陳向華 王建吉 耿學(xué)麗 丁 萌 陶曉明 武英偉 張秀琴

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 承德 067000)

滑膜增生及關(guān)節(jié)軟骨破壞是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)的主要病理特征，滑膜成纖維細(xì)胞是RA滑膜中的主要成分，在病情進(jìn)展中起重要作用〔1〕。白細(xì)胞介素(IL)-17是最新發(fā)現(xiàn)的由角質(zhì)形成細(xì)胞、成骨細(xì)胞等分泌的細(xì)胞因子〔2〕。研究顯示，RA患者血清中IL-17含量增加，與病情發(fā)展相關(guān)〔3〕，但對(duì)滑膜成纖維細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用仍未明確。老年人因免疫和器官功能衰退，對(duì)目前RA治療藥物副作用的敏感性較強(qiáng)。本研究擬分析IL-17對(duì)RA患者成纖維細(xì)胞增殖和趨化因子分泌的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 選取2016年1～6月在承德醫(yī)院院附屬醫(yī)院行關(guān)節(jié)置管術(shù)的老年RA患者，本研究經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清(FBS)購(gòu)于上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司；IL-17、IL-17受體(IL-17R)、同型對(duì)照抗體購(gòu)于上海雅吉生物科技有限公司；蛋白芯片試劑盒(AAH-CYT-1000)購(gòu)于北京華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司；MEK1/2信號(hào)通路抑制劑PD98059、核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB信號(hào)通路抑制劑LY294002、STAT3信號(hào)通路抑制劑AG490，RANKL信號(hào)通路抑制劑小白菊內(nèi)酯均購(gòu)于上海一飛生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1滑膜成纖維細(xì)胞分離與培養(yǎng) 取術(shù)中切除的新鮮滑膜組織，剔除表面纖維和脂肪組織，剪成邊長(zhǎng)為1 mm的正方體小塊，5 mg/ml膠原酶消化60 min，濾去組織殘?jiān)瑢⒓?xì)胞懸液3 000 r/min離心10 min，棄去上清液，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后用含10% FBS的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液孵育24 h，棄去懸浮細(xì)胞，每3 d換1次培養(yǎng)液，90%以上細(xì)胞融合后進(jìn)行傳代，選取5～6代細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2滑膜成纖維細(xì)胞增殖檢測(cè) 取患者對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期滑膜成纖維細(xì)胞接種到24孔板中，CO2孵箱中培養(yǎng)48 h后滴加IL-17(終濃度為100 ng/ml)，并設(shè)置對(duì)照組和空白組。分別于培養(yǎng)0、24、48、72、96、120 h后滴加100 μl/孔3-(4,5-二甲噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)，孵育6 h后棄去上清，滴加500 μl/孔二甲基亞砜(DMSO)，混合均勻后吸入96孔板，450 nm處讀取各孔的吸光度值(OD值)，刺激指數(shù)=(研究組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)。

1.2.3滑膜成纖維細(xì)胞上清液趨化因子檢測(cè) 培養(yǎng)患者長(zhǎng)期滑膜成纖維細(xì)胞，滴加IL-17終濃度為100 ng/ml并設(shè)置對(duì)照組，CO2孵箱中培養(yǎng)48 h，收集上清。使用蛋白芯片試劑盒檢測(cè)滑膜成纖維細(xì)胞上清液趨化因子中性粒細(xì)胞激活肽(ENA)-78、IL-8、生長(zhǎng)相關(guān)癌基因(GRO)、單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1的水平，操作按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。使用激光掃描儀掃描信號(hào)并用軟件進(jìn)行分析。

1.2.4滑膜成纖維細(xì)胞表面IL-17R檢測(cè) 用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析，將滑膜成纖維細(xì)胞按1×105密度接種到6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)90%以上，胰酶消化后轉(zhuǎn)入5 ml的EP管中3 000 r/min離心10 min，棄去上清后加入400 μl PBS混勻，將重懸的細(xì)胞平均分為2份，一份滴加抗IL-17R抗體10 μl，另一份滴加同型對(duì)照10 μl，并在4℃暗室中反應(yīng)40 min，PBS沖洗后重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.5IL-17影響滑膜成纖維細(xì)胞趨化因子分泌的信號(hào)通路 將成纖維細(xì)胞接種到培養(yǎng)皿表面，培養(yǎng)至細(xì)胞覆蓋面積>95%時(shí)，在不同培養(yǎng)皿上分別滴加50 μmol/L PD98059、LY294002、AG490及20 μmol/L小白菊內(nèi)酯孵育60 min，滴加10 ng/ml的IL-17后孵育72 h，去上清，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組(僅滴加10 ng/ml的IL-17)。采用熒光定量PCR法檢測(cè)ENA-78 mRNA、IL-8 mRNA、GRO mRNA、MCP-1 mRNA的表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1不同時(shí)間點(diǎn)滑膜成纖維細(xì)胞增殖情況 IL-17刺激滑膜成纖維細(xì)胞0、24、48、72、96、120 h后刺激指數(shù)(1.000±0.000、0.005±0.010、1.042±0.035、1.225±0.028、1.089±0.006、1.060±0.042)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中刺激72 h時(shí)滑膜成纖維細(xì)胞增殖能力最強(qiáng)。

