李佳麗 趙瑞力

作者單位：050011 石家莊，河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心；050011石家莊，河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科

干細(xì)胞是一類能夠自我復(fù)制、自我更新，具有多向分化潛能，能產(chǎn)生多種分化細(xì)胞類型的細(xì)胞，主要包括骨髓干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESCs）和誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞（iPS）等[1-2]。目前骨髓干細(xì)胞已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于血液系統(tǒng)疾病的臨床移植治療中。ESCs和iPS是多能干細(xì)胞，能夠分化成除胎盤外的所有組織，已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于疾病機(jī)制、藥物毒性和細(xì)胞移植治療研究中[3-4]。骨髓干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞和ESCs均為異體來源細(xì)胞，移植后存在免疫排異的風(fēng)險(xiǎn)。iPS可以來自人體的任何組織，利用自體iPS來源的組織細(xì)胞進(jìn)行移植，避免了移植后免疫排斥的問題，近年來引起醫(yī)學(xué)科研人員的高度重視[3]。

甲狀旁腺功能減退是由于甲狀旁腺素（PTH）分泌不足導(dǎo)致的以低鈣血癥和高磷血癥為特征的內(nèi)分泌疾病。由于甲狀旁腺位置比較隱蔽，手術(shù)過程中很難做到對(duì)其進(jìn)行識(shí)別和保護(hù)，導(dǎo)致術(shù)后一過性或持續(xù)性甲狀旁腺功能減退患者越來越多。對(duì)于甲狀旁腺功能減退的治療方案主要包括補(bǔ)充高劑量的維生素D和鈣劑、PTH替代治療和甲狀旁腺自體或異體移植，這些方案都不能從根本上治療該疾病[5-8]。鑒于干細(xì)胞技術(shù)的進(jìn)步及在醫(yī)學(xué)科研中取得的成績(jī)，尤其是干細(xì)胞技術(shù)在糖尿病機(jī)制研究和細(xì)胞移植治療研究中的進(jìn)展[9]，考慮內(nèi)分泌系統(tǒng)的另一類疾病甲狀旁腺功能減退可能同樣適用干細(xì)胞進(jìn)行治療。甲狀旁腺發(fā)揮作用的機(jī)制是，通過細(xì)胞表面鈣離子受體（CaSR）監(jiān)測(cè)血漿中Ca2+濃度，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)合成的PTH向周圍環(huán)境的釋放，因此甲狀旁腺細(xì)胞僅需進(jìn)入體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)就能發(fā)揮作用，而不需重建甲狀旁腺的組織結(jié)構(gòu)，基于此特點(diǎn)，甲狀旁腺功能減退患者更適合應(yīng)用細(xì)胞移植治療。

人類有兩對(duì)甲狀旁腺，上面的一對(duì)起源于第四咽囊的內(nèi)胚層，下面的一對(duì)起源于由第三咽囊內(nèi)胚層和神經(jīng)嵴細(xì)胞形成的甲狀旁腺胸腺原基[10]。在甲狀旁腺的發(fā)育過程中，首先是祖細(xì)胞形成，祖細(xì)胞穿過原條形成定性內(nèi)胚層，定性內(nèi)胚層形成以后的甲狀旁腺和胸腺，此階段的細(xì)胞表達(dá)內(nèi)胚層的特異性標(biāo)記物Hoxa3、 Pax1、Eya1和Pax9。第二階段是甲狀旁腺胸腺原基形成，此階段的細(xì)胞表達(dá)Six1和Pbx1。第三階段是甲狀旁腺和胸腺的成型，Sonic hedgehog（Shh）是一個(gè)分泌型糖蛋白，在此階段發(fā)揮重要作用[11]。接下來甲狀旁腺和胸腺分離，甲狀旁腺細(xì)胞表達(dá)特異性因子GCM2、CaSR和PTH，胸腺細(xì)胞表達(dá)特異性因子Foxn1。

