房新輝 楊玉秀 王長(zhǎng)武 郭軍輝

(河南省人民醫(yī)院 鄭州大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科,河南 鄭州 450002)

我國(guó)是肝癌發(fā)病率較高的國(guó)家，據(jù)相關(guān)研究報(bào)道〔1〕，在2005年～2007年，我國(guó)男性肝癌發(fā)病率在所有惡性腫瘤中排名第三，女性肝癌發(fā)病率在所有惡性腫瘤中排名第五，且肝癌的病死率極高，因此探究肝癌的相關(guān)發(fā)病機(jī)制和尋找新的治療切入點(diǎn)成為目前醫(yī)療工作者研究的重點(diǎn)。腫瘤免疫治療的核心思路就是增強(qiáng)患者的免疫功能，通過(guò)自身的免疫系統(tǒng)來(lái)治療疾病，但肝癌患者體內(nèi)的免疫微環(huán)境受到較嚴(yán)重的破壞，這對(duì)肝癌的免疫治療帶來(lái)了阻礙〔2,3〕。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)是一類可以調(diào)控體內(nèi)自身免疫反應(yīng)的T細(xì)胞亞群，其數(shù)量的變化和功能的異常均會(huì)對(duì)免疫功能造成影響，CD4+CD25+Treg細(xì)胞是Treg細(xì)胞研究較多的一個(gè)類型，CD4+CD25+Treg細(xì)胞在肝癌患者中表達(dá)異常，且對(duì)免疫功能有抑制作用〔4,5〕。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)是一組能調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的因子，能抑制T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的增殖〔6〕。本研究旨在探討肝癌大鼠肝組織中CD4+CD25+Treg細(xì)胞及TGF-β1的表達(dá)情況及其相關(guān)性，以期為肝癌的免疫微環(huán)境研究提供參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取無(wú)特定病原體的Wistar大鼠60只，均為雄性，體重178～216 g，平均(194.6±8.7)g，飼養(yǎng)環(huán)境溫度在20℃，濕度58%左右，每天給予12 h光照，分籠喂養(yǎng)，每籠10只，正常喂養(yǎng)10 d。實(shí)驗(yàn)大鼠購(gòu)于南京君科生物工程有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器和藥品 二乙基亞硝胺(Sigma公司，美國(guó))，單色熒光抗體CD4-FITC、CD25-PE(BD公司，美國(guó))，鏈霉親和素-生物素復(fù)合物法(SABC)免疫組化試劑盒、TGF-β1山羊抗鼠一抗、兔抗山羊二抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(湖北武漢博士德生物工程有限公司)，胚牛血清(BSA)溶液、淋巴細(xì)胞分離液、流式細(xì)胞儀(上海優(yōu)寧維生物科技公司)。

1.3分組方法及動(dòng)物模型 正常喂養(yǎng)10 d后按隨機(jī)數(shù)字表法將60只大鼠隨機(jī)均分為三組，分別為肝癌組(20只)、生理鹽水對(duì)照組(20只)、正常對(duì)照組(20只)。其中肝癌組大鼠每周腹腔注射一次100 mg/kg的二乙基亞硝胺，連續(xù)注射8次〔7〕；生理鹽水對(duì)照組大鼠每周腹腔注射一次100 mg/kg的生理鹽水，連續(xù)注射8次；正常對(duì)照組正常喂養(yǎng)，不做任何特殊處理。

1.4CD4+CD25+Treg細(xì)胞水平測(cè)定 在建模結(jié)束后將所有大鼠處死，取其部分肝組織，剪碎后加入磷酸鹽緩沖液(PBS)，2 600 r/min離心15 min，取其上層清液。加入3 ml淋巴細(xì)胞分離液，2 000 r/min離心12 min，加入4 ml PBS緩沖液，1 000 r/min離心5 min。取出100 μl肝細(xì)胞懸液，滴加單色熒光抗體CD4-FITC、CD25-PE，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析CD4+CD25+Treg細(xì)胞水平。