2.2IL-17對(duì)滑膜成纖維細(xì)胞趨化因子表達(dá)的影響 IL-17刺激滑膜成纖維細(xì)胞48 h后，滑膜成纖維細(xì)胞分泌ENA-78(386.15±9.30)、IL-8(2 128.51±45.93)pg/ml、GRO(4 824.83±155.59)mmol/ml、MCP-1(6 821.68±506.14)水平均明顯高于對(duì)照組〔(55.36±3.81)、(784.95±97.57)pg/ml、(2 857.15±194.37)mmol/ml、(2 814.72±335.90)，P<0.05〕。見(jiàn)圖1。

圖1 RA患者滑膜成纖維細(xì)胞趨化因子蛋白芯片檢測(cè)

2.3滑膜成纖維細(xì)胞表面IL-17R表達(dá)情況 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，加入抗IL-17R抗體組IL-17R表達(dá)百分比〔(0.79±0.17)%〕明顯高于對(duì)照組〔(0.25±0.08)%，P<0.05〕。

2.4IL-17通過(guò)MEK1/2、NF-κB、STAT3信號(hào)通路誘導(dǎo)滑膜成纖維細(xì)胞趨化因子表達(dá) 滴加PD98059、LY294002、AG490后，ENA-78、IL-8、GRO、MCP-1 mRNA表達(dá)量均明顯低于空白對(duì)照組(P<0.05)；而滴加小白菊內(nèi)酯后與空白對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 滴加不同信號(hào)通路抑制劑后滑膜成纖維細(xì)胞上清液趨化因子表達(dá)

與空白對(duì)照組比較：1)P<0.05

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，滑膜成纖維細(xì)胞是滑膜組織中最活躍的細(xì)胞，在RA發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用〔4〕。在RA發(fā)病早期的免疫反應(yīng)中，機(jī)體免疫應(yīng)答激活后，滑膜成纖維細(xì)胞可通過(guò)自分泌、旁分泌方式釋放出細(xì)胞因子、趨化因子等活性介質(zhì)，引發(fā)炎性反應(yīng)，導(dǎo)致骨組織和軟骨組織進(jìn)行性破壞〔5〕；同時(shí)，T細(xì)胞循環(huán)代謝速度增加，中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌出更多炎性細(xì)胞，加速了滑膜成纖維細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活化進(jìn)程〔6〕。

IL-17是近年新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，具有神經(jīng)保護(hù)、免疫調(diào)節(jié)等功能。RA患者關(guān)節(jié)滑液中IL-17水平增加并與白細(xì)胞數(shù)之間呈明顯相關(guān)性。相關(guān)研究顯示，在多種關(guān)節(jié)炎滑膜組織中均存在IL-17表達(dá)，其中RA患者IL-17表達(dá)量明顯高于骨性關(guān)節(jié)炎(OA)等其他患者〔7〕；同時(shí)IL-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α通過(guò)激活JNK/NF-κB信號(hào)通路，上調(diào)RA患者滑膜成纖維細(xì)胞中IL-17 mRNA表達(dá)〔8〕。以上研究提示，IL-17在RA炎性反應(yīng)及骨破壞中起到重要調(diào)控作用。

本研究顯示，IL-17可明顯促進(jìn)RA患者滑膜成纖維細(xì)胞增殖，且IL-17刺激的滑膜成纖維細(xì)胞分泌ENA-78、IL-8、GRO、MCP-1明顯增加；ENA-78、IL-8均屬于CXC亞群趨化因子，其中ENA-78作為多源細(xì)胞因子，在炎性因子作用下由成纖維細(xì)胞、單核細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等合成、分泌，與CXC趨化因子受體(CXCR)2相結(jié)合后可上調(diào)細(xì)胞間黏附分子(ICAM)-1和蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞滲出，抑制炎癥和免疫反應(yīng)。IL-8可趨化嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞并誘導(dǎo)脫顆粒，提升炎癥反應(yīng)程度和細(xì)胞吞噬能力，還能調(diào)控淋巴細(xì)胞再循環(huán)，增加對(duì)變性IgG的抑制作用。GRO家族包括GROα～δ，而CXCR2是其共同的受體，其中GROα與受體結(jié)合力最強(qiáng)；GRO與受體結(jié)合后可誘發(fā)顆粒酶和超氧化物的釋放并參與組織損傷定位。MCP-1由炎性細(xì)胞合成，屬于CC亞群趨化因子，與受體結(jié)合后可活化T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，參與RA的炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果提示MEK1/2、NF-κB、STAT3信號(hào)通路作為細(xì)胞趨化因子表達(dá)的上游激活劑，參與IL-17誘導(dǎo)的細(xì)胞趨化因子分泌。

1王博雯.過(guò)表達(dá)IL-37b基因?qū)︻愶L(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖的影響〔D〕.武漢：華中科技大學(xué),2015.

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