唐小雪 周 政 王 洋 高 蕓 李 琦

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院口腔科，新疆 石河子 832008)

牙髓組織具有很強(qiáng)的自我修復(fù)能力，當(dāng)受到外界損傷刺激時(shí)發(fā)揮自我更新作用。牙齒受到輕微刺激如磨耗等會(huì)促進(jìn)成牙本質(zhì)細(xì)胞生成反應(yīng)性牙本質(zhì)，但受到嚴(yán)重的刺激時(shí)誘導(dǎo)牙髓周圍的成牙本質(zhì)細(xì)胞凋亡〔1，2〕。目前普遍認(rèn)為，牙髓細(xì)胞中未分化的干細(xì)胞或者祖細(xì)胞可分化形成成牙本質(zhì)細(xì)胞，修復(fù)損傷部位，形成修復(fù)性牙本質(zhì)〔3〕。牙髓細(xì)胞由成纖維細(xì)胞、分化程度不等的祖細(xì)胞等組成。牙髓細(xì)胞分化形成成牙本質(zhì)細(xì)胞的過程不是由某一種細(xì)胞分化形成，而是由不同分化能力的祖細(xì)胞群共同形成的〔4〕。既往研究表明，可通過構(gòu)建體外誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化模型，研究牙髓細(xì)胞分化機(jī)制，為牙齒修復(fù)性研究提供更多的理論依據(jù)〔5〕。Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Runx)2在成骨細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞分化、成熟過程中起關(guān)鍵性作用。研究表明，Runx2通過調(diào)控成骨和成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的相關(guān)基因的表達(dá)，參與成骨和成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化過程〔6〕。本實(shí)驗(yàn)擬研究過表達(dá)Runx2基因?qū)Τ裳辣举|(zhì)細(xì)胞分化相關(guān)基因表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備 高糖型DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清，購自美國GIBCO公司，堿性磷酸酶(ALP)活性測(cè)定試劑盒購自南京建成生物工程研究所，TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒，購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司，Runx2抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗均購自美國CST公司，酶標(biāo)儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司，實(shí)時(shí)定量PCR儀購自美國AB公司，凝膠成像系統(tǒng)購自德國Royal Intas Gel Hood Imager公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及成牙分化誘導(dǎo) 收集12～15歲因正畸而拔除的健康前磨牙，收集前均已征得患者及家屬的同意。采用無菌眼科鑷取出完整的牙髓組織，經(jīng)酶消化后，置于原代細(xì)胞培養(yǎng)基中，在5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3 d更換1次培養(yǎng)基，使用2.5%胰酶消化貼壁細(xì)胞進(jìn)行傳代，第4代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

取第4代牙髓細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到約90%時(shí)，培養(yǎng)基更換為礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)基(每100 ml誘導(dǎo)培養(yǎng)基含有1 μmol β-磷酸甘油鈉、10-6μmol地塞米松和5 mg抗壞血酸)，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，收集0、7、14 d的各組細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3測(cè)定ALP的活性 提取0、7、14 d細(xì)胞中的總蛋白，取15 μl蛋白樣品、100 μl混合液加入96孔板中，輕輕振蕩混勻，37℃水浴鍋中反應(yīng)15 min，每孔加入150 μl顯色劑，置于酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔在520 nm波長的吸光值(OD520 nm)，計(jì)算各組ALP的活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每孔4個(gè)復(fù)孔。

1.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染 收集牙髓細(xì)胞，按2×104個(gè)/孔接種到6孔板上，在37℃培養(yǎng)箱中孵育24 h，根據(jù)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行操作，將細(xì)胞隨機(jī)分為2組，陰性對(duì)照組中加入pcDNA3.1空載質(zhì)粒，pcDNA3.1-Runx2組中加入pcDNA3.1-Runx2質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，將培養(yǎng)基更換為礦化誘導(dǎo)液，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d和14 d進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western印跡)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中Runx2蛋白的表達(dá)量 收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，加入200 μl細(xì)胞蛋白裂解液，置于冰上裂解15 min，提取細(xì)胞中總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度，95℃加熱5 min。配置10%的分離膠和5%的濃縮膠，加入電泳液。55 V電泳40 min，調(diào)整電壓至120 V繼續(xù)電泳90 min。將所得蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。將PVDF膜放入5%脫脂牛奶中封閉1 h，加入適量濃度的一抗，4℃孵育過夜，TBS/T漂洗3次×10 min，加入HRP標(biāo)記的二抗，37℃孵育1 h，TBS/T漂洗3次×10 min，避光加入電光化學(xué)發(fā)光法(ECL)反應(yīng)液，曝光，顯影、定影，凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白水平。