1.5TGF-β1水平測(cè)定 采用免疫組化SABC法測(cè)定TGF-β1水平，取部分肝組織，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，將組織標(biāo)本浸泡在二甲苯中20 min進(jìn)行脫蠟處理，用無(wú)水乙醇沖洗后用蒸餾水沖洗。將切片置于10 mmol/L檸檬酸緩沖液中，用醫(yī)用微波爐煮20 min，置于室溫中自然冷卻20 min，PBS沖洗。滴加5%BSA溶液，靜置15 min，將多余的溶液甩掉，滴加50 μl一抗，37℃靜置2 h，蒸餾水沖洗，PBS沖洗，甩干，滴加50 μl二抗，37℃靜置20 min。蒸餾水沖洗，甩干，滴加50 μl SABC溶液，37℃靜置20 min。蒸餾水沖洗，甩干，滴加適量DAB溶液，以鋪滿切片表面為宜，室溫下靜置5 min，后將組織標(biāo)本浸入蘇木素溶液中復(fù)染10 min，置入95%乙醇溶液浸泡5 min，置入無(wú)水乙醇浸泡5 min，重復(fù)兩次，再放入二甲苯的溶液中，浸泡5 min，滴加少量中性樹(shù)膠，封片晾干。采用Mias-2000病理圖分析系統(tǒng)分析，在400倍顯微鏡下觀察，細(xì)胞漿或細(xì)胞膜為棕黃色則可判定為陽(yáng)性細(xì)胞，采用灰度值來(lái)衡量染色強(qiáng)度，灰度值越小代表染色強(qiáng)度越深，提示陽(yáng)性表達(dá)越強(qiáng)，任意取10個(gè)區(qū)域計(jì)算陽(yáng)性灰度值，最后結(jié)果取其平均值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，采用 Spearman相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1三組大鼠建模情況 正常對(duì)照組大鼠處死前各項(xiàng)生命體征均表現(xiàn)正常，無(wú)異常死亡。生理鹽水組大鼠處死前毛發(fā)光澤較差，精神狀態(tài)較差，運(yùn)動(dòng)較少，食欲一般，對(duì)外界刺激反應(yīng)較慢，無(wú)異常死亡。肝癌組大鼠處死前毛發(fā)雜亂無(wú)光澤，精神萎靡，極少運(yùn)動(dòng)，食欲不振，對(duì)外界刺激反應(yīng)極慢，5只大鼠異常死亡。

2.2三組大鼠的CD4+CD25+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例和TGF-β1表達(dá)水平對(duì)比 三組大鼠的CD4+CD25+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例和TGF-β1表達(dá)水平整體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；肝癌組大鼠的CD4+CD25+Treg細(xì)胞占比顯著高于正常對(duì)照組和生理鹽水對(duì)照組，TGF-β1灰度值顯著低于正常對(duì)照組和生理鹽水對(duì)照組(均P<0.05)；生理鹽水組的TGF-β1灰度值顯著低于正常對(duì)照組(P<0.05)，但CD4+CD25+Treg細(xì)胞占比與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 三組大鼠的CD4+CD25+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例和TGF-β1表達(dá)水平對(duì)比

與正常對(duì)照組比較：1)P<0.05；與生理鹽水對(duì)照組比較：2)P<0.05

2.3肝癌組大鼠CD4+CD25+Treg細(xì)胞和TGF-β1相關(guān)性分析 肝癌組大鼠CD4+CD25+Treg細(xì)胞和TGF-β1表達(dá)水平呈明顯的正相關(guān)(r=0.823，P=0.000)。

