耿 威 仉慧穎 李 林 陳 巖 邱一凡

(大慶油田總醫(yī)院消化內(nèi)科，黑龍江 大慶 163001)

槲皮素是一種廣泛分布在水果、蔬菜及常見中草藥之中的天然黃酮類化合物〔1〕，可抑制膀胱癌、卵巢癌、結(jié)腸癌等多種惡性癌細(xì)胞增殖〔2～4〕，及肝癌、宮頸癌、乳腺癌等癌細(xì)胞的惡性侵襲〔5～7〕，其作為一種天然的抗腫瘤藥物，已得到廣泛的認(rèn)可〔8〕。Caveolin(Cav)-1是一種位于人染色體7q31.2，編碼22 kD的小凹蛋白，是細(xì)胞膜表面小凹結(jié)構(gòu)的主要成分，在癌癥治療中充當(dāng)著腫瘤抑制因子的角色〔9〕。本文主要研究槲皮素對胃癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響并探討其可能的分子機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 槲皮素購置于美國Sigma 生物公司，用二甲基亞砜(DMSO)配成儲液，-20℃冰箱保存。RPMI-1640培養(yǎng)液來自美國Thermo 公司，胃癌細(xì)胞株(SGC-7901)來自上海生命科學(xué)院生物化學(xué)和細(xì)胞研究所；新生小牛血清來自杭州四季青生物公司，噻唑藍(lán)(MTT)試劑為上海碧云天生物公司產(chǎn)品，Transwell小室為美國康寧公司產(chǎn)品。全自動Western印跡實驗系統(tǒng)，購于美國 Bio-Rad 公司。二喹啉甲酸(BCA)蛋白分析試劑盒購自Pierce公司，基底膜膠(Matrigel)購自BD公司，Cav-1 單克隆抗體購于Bioworld 公司。β-actin 鼠源性單克隆抗體購自 Sigma公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 將SGC-7901細(xì)胞置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)，培養(yǎng)在RPMI-1640培養(yǎng)液(含10%新生牛血清、青霉素100 U/ml和鏈霉素100 μg/ml)中。待細(xì)胞至對數(shù)生長期后收集，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個/ml，按每孔100 μl接種到96孔板中培養(yǎng)24 h。

1.3細(xì)胞增殖實驗 采用MTT比色法。將上述培養(yǎng)的細(xì)胞隨機分為5組，分別加入終濃度為20、40、60、80及100 μmol/ml的槲皮素，每組設(shè)置3個復(fù)孔，以不含槲皮素的細(xì)胞作為對照組，以空白孔調(diào)零，分別培養(yǎng)24、48、72 h，每孔加入MTT 100 μl作用4 h，加入DMSO 100 μl孵育30 min，在酶標(biāo)儀570 nm處測吸光度A值，按公式計算細(xì)胞增殖抑制率：抑制率(%)=〔( A對照組-A實驗組)/(A對照組-A空白組)〕×100%。