1.6實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)牙髓細(xì)胞中分化相關(guān)基因的表達(dá) 利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)牙本質(zhì)涎磷蛋白(DSPP)、骨涎蛋白(BSP)基因的引物序列，DSPP上游序列為5′-CCATTCCCACGGACTCCCA-3′，下游序列為5′-TGGCGATGCAGGTCACAAT-3′；BSP游序列為5′-CAAGCATGCCTACTTTTATCCTC-3′，下游序列為5′-CTTCTTGGGAAGCTGGATTG-3′。轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)礦化誘導(dǎo)液培養(yǎng)后，加入1 ml TRIzol細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞中的總RNA，去除基因組DNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，GAPDH為參照，進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為預(yù)變性94℃ 10 min，94℃ 10 s，58℃/60℃ 15 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。使用2-ΔΔCt方法計(jì)算DSPP、BSP mRNA表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，兩樣本差異使用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化過程中ALP活性的變化 牙髓細(xì)胞經(jīng)礦化誘導(dǎo)，與0 d〔(1.456±0.068)U/g〕相比，在分化誘導(dǎo)的第7和14天，細(xì)胞中ALP的活性顯著升高〔(10.659±1.526)U/g,(21.863±3.568)U/g〕(P<0.05)，且ALP的活性在分化誘導(dǎo)的第14天較第7天顯著升高(P<0.05)，表明牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化模型構(gòu)建成功。

2.2轉(zhuǎn)染過表達(dá)載體對(duì)細(xì)胞中Runx2蛋白表達(dá)量的影響 牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化過程中，Runx2的表達(dá)量逐漸增加；與陰性對(duì)照組相比，在分化誘導(dǎo)的第7和14天，pcDNA3.1-Runx2組細(xì)胞中Runx2的含量顯著升高(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 轉(zhuǎn)染過表達(dá)載體對(duì)細(xì)胞中Runx2蛋白表達(dá)量的影響

與陰性對(duì)照組相比：1)P<0.05；下表同

1：陰性對(duì)照組；2：pcDNA3.1-Runx2組圖1 轉(zhuǎn)染過表達(dá)載體對(duì)細(xì)胞中Runx2蛋白表達(dá)量的影響

2.3Runx2過表達(dá)對(duì)牙髓細(xì)胞分化相關(guān)基因水平的影響 牙髓細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞中DSPP mRNA和BSP mRNA在0 d差異不顯著，在分化誘導(dǎo)的第7和14天，細(xì)胞中DSPP mRNA(P<0.05)和BSP mRNA(P<0.05)水平均顯著高于陰性對(duì)照組。見表2，表3。

表2 Runx2過表達(dá)對(duì)牙髓細(xì)胞中DSPP mRNA表達(dá)的影響

表3 Runx2過表達(dá)對(duì)牙髓細(xì)胞中BSP mRNA表達(dá)的影響

3 討 論

牙髓組織可形成牙本質(zhì)，對(duì)牙齒的修復(fù)、營養(yǎng)、防御具有重要作用。牙髓組織主要由牙髓細(xì)胞組成，參與牙齒損傷修復(fù)過程。牙髓細(xì)胞是一種混合型細(xì)胞，在成牙分化過程中起主要作用的是祖細(xì)胞群。研究證實(shí)，體外誘導(dǎo)成牙分化過程與體內(nèi)成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化過程極為相似，因此可通過體外構(gòu)建牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化模型，研究成牙分化的相關(guān)機(jī)制〔5〕。ALP是反映牙齒礦化的關(guān)鍵性酶，對(duì)牙髓細(xì)胞的分化過程起重要作用〔7〕。在牙髓細(xì)胞分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞的過程中，ALP的活性逐漸增強(qiáng)〔8〕。研究表明，ALP是重要的早期成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的相關(guān)標(biāo)志〔9〕。在本實(shí)驗(yàn)中，ALP在牙髓細(xì)胞誘導(dǎo)的過程中活性逐漸升高，與前人研究結(jié)果一致，說明體外誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化模型構(gòu)建成功。

Runx2是Runt基因家族的重要成員之一，在成牙分化和成骨細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮重要作用。研究報(bào)道顯示，在成牙本質(zhì)細(xì)胞分化過程中，Runx2的表達(dá)量逐漸增加，說明Runx2參與成牙分化的形成過程〔10〕。目前，Runx2在牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化過程中的作用的相關(guān)報(bào)道較少。DSPP是一種牙齒發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用的機(jī)制蛋白〔11〕。研究表明，DSPP可作為成牙本質(zhì)細(xì)胞分化過程的重要指標(biāo)，其表達(dá)量一定程度反映牙髓細(xì)胞分化能力〔12〕。有文獻(xiàn)報(bào)道，Runx2能夠通過促進(jìn)DSPP基因的表達(dá)，從而促進(jìn)牙髓細(xì)胞向成牙分化的過程〔13，14〕。BSP是細(xì)胞外基質(zhì)中的磷酸化硫化性糖蛋白，在成骨細(xì)胞分化、牙髓細(xì)胞礦化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用〔15-16〕。BSP被認(rèn)為是成牙本質(zhì)細(xì)胞分化過程的標(biāo)志基因〔17〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Runx2參與調(diào)控牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化過程。過表達(dá)載體進(jìn)一步增加Runx2的表達(dá)量。過表達(dá)Runx2基因可增加DSPP、BSP的表達(dá)，提示Runx2的表達(dá)量增加促進(jìn)牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化。

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