3 討 論

肝癌可分為繼發(fā)性肝癌和原發(fā)性肝癌，繼發(fā)性肝癌又稱轉(zhuǎn)移性肝癌，系指全身多個(gè)器官起源的惡性腫瘤侵犯、轉(zhuǎn)移至肝臟。原發(fā)性肝癌較為多見(jiàn)，系指惡性腫瘤起源于肝臟的上皮或間葉組織〔8〕。目前原發(fā)性肝癌的發(fā)病機(jī)制尚不明確，其危險(xiǎn)因素主要有乙肝病毒感染、肝硬化、家族癌癥史、酗酒、不良的飲食習(xí)慣等〔9〕。肝癌患者的免疫微環(huán)境主要由肝癌細(xì)胞周?chē)牧馨图?xì)胞、成纖維細(xì)胞、免疫細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞等構(gòu)成，當(dāng)免疫微環(huán)境正常時(shí)能對(duì)腫瘤細(xì)胞形成較大的殺傷力，能逐漸改善患者的各項(xiàng)生命體征，但肝癌患者體內(nèi)存在較強(qiáng)的免疫微環(huán)境抑制，主要是腫瘤細(xì)胞為順應(yīng)其生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，通過(guò)分泌免疫抑制因子來(lái)破壞免疫微環(huán)境，當(dāng)免疫微環(huán)境受到抑制時(shí)腫瘤細(xì)胞獲得較好的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移條件，進(jìn)而使得病情惡化〔10〕。有研究指出〔11〕，采用肝動(dòng)脈栓塞化學(xué)治療聯(lián)合免疫治療能有效地提高患者的免疫功能，降低血清腫瘤相關(guān)指標(biāo)水平，提高生存率，由此可見(jiàn)從免疫微環(huán)境切入治療肝癌是值得探索的。

CD4+CD25+Treg細(xì)胞是一類主要由胸腺產(chǎn)生的細(xì)胞群，主要表達(dá)為CD4分子、CD25分子和叉頭蛋白3(Foxp3)。有研究報(bào)道〔12〕，將正常小鼠體內(nèi)的CD4+CD25+Treg去除會(huì)導(dǎo)致多種自身免疫性疾病，而將其回輸則可避免免疫性疾病的發(fā)生，從而證明該細(xì)胞群具備免疫調(diào)節(jié)能力。CD4+CD25+Treg細(xì)胞可抑制自身免疫反應(yīng)，在正常人體內(nèi)能通過(guò)其免疫抑制調(diào)節(jié)功能來(lái)防止免疫反應(yīng)擴(kuò)大和過(guò)度免疫反應(yīng)，從而維持正常的免疫功能，避免發(fā)生免疫性疾病，在機(jī)體出現(xiàn)微生物感染、過(guò)敏反應(yīng)時(shí)CD4+CD25+Treg細(xì)胞都可以起到重要的免疫調(diào)節(jié)作用。有研究表明〔13〕，正常情況CD4+CD25+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例在5%～10%的范圍內(nèi)，但在肝癌患者中其占比明顯上升，可能直接或間接促進(jìn)了腫瘤的發(fā)展。本研究說(shuō)明CD4+CD25+Treg細(xì)胞在肝癌大鼠病理組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，這提示高表達(dá)的CD4+CD25+Treg細(xì)胞可能會(huì)對(duì)免疫微環(huán)境產(chǎn)生負(fù)面的影響，過(guò)度抑制免疫反應(yīng)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞獲得更好的生存條件。CD4+CD25+Treg細(xì)胞對(duì)免疫反應(yīng)的抑制機(jī)制可有以下幾點(diǎn)〔14〕：①通過(guò)分泌白細(xì)胞介素(IL)10、TGF-β等因子來(lái)對(duì)免疫功能進(jìn)行調(diào)節(jié)；②通過(guò)釋放顆粒酶和穿孔素對(duì)效應(yīng)細(xì)胞形成殺傷；③以半乳糖凝集素為媒介與T細(xì)胞表面的糖蛋白受體發(fā)生反應(yīng)，從而減少T細(xì)胞分泌IL-2 和γ干擾素；④Foxp3和T細(xì)胞發(fā)生作用，抑制效應(yīng)T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的活性。本次研究提示TGF-β1在肝癌大鼠肝癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)。TGF-β1具有抑制T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的增殖的作用，從而對(duì)機(jī)體的免疫功能產(chǎn)生抑制，此外，TGF-β1還能誘導(dǎo)Foxp3表達(dá)，使得部分CD4+CD25+初始T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD4+CD25+Treg細(xì)胞，進(jìn)一步增加肝癌中CD4+CD25+Treg細(xì)胞水平，而CD4+CD25+Treg細(xì)胞又可分泌TGF-β1，進(jìn)而導(dǎo)致兩者數(shù)量相互促進(jìn)〔15〕。本研究顯示兩者呈正相關(guān)也印證了這一點(diǎn)。

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