WNT和TGFβ信號(hào)通路能夠阻止原條和定性內(nèi)胚層的形成[12-13]。Nodal是TGFβ亞家族成員，高水平Nodal能夠促進(jìn)定性內(nèi)胚層形成[14]，高活性的Nodal蛋白不容易獲得。Activin能夠結(jié)合和Nodal相同的受體[15]，因此被用來體外模擬Nodal活性，高濃度的Activin 和低濃度的血清能夠促進(jìn)原條和定性內(nèi)胚層的分化[16-17]。

建立在甲狀旁腺發(fā)育的分子基礎(chǔ)上，干細(xì)胞向甲狀旁腺細(xì)胞的分化需在兩個(gè)階段進(jìn)行干預(yù)，即干細(xì)胞向定性內(nèi)胚層的分化和定性內(nèi)胚層向甲狀旁腺細(xì)胞的分化。目前干細(xì)胞向甲狀旁腺細(xì)胞的分化被詳細(xì)報(bào)道的有：ESCs、胸腺上皮細(xì)胞和扁桃體間充質(zhì)細(xì)胞。

一、ESCs

美國(guó)密歇根大學(xué)Doherty教授團(tuán)隊(duì)分別采用兩株ESCs株BG01和H1進(jìn)行向甲狀旁腺細(xì)胞的分化[18-19]。首先采用D'Amour分化法[20]進(jìn)行分化，即將BG 01/H1細(xì)胞株接種在鋪有小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)板中，在RPMI1640培養(yǎng)基中加入100 ng/ml Activin A和遞增濃度的小牛血清（FBS），分化的第一個(gè)24 h FBS濃度為0﹪，第二個(gè)24 h FBS濃度為0.2﹪，接下來以2.0﹪的FBS濃度維持培養(yǎng)3 d，此階段為誘導(dǎo)ESCs向定性內(nèi)胚層的分化。接下來進(jìn)行定性內(nèi)胚層向甲狀旁腺細(xì)胞的分化[18]，收集分化5 d的細(xì)胞，重新接種于未鋪過小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的組織培養(yǎng)板中，使用含 100 ng/ml Activin A、5﹪ 的 FBS和 100 ng/ml Shh的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d。結(jié)果顯示分化5 d的細(xì)胞表達(dá)定性內(nèi)胚層標(biāo)志物FoxA2和Sox17，輕度表達(dá)甲狀旁腺分化的標(biāo)志物Eya1、BMP4和noggin，不表達(dá)成熟甲狀旁腺的特異性標(biāo)志物CaSR、CCL21、GCM2和PTH；分化12 d的細(xì)胞除表達(dá)定性內(nèi)胚層標(biāo)志物外，還表達(dá)胸腺甲狀旁腺原基特異性標(biāo)記物Hoxa3、Pax1和Six1，和甲狀旁腺細(xì)胞特異性標(biāo)記物。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在分化的第一階段，加入成型因子Shh能夠使分化5 d的細(xì)胞輕度表達(dá)甲狀旁腺特異性標(biāo)志物GCM2，第二分化階段中Shh的加入能夠使分化中的細(xì)胞更早更多的表達(dá)甲狀旁腺特異性標(biāo)記物CaSR和PTH。說明100 ng/ml Activin A和遞增濃度的FBS能夠完成ESCs向定性內(nèi)胚層的分化，Shh的加入能夠促使ESCs向甲狀旁腺細(xì)胞的分化。

