的18個(gè)miRNA，通過實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qTR-PCR）驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，弱精子癥組精漿中miR-151a-5p明顯過表達(dá)，而miR-101-3p、let-7b-5p明顯低表達(dá)。轉(zhuǎn)染了miR-151a-5p模擬物的GC-2細(xì)胞，其基礎(chǔ)呼吸耗氧率、三磷腺苷（ATP）產(chǎn)生和質(zhì)子滲漏均顯著下降，表明miR-151a-5p的過表達(dá)能誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體功能障礙，降低線粒體電子傳遞鏈的活動(dòng)，從而影響精子活力。

miRNA的調(diào)控作用貫穿到精子發(fā)生、發(fā)育和成熟的整個(gè)過程。這些過程需要一個(gè)精準(zhǔn)的、具有空間性和時(shí)間性的基因調(diào)控表達(dá)模式。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些參與精子活力的基因， 如 Tektin-t（Tektin-2）、DNAI1、DNAH5、DNAH11、AKAP3、AKAP4、SEPT4、SMCP、SEMG1、CRISP2 等。CRISP2是精子頂體和精子尾部外致密纖維的組成部分，其可以調(diào)節(jié)精子鞭毛運(yùn)動(dòng)，在頂體反應(yīng)過程中從頂體釋放出來［27］。弱精子癥患者多有CRISP2低表達(dá)或miR-27b的過表達(dá)，出現(xiàn)精子活力低下和精子形態(tài)異常的趨勢(shì)［28］。miR-27b主要通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄后水平抑制CRISP2蛋白表達(dá)，影響精子活力。而miR-27a在弱畸精癥患者中高度表達(dá)，主要通過抑制同一靶基因CRISP2影響精子形態(tài)，導(dǎo)致精子畸形［29］。

4 結(jié)論和展望

近年來，人們對(duì)miRNA在睪丸組織的廣泛表達(dá)及其在精子發(fā)生中參與基因表達(dá)的調(diào)控功能有了越來越多的認(rèn)識(shí)。一些miRNA特異表達(dá)于睪丸組織，在其他組織中不存在，且其表達(dá)具有時(shí)序特異性和細(xì)胞特異性。一個(gè)miRNA可能有多個(gè)靶基因，或者一個(gè)基因受多個(gè)不同miRNA的調(diào)控。在體內(nèi)外諸多因素的干擾下，一旦miRNA-mRNA這個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)發(fā)生改變，就會(huì)阻礙精子發(fā)生的有序進(jìn)行，從而導(dǎo)致男性不育。目前對(duì)miRNA參與生殖細(xì)胞增殖、分化和凋亡的調(diào)控作用的研究主要集中在精子發(fā)生的中晚期階段，而對(duì)精子發(fā)生早期階段的miRNA研究仍較少，尤其是從精母細(xì)胞到精原細(xì)胞的過程。弱精子癥作為男性不育最常見的疾病，闡明其發(fā)病機(jī)制和提供診治新策略是首要解決的問題。隨著研究的不斷展開，miRNA在弱精子癥的表達(dá)及其靶基因潛在調(diào)控作用的研究逐漸深入，miRNA可能有望成為診斷弱精子癥和研發(fā)新藥的新型生物標(biāo)志物，對(duì)生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要意義。

本文文獻(xiàn)檢索策略：

（1）檢索數(shù)據(jù)庫(kù)：PubMed、中國(guó)知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)知識(shí)服務(wù)平臺(tái)；（2）檢索詞：microRNA、miRNA、asthenozoospermia、spermatogenesis、male infertility、弱精子癥、男性不育、精子發(fā)生、精原細(xì)胞、精原干細(xì)胞；（3）時(shí)間限制：2000年1月—2017年7月。

作者貢獻(xiàn)：王歡進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)、可行性分析，進(jìn)行文獻(xiàn)/資料收集、整理，撰寫論文；江莉進(jìn)行論文的修訂，負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。

［1］CHEMES H E.Phenotypes of sperm pathology：genetic and acquired forms in infertile men［J］．J Andrology，2000，21（6）：799-808.

