朱 彤 饒井芬 李青山

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科，河北 承德 067000)

炎癥反應(yīng)是冠狀動脈粥樣硬化、感染性休克等多種疾病的病理基礎(chǔ)，白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附、跨內(nèi)皮移行是炎癥反應(yīng)的主要環(huán)節(jié)〔1，2〕。生血寧片的主要成分為蠶砂提取物，具有益氣補血的功效，對貧血癥狀有較好療效。最新研究發(fā)現(xiàn)，生血寧片可有效減輕不良炎癥反應(yīng)，降低炎癥相關(guān)疾病的復(fù)發(fā)率〔3〕，但其作用機制仍未明確。為此，本次研究通過觀察生血寧片對炎性介質(zhì)腫瘤壞死因子(TNF-α)誘導(dǎo)的人外周血中性白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附和游出的影響并分析其相關(guān)機制，為炎癥相關(guān)疾病治療提供新的可能。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 生血寧片(武漢聯(lián)合藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字Z20030088)，TNF-α、1640細(xì)胞培養(yǎng)液(上海元龍生物技術(shù)有限公司)，CD11b、CD18抗體(上海廣銳生物科技有限公司)，人髓過氧化物酶ELISA試劑盒(北京方程生物科技有限公司)；流式細(xì)胞儀(美國BD公司)，酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司)。

1.2方法

1.2.1外周血中性白細(xì)胞分離 采集志愿者血液，抗凝處理后與等體積Hanks液混合均勻，加淋巴細(xì)胞分離液，室溫下3 000 r/min離心30min，取上層與中層分界面之間的白色窄型條帶為中性白細(xì)胞層，吸出后用3倍體積的1640細(xì)胞培養(yǎng)液混合均勻，3 000 r/min離心15 min，用細(xì)胞培養(yǎng)液沖洗細(xì)胞3次，離心后用含10%胎牛血清的1640細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，Trypan blue法檢測活細(xì)胞比例高于90%時進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.2細(xì)胞黏附實驗 將對數(shù)期白細(xì)胞以1×104/孔密度接種到96孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)板中用含10 μg/ml纖維蛋白原和10%胎牛血清的內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基平鋪，給藥組分別加入終濃度為1、10、100 μmol/L的生血寧片，37℃ CO2孵箱中培養(yǎng)60 min，之后滴加20 ng/ml的TNF-α，37℃靜置60 min，取上清后按ELISA試劑盒說明書依次加入反應(yīng)液，讀取450 nm處的吸光度值。

1.2.3跨膜遷移實驗 采用Transwell小室法，將肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞加入3 μm孔徑的流動小室，用含10%胎牛血清的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h。按2×106/孔密度在流動小室表面平鋪中性白細(xì)胞，給藥組分別加入終濃度為1、10、100 μmol/L的生血寧片，37℃ CO2孵箱中培養(yǎng)60 min后再加入20 ng/ml的TNF-α，同時向流動小室底部加0.1 μmol/L的fMLP。37℃反應(yīng)4 h，光學(xué)顯微鏡下行中性白細(xì)胞計數(shù)并拍照。

1.2.4表面黏附分子表達(dá)情況檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測，向中性白細(xì)胞懸液中滴加20 ng/ml的TNF-α，37℃反應(yīng)60 min。給藥組分別加入終濃度為1、10、100 μmol/L的生血寧片，37℃ CO2孵箱中培養(yǎng)60 min，沉降細(xì)胞后用磷酸緩沖液沖洗，重懸細(xì)胞并滴加熒光標(biāo)記的鼠抗人CD11b抗體、鼠抗人CD18抗體、陰性對照抗體，室溫下靜置30 min，上流式細(xì)胞儀檢測熒光強度。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 用SPSS21.0軟件進(jìn)行F檢驗。

2 結(jié) 果

2.1生血寧片對TNF-α誘導(dǎo)的白細(xì)胞黏附的影響 空白對照組、TNF-α組吸光度值分別為(0.026±0.003)、(0.148±0.024)；1、10、100 μmol/L的生血寧片組的吸光度值分別為(0.129±0.034)、(0.093±0.010)、(0.062±0.017)。TNF-α組明顯提升了中性白細(xì)胞活性，黏附能力明顯強于空白對照組(P<0.01)；生血寧片對中性白細(xì)胞黏附能力的抑制呈劑量依賴性，10、100 μmol/L的生血寧片組黏附能力均明顯低于TNF-α組(P<0.05)。