二、胸腺上皮細(xì)胞

考慮到胸腺和甲狀旁腺具有相同的組織學(xué)來源，同樣由美國(guó)密歇根大學(xué)Doherty教授團(tuán)隊(duì)采用兒童胸腺上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化成甲狀旁腺細(xì)胞[21]。采用手術(shù)切除的兒童胸腺組織，按Mouiseddine[22]方法分離胸腺上皮細(xì)胞和胸腺間充質(zhì)細(xì)胞，鑒定發(fā)現(xiàn)胸腺上皮細(xì)胞對(duì)內(nèi)胚層和甲狀旁腺標(biāo)記物的表達(dá)高于胸腺間充質(zhì)細(xì)胞，因此選用胸腺上皮細(xì)胞進(jìn)行向甲狀旁腺細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化。和ESCs向甲狀旁腺細(xì)胞分化略有不同的是，胸腺上皮細(xì)胞向甲狀旁腺細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化只需在第二階段進(jìn)行干預(yù)，即利用Shh因子的成型作用實(shí)現(xiàn)胸腺上皮細(xì)胞向甲狀旁腺細(xì)胞的轉(zhuǎn)變。采用Bingham方法[18]，即將胸腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)在含5﹪ FBS、100 ng/ml Activin A和100 ng/ml Shh的RPMI1640培基中，培養(yǎng)6 d后的細(xì)胞高表達(dá)甲狀旁腺特異性標(biāo)志物，但此時(shí)細(xì)胞尚未貼壁，培養(yǎng)上清中未檢測(cè)到PTH，分化4周的細(xì)胞部分貼壁，分泌高水平PTH，分泌8周的細(xì)胞完全貼壁，大量分泌PTH，并且甲狀旁腺細(xì)胞分泌PTH的水平能被培養(yǎng)上清中高濃度的鈣離子所抑制。將轉(zhuǎn)分化后的甲狀旁腺細(xì)胞通過皮下注射方式移植進(jìn)RAG2基因敲除的小鼠內(nèi)，3個(gè)月后小鼠體內(nèi)未見瘤體形成。說明采用100 ng/ml Activin A和100 ng/ml Shh能夠?qū)崿F(xiàn)胸腺上皮細(xì)胞向甲狀旁腺細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化，并且分化后的細(xì)胞在小鼠體內(nèi)不具有成瘤性。

三、扁桃體間充質(zhì)細(xì)胞

收集臨床上因扁桃體增生而行扁桃體切除術(shù)的兒童患者的扁桃體組織，分離收集扁桃體間充質(zhì)細(xì)胞[23]，同樣采用Bingham方法進(jìn)行扁桃體間充質(zhì)細(xì)胞向甲狀旁腺細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化[18]，即用含 5﹪ FBS、100 ng/ml Activin A和100 ng/ml Shh的RPMI1640培基進(jìn)行培養(yǎng)，分化7天后的細(xì)胞和培養(yǎng)上清均表達(dá)PTH，甲狀旁腺細(xì)胞分泌PTH的水平受培養(yǎng)血清中鈣離子濃度的影響，高濃度鈣離子抑制細(xì)胞內(nèi)PTH的分泌，低濃度鈣離子促進(jìn)PTH的分泌，甲狀旁腺細(xì)胞的培養(yǎng)上清能夠促使前成骨細(xì)胞株MC3T3-E1的骨形成，將在基質(zhì)膠內(nèi)呈三維狀態(tài)生長(zhǎng)的甲狀旁腺細(xì)胞移植進(jìn)雄性SD大鼠制成的甲狀旁腺功能減退模型內(nèi)，大鼠的生存率和血清PTH分泌水平明顯升高[23-24]?；|(zhì)膠移植到大鼠體內(nèi)，可能存在組織相容性的缺陷。同一科研團(tuán)隊(duì)又進(jìn)一步采用明膠和丙烯酸羥丙酯制成明膠制品[25]，將分化后的甲狀旁腺細(xì)胞移植進(jìn)該明膠制品內(nèi)，發(fā)現(xiàn)甲狀旁腺細(xì)胞能夠持續(xù)大量分泌PTH，將該明膠制品包被的甲狀旁腺細(xì)胞移植進(jìn)甲狀旁腺功能減退模型大鼠內(nèi)，大鼠的生存率和體內(nèi)血鈣水平均提高[26]。另有其他科研團(tuán)隊(duì)報(bào)道，將分化后的甲狀旁腺細(xì)胞包裝在聚二甲硅氧烷成分的凹面微孔板內(nèi)[27-28]，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞成活率變高，并且表達(dá)高水平的PTH、甲狀旁腺分泌蛋白1和細(xì)胞粘附分子N-鈣黏連蛋白，將包裝在聚二甲硅氧烷凹面微孔板內(nèi)的甲狀旁腺細(xì)胞移植進(jìn)SD大鼠制成的甲狀旁腺功能減退模型大鼠腹腔內(nèi)，50﹪大鼠存活超過3個(gè)月，大鼠體內(nèi)PTH和鈣離子水平均在生理范圍內(nèi)[29]。說明100 ng/ml Activin A和100 ng/ml Shh同樣能夠?qū)崿F(xiàn)扁桃體間充質(zhì)細(xì)胞向甲狀旁腺細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化，并且分化后的甲狀旁腺細(xì)胞能夠在甲狀旁腺功能減退模型大鼠內(nèi)起到一定的治療作用。