1.4細(xì)胞侵襲實驗 采用Transwell小室法。分別用不含血清的 RPMI-1640培養(yǎng)基重懸實驗組及對照組細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液。將單細(xì)胞懸浮液調(diào)制濃度為約2×105個/ml，將各處理組細(xì)胞用胰酶消化并接種于25 μl Matrigel包被的Transwell小室中。上室加200 μl細(xì)胞懸液，下室加500 μl含10%血清的培養(yǎng)基作為趨化因子，培養(yǎng)24 h后取出小室，4′6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色，熒光顯微鏡下觀察并記錄，每孔隨機選取10個200倍視野，計數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.5Western印跡法檢測Cav-1蛋白的表達(dá)情況 將培養(yǎng)了24 h后的細(xì)胞分成3組，提取每組的蛋白樣品，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，并在含8%的脫脂牛奶的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液(TBS)-吐溫(T)中室溫封閉2～4 h。孵育一抗，自封袋封閉4℃過夜，室溫下用TBS-T搖床洗膜：15 min ×1次和5 min×3次。孵育二抗，室溫下封閉1～2 h，室溫下用TBS-T搖床洗膜15 min ×1次和5 min×4次。加入化學(xué)發(fā)光液、顯影、定影，并保存膠片。將膠片進(jìn)行掃描，用IPP6.0軟件測定印跡區(qū)帶的光密度值。以β-actin 為內(nèi)參照，分析數(shù)據(jù)。蛋白表達(dá)強度=樣品中目的蛋白光密度值/相應(yīng)β-actin 的光密度值。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1槲皮素對胃癌細(xì)胞增殖能力的影響 隨著藥物濃度的遞增，24 h時，槲皮素對 SGC-7901的IC50為70.3 μmol/L；48 h時，IC50為41.6 μmol/L；72 h時，IC50為30.2 μmol/L。隨著槲皮素濃度的增加，其對胃癌細(xì)胞SGC-7901的抑制顯著增強(P<0.05)，且抑制能力隨時間的增加而顯著增大(P<0.05)。見表1。

表1 槲皮素作用 24、48、72 h對SGC-7901 的增殖抑制率

與同時間對照組比較：1)P<0.05；與同濃度24 h比較：2)P<0.05;與同濃度48 h比較：3)P<0.05；與同時間前一濃度比較：4)P<0.05

2.2槲皮素對胃癌細(xì)胞侵襲能力及Cav-1蛋白表達(dá)的影響 槲皮素各濃度組胃癌細(xì)胞侵襲數(shù)量與對照組比較明顯減少(P<0.05)，并且隨著槲皮素濃度的增大，胃癌細(xì)胞侵襲的細(xì)胞數(shù)量越來越少(P<0.05)。24 h后,槲皮素各濃度組Cav-1蛋白表達(dá)明顯低于對照組，且槲皮素的濃度越高，Cav-1 蛋白表達(dá)顯著降低。見表2，圖1。

表2 槲皮素對胃癌細(xì)胞侵襲數(shù)量及Cav-1蛋白表達(dá)的影響

與對照組比較：1)P<0.05;與前一濃度比較：2)P<0.05

圖1 各組Cav-1 蛋白表達(dá)情況

3 討 論

胃癌細(xì)胞的增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移是大多數(shù)胃癌患者的死亡原因?？鼓[瘤藥物槲皮素對胃癌的研究主要集中在對胃癌細(xì)胞增殖及機制的探討〔10，11〕，對胃癌細(xì)胞生長及凋亡的研究〔8，12，13〕，但是對胃癌細(xì)胞侵襲的研究較少〔14〕。本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲能力和Cav-1的表達(dá)情況均與槲皮素的濃度呈現(xiàn)依賴性。

Cav-1為支架蛋白，直接作用于受體、激酶、黏附分子和 G-蛋白等信號分子，并可以控制亞細(xì)胞的分布和激活狀態(tài)。參與了小泡運輸、膽固醇動態(tài)平衡、大分子的內(nèi)吞和調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及細(xì)胞內(nèi)鈣濃度等許多重要的細(xì)胞活動過程，Cav-1蛋白鏈N端的腳手架區(qū)域可通過識別特定的序列，與多種信號分子結(jié)合并調(diào)節(jié)其活性，如受體酪氨酸激酶等，影響多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，進(jìn)而參與了細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化、增殖、侵襲等眾多惡性生物學(xué)行為。研究發(fā)現(xiàn)Cav-1的表達(dá)在不同腫瘤，同一腫瘤不同亞型或同一腫瘤發(fā)展的不同階段均是不同的〔9，15〕。

綜上，槲皮素可抑制胃癌細(xì)胞增殖和侵襲，其機制可能與Cav-1 蛋白的表達(dá)有關(guān)，然而，也有研究發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞的增殖與抑制端粒酶活性有關(guān)〔16〕，胃癌細(xì)胞侵襲與下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2基因表達(dá)有關(guān)〔14〕，胃癌組織中Cav-1的低表達(dá)可能促進(jìn)了胃癌的侵襲〔17〕。所以，槲皮素對胃癌細(xì)胞影響的具體內(nèi)在作用機制值得深入研究。

1Gormaz JG,Quintremil S,Rodrigo R.Cardiovascular disease:a target for the pharmacological effects of quercetin〔J〕.Curr Top Med Chem,2015;15(17):1735-42.