2.2生血寧片對TNF-α誘導(dǎo)的白細(xì)胞跨膜遷移的影響 空白對照組、TNF-α組中性白細(xì)胞游出數(shù)分別為0.51、1.73×106個；1、10、100 μmol/L的生血寧片組分別為1.61、1.45、1.03×106個。TNF-α組中性白細(xì)胞跨膜遷移力明顯強于空白對照組(P<0.01)；生血寧片對中性白細(xì)胞跨膜遷移的影響也呈劑量依賴性，10、100 μmol/L組的白細(xì)胞游出數(shù)均明顯低于TNF-α組(P<0.05)。見圖1。

圖1 Transwell小室檢測結(jié)果(×400)

2.3生血寧片對TNF-α誘導(dǎo)的中性白細(xì)胞黏附分子表達(dá)的影響 空白對照組、TNF-α組CD11b的表達(dá)量分別為(47.25±5.91)、(187.39±12.93)；1、10、100 μmol/L的生血寧片組分別為：(206.86±16.94)、(143.31±9.67)、(91.62±18.35)。CD18的表達(dá)量分別為(97.34±4.05)、(442.91±8.04)；生血寧片組分別為：(428.42±10.30)、(360.91±8.01)、(248.39±12.36)。TNF-α組CD11b和CD18的表達(dá)量均明顯高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；生血寧片對CD11b和CD18的表達(dá)量抑制作用呈劑量依賴性，10、100 μmol/L組的CD11b和CD18的表達(dá)量均明顯低于TNF-α組(P<0.05)。

3 討 論

炎癥反應(yīng)的始發(fā)環(huán)節(jié)包括白細(xì)胞與內(nèi)皮黏附、沿血管壁遷移并滲出到血管外〔4〕，其中白細(xì)胞滲出到血管外后可分泌過氧化物和炎性介質(zhì)參與多種疾病發(fā)展并可引發(fā)組織損傷、多器官功能障礙。目前，臨床治療炎癥相關(guān)疾病的主要思路是對中性白細(xì)胞滲出和黏附過程進(jìn)行有效的干預(yù)抑制〔5〕。本次研究顯示，生血寧片可呈劑量依賴性抑制TNF-α誘導(dǎo)的中性白細(xì)胞黏附能力和跨膜遷移能力。

白細(xì)胞黏附分子CD11b、CD18在介導(dǎo)白細(xì)胞和血管內(nèi)皮黏附、游出過程中發(fā)揮重要作用〔6〕。CD11b、CD18屬于β2整合素家族，能夠與C3bi、CD54等炎癥相關(guān)配體結(jié)合，誘發(fā)白細(xì)胞及內(nèi)皮的黏附，促進(jìn)炎性細(xì)胞趨化性轉(zhuǎn)移、匯聚、吞噬等過程〔7〕。CD11b和CD18在正常生理狀態(tài)下也表達(dá)于白細(xì)胞表面，但受TNF-α等炎癥相關(guān)因子誘導(dǎo)后，中性白細(xì)胞細(xì)胞表面的CD11b和CD18的表達(dá)量明顯增加〔8〕。本次研究通過流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，中性白細(xì)胞經(jīng)TNF-α刺激誘導(dǎo)后炎性黏附分子CD11b和CD18的熒光表達(dá)強度明顯增加，說明生血寧片通過抑制白細(xì)胞表面黏附分子的表達(dá)，進(jìn)而實現(xiàn)對炎性介質(zhì)誘發(fā)的白細(xì)胞黏附、游出過程進(jìn)行抑制，但其中生血寧片對白細(xì)胞黏附分子活化的相關(guān)機制仍需進(jìn)一步研究證實。

1李艷如.老年慢性阻塞性肺疾病患者吸煙與腫瘤壞死因子-α介導(dǎo)全身炎癥反應(yīng)的關(guān)系〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2013;33(17)：4274-6.

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3李淑波，鞠文博，王春梅，等.D-半乳糖肝臟損傷動物模型的建立及其檢測〔J〕.北華大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2015;16(5)：601-4.

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6徐 婷.腎移植術(shù)受者PMNs中CD11b/CD18和MPO的表達(dá)的變化〔D〕.鄭州：鄭州大學(xué)，2011.

7江 波.重組水蛭素對大鼠皮膚撕脫傷中CD11b、CD18及ICAM-1動態(tài)表達(dá)影響的研究〔D〕.瀘州：瀘州醫(yī)學(xué)院，2012.

8Kuo PC，Li YC，Hwang TL,etal.Synthesis and structural characterization of an anti-inflammatory principle purified from Lindera aggregata〔J〕.Tetrahedron Lett，2014;55(1)：108-10.