［2］PRATT A J，MACRAE I J.The RNA-induced silencing complex：a versatile gene-silencing machine［J］．J Biol Chem，2009，284（27）：17897-17901.DOI：10.1074/jbc.R900012200.

［3］LUO Z，LIU Y，CHEN L，et al．MicroRNA profiling in three main stages during porcine spermatogenesis［J］．J Assist Reprod Genet，2015，32（3）：451-460.DOI：10.1007/s10815-014-0406-x.

［4］YANG Q ，HUA J，WANG L，et al．MicroRNA and piRNA profiles in normal human testis detected by next generation sequencing［J］．PLoS One，2013，8（6）：e66809.DOI：10.1371/journal.pone.0066809.

［5］YAN N，LU Y，SUN H，et al．Microarray profiling of microRNAs expressed in testis tissues of developing primates［J］．J Assist Reprod Genet，2009，26（4）：179-186.DOI：10.1007/s10815-009-9305-y.

［6］BHIN J，JEONG H S，KIM J S，et al．PGC-enriched miRNAs control germ cell development［J］．Mol Cells，2015，38（10）：895-903.DOI：10.14348/molcells.

［7］GARCIA-LOPEZ J，ALONSO L，CARDENAS D B ，et al．Diversity and functional convergence of small noncoding RNAs in male germ cell differentiation and fertilization［J］．RNA，2015，21（5）：946-962.DOI：10.1261/rna.048215.114.

［8］TANG W W，KOBAYASHI T，IRIE N，et al．Specification and epigenetic programming of the human germ line［J］．Nat Rev Genet，2016，17（10）：585-600.DOI：10.1038/nrg.2016.88.

［9］HE Z，JIANG J，KOKKINAKI M，et al．MiRNA-20 and mirna-106a regulate spermatogonial stem cell renewal at the posttranscriptional level via targeting STAT3 and Ccnd1［J］．Stem Cells，2013，31（10）：2205-2217.DOI：10.1002/stem.1474.

［10］YANG Q E，RACICOT K E，KAUCHER A V，et al．MicroRNAs 221 and 222 regulate the undifferentiated state in mammalian male germ cells［J］．Development，2013，140（2）：280-290.DOI：10.1242/dev.087403.

［11］HUSZAR J M，PAYNE C J.MicroRNA 146 （Mir146）modulates spermatogonial differentiation by retinoic acid in mice［J］．Biol Reprod，2013，88（1）：15.DOI：10.1095/biolreprod.112.103747.

［12］TONG M H，MITCHELL D A，MCGOWAN S D，et al．Two miRNA clusters，Mir-17-92 （Mirc1） and Mir-106b-25 （Mirc3），are involved in the regulation of spermatogonial differentiation in mice［J］．Biol Reprod，2012，86（3）：72.DOI：10.1095/biolreprod.111.096313.

［13］XIE R，LIN X，DU T，et al．Targeted disruption of miR-17-92 impairs mouse spermatogenesis by activating mTOR signaling pathway［J］．Medicine （Baltimore），2016，95（7）：e2713.DOI：10.1097/MD.0000000000002713.

［14］YADAV R P，KOTAJA N.Small RNAs in spermatogenesis［J］．Mol Cell Endocrinol，2014，382（1）：498-508.DOI：10.1016/j.mce.2013.04.015.

［15］COMAZZETTO S，DI GIACOMO M，RASMUSSEN K D，et al．Oligoasthenoteratozoospermia and infertility in mice deficient for miR-34b/c and miR-449 loci［J］．PLoS Genet，2014，10（10）：e1004597.DOI：10.1371/journal.pgen.1004597.

［16］FU M，XU K，YE J，et al．Association of polymorphisms of miRNA biogenesis related genes DICER and DROSHA with azoospermia［J］．Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi，2016，33（3）：365-368.DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9406.2016.03.020.