2陳松寧,吳肖萍,陳景林,等.槲皮素及其7-OH 衍生物對膀胱癌細(xì)胞增殖抑制作用及細(xì)胞周期的影響〔J〕.嶺南現(xiàn)代臨床外科雜志,2016;16(2):204-9.

3周學(xué)敏.槲皮素對人卵巢癌細(xì)胞-3增殖和凋亡的影響〔J〕.中醫(yī)學(xué)報,2016;31(7):931-6.

4王 芬,熊 玲.槲皮素對結(jié)腸癌 SW480 細(xì)胞增殖及蛋白表達(dá)的影響〔J〕.醫(yī)學(xué)綜述,2015;21(16):3011-3.

5劉 鋒,李 剛,胡明道,等.槲皮素對人肝癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞生長及侵襲能力的影響〔J〕.昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2014;35(5):29-32.

6朱勤勤,唐文勛,儲 俊,等.槲皮素對宮頸癌細(xì)胞增殖,凋亡及侵襲影響的實驗研究〔J〕.健康導(dǎo)報:醫(yī)學(xué)版,2015;20(3):190.

7Tao SF,He HF,Chen Q.Quercetin inhibits proliferation and invasion acts by up-regulating miR-146a in human breast cancer cells〔J〕.Mol Cell Biochem,2015;402(1-2):93-100.

8Shen X,Si Y,Wang Z,etal.Quercetin inhibits the growth of human gastric cancer stem cells by inducing mitochondrial-dependent apoptosis through the inhibition of PI3K/Akt signaling〔J〕.Int J Mol Med,2016;38(2):619-26.

9郭艷麗.近端胃癌中Caveolin-1 基因的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機制及其對表皮生長因子受體2活化的影響〔D〕.石家莊：河北醫(yī)科大學(xué),2016.

10陳 洪.槲皮素抑制SGC-7901細(xì)胞增殖及相關(guān)機制的研究〔D〕.廣州：廣東藥科大學(xué),2016.

11王海燕,郭良淼,陳 勇,等.槲皮素抑制人胃癌 MGC-803 細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡的研究〔J〕.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2006；22(5):585-7.

12Wang P,Zhang K,Zhang Q,etal.Effects of quercetin on the apoptosis of the human gastric carcinoma cells〔J〕.Toxicol In Vitro,2012;26(2):221-8.

13Zhang JY,Lin MT,Zhou MJ,etal.Combinational treatment of curcumin and quercetin against gastric cancer MGC-803 cells in vitro〔J〕.Molecules,2015;20(6):11524-34.

14王曉燕,張尤歷,張 恒,等.槲皮素對人胃癌細(xì)胞侵襲和MMP-2表達(dá)的影響〔J〕.世界華人消化雜志,2012;20(3):215-8.

15姜善元.槲皮素對胃癌SGC細(xì)胞生長及小凹蛋白-1表達(dá)的影響〔D〕.泰安：泰山醫(yī)學(xué)院,2013.

16魏金文,范 鈺,張尤歷,等.槲皮素對胃癌細(xì)胞增殖的影響及機制探討〔J〕.山東醫(yī)藥,2007;47(35):14-6.

17唐 雷.Caveolin-1在胃癌中的表達(dá)及其臨床意義〔J〕.中外醫(yī)療,2016;35(5):52-4.