北京清華長(zhǎng)庚醫(yī)院羅斌教授團(tuán)隊(duì)曾經(jīng)發(fā)表在Medical Hypotheses上一篇綜述，提出脂肪干細(xì)胞具有分化成甲狀旁腺細(xì)胞的潛能，應(yīng)用脂肪干細(xì)胞來源的甲狀旁腺細(xì)胞治療甲狀旁腺功能減退具有一定的應(yīng)用前景[30]，但未見詳細(xì)數(shù)據(jù)報(bào)道。哈爾濱醫(yī)科大學(xué)周毅教授團(tuán)隊(duì)曾經(jīng)發(fā)表在Chin Med J上的一篇文章報(bào)道稱[31]，將轉(zhuǎn)入人類PTH基因的血液干細(xì)胞通過尾靜脈注射進(jìn)雌性小鼠制成的甲狀旁腺功能減退模型內(nèi)，模型小鼠癥狀緩解，血清鈣離子和PTH濃度3個(gè)月內(nèi)保持在正常水平?？赡苁怯捎谵D(zhuǎn)入PTH基因的血液干細(xì)胞攜帶病毒載體，并且轉(zhuǎn)入PTH基因后的血液干細(xì)胞表面不含有鈣離子受體，不能自主調(diào)節(jié)血漿中鈣離子濃度，此方法未見進(jìn)一步的研究和應(yīng)用。

綜上所述，采用D'Amour和Bingham法將ESCs、胸腺上皮細(xì)胞和扁桃體間充質(zhì)細(xì)胞分化后的甲狀旁腺細(xì)胞，能夠表達(dá)成熟甲狀旁腺細(xì)胞特異性標(biāo)記物和提高甲狀旁腺功能減退模型大鼠的生存率、血清PTH和鈣離子水平，因此采用干細(xì)胞來源甲狀旁腺細(xì)胞移植治療甲狀旁腺功能減退具有一定的可行性和臨床價(jià)值。ESCs存在一定的倫理問題，胸腺上皮細(xì)胞和扁桃體間充質(zhì)細(xì)胞均為成體細(xì)胞，存在細(xì)胞數(shù)量有限、培養(yǎng)困難和移植后免疫排斥的問題。iPS細(xì)胞是一種體細(xì)胞重編程的、具有無限增殖和多向分化能力的、形態(tài)和功能都類似ESCs的細(xì)胞。iPS技術(shù)用于細(xì)胞移植的優(yōu)勢(shì)在于，自體iPS細(xì)胞來源的組織細(xì)胞進(jìn)行移植，避免了免疫排斥問題。目前iPS技術(shù)已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于糖尿病、心肌梗塞和視網(wǎng)膜黃斑變性細(xì)胞代替治療研究中，并且取得了可觀的成績(jī)。鑒于iPS技術(shù)的優(yōu)勢(shì)及在醫(yī)學(xué)研究中取得的成績(jī)，考慮應(yīng)用患者體細(xì)胞重編程來源的iPS細(xì)胞分化成的甲狀旁腺細(xì)胞去治療甲狀旁腺功能減退具有更廣闊的前景和臨床應(yīng)用價(jià)值。這是今后的研究方向，相信隨著醫(yī)學(xué)科研水平和國(guó)民經(jīng)濟(jì)實(shí)力的提高，iPS細(xì)胞來源的甲狀旁腺細(xì)胞移植治療甲狀旁腺功能減退指日可待。