［17］MAATOUK D M，LOVELAND K L，MCMANUS M T，et al．Dicer1 is required for differentiation of the mouse male germline［J］．Biol Reprod，2008，79（4）：696-703.DOI：10.1095/biolreprod.108.067827.

［18］HILZ S，MODZELEWSKI A J，COHEN P E，et al．The roles of microRNAs and siRNAs in mammalian spermatogenesis［J］．Development，2016，143（17）：3061-3073.DOI：10.1242/dev.136721.

［19］ITMAN C，LOVELAND K L.SMAD expression in the testis：an insight into BMP regulation of spermatogenesis［J］．Dev Dyn，2008，237（1）：97-111.DOI：10.1002/dvdy.21401.

［20］HILZ S，F(xiàn)OGARTY E A，MODZELEWSKI A J，et al．Transcriptome profiling of the developing male germ line identifies the miR-29 family as a global regulator during meiosis［J］．RNA Biol，2017，14（2）：219-235.DOI：10.1080/15476286.2016.1270002.

［21］DAI L，TSAI MORRIS C H，SATO H，et al．Testis-specific miRNA-469 up-regulated in gonadotropin-regulated testicular RNA helicase （GrTH/DDX25）-null mice silences transition protein 2and protamine 2 messages at sites within coding region：implications of its role in germ cell development［J］．Biol Chem，2011，286（52）：44306-44318.DOI：10.1074/jbc.M111.282756.

［22］LI Z，ZHENG Z，RUAN J，et al．Integrated analysis miRNA and mRNA profiling in patients with severe oligozoospermia reveals miR-34c-3p downregulates PLCXD3expression［J］．Oncotarget，2016，7（33）：52781-52796.DOI：10.18632/oncotarget.10947.

［23］ABU-HALIMA M，HAMMADEH M，SCHMITT J，et al．Altered microRNA expression profiles of human spermatozoa in patients with different spermatogenic impairments［J］．Fertil Steril，2013，99（5）：1249-1255.DOI：10.1016/j.fertnstert.2012.11.054.

［24］ABU-HALIMA M，LUDWIG N，HART M，et al．Altered microribonucleic acid expression profiles of extracellular microvesicles in the seminal plasma of patients with oligoasthenozoospermia［J］．Fertil Steril，2016，106（5）：1061-1069.DOI：10.1016/j.fertnstert.2016.06.030.

［25］PIOMBONI P，F(xiàn)OCARELLI R，STENDARDI A，et al．The role of mitochondria in energy production for human sperm motility［J］．Int J Androl，2012，35（2）：109-124.DOI：10.1111/j.1365-2605.2011.01218.x.

［26］ZHOU R，WANG R，QIN Y，et al．Mitochondria-related miR-151a-5p reduces cellular ATP production by targeting CYTB in asthenozoospermia［J］．Sci Rep，2015，5：17743.DOI：10.1038/srep17743.

［27］NIMLAMOO W，BEAN B S，LOWE-KRENTZ L J.Human sperm CRISP2 is released from the acrosome during the acrosome reaction and re-associates at the equatorial segment［J］．Mol Reprod Dev，2013，80（6）：488-502.DOI：10.1002/mrd.22189.

［28］ZHOU J H，ZHOU Q Z，LYU X M，et al．The expression of cysteine-rich secretory protein 2 （CRISP2） and its specific regulator miR-27b in the spermatozoa of patients with asthenozoospermia［J］．Biol Reprod，2015，92（1）：28.DOI：10.1095/biolreprod.114.124487.

［29］ZHOU J H，ZHOU Q Z，YANG J K，et al．MicroRNA-27amediated repression of cysteine-rich secretory protein 2 translation in asthenoteratozoospermic patients［J］．Asian J Androl，2017，19（5）：591-595.DOI：10.4103/1008-682X.185001.