石 超，孫慧慧，孫 正，郭 都，張文婷，孫 怡，陳怡飛，夏效東*

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

百里醌對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌的抑制作用

石 超，孫慧慧，孫 正，郭 都，張文婷，孫 怡，陳怡飛，夏效東*

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

為探究百里醌對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌的抑制作用及可能的抑制機(jī)理，檢測(cè)了百里醌對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌的最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentrations，MIC）及對(duì)其生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型的影響，并測(cè)定百里醌處理后阪崎腸桿菌胞內(nèi)ATP濃度、胞內(nèi)pH值、膜電位、細(xì)胞膜完整性的變化，最后利用場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的改變。結(jié)果表明：百里醌對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌的MIC為0.3～0.6 mg/mL；百里醌使阪崎克羅諾腸桿菌的生長(zhǎng)遲滯期延長(zhǎng)，最大生長(zhǎng)速率減小；百里醌影響了阪崎克羅諾腸桿菌細(xì)胞膜的通透性，表現(xiàn)為：質(zhì)量濃度為MIC和2×MIC的百里醌使細(xì)胞內(nèi)ATP濃度由6.52 μmol/L分別降低為0.27 μmol/L和0.17 μmol/L，胞內(nèi)pH值分別由5.69降低為5.22和4.99，細(xì)胞膜完整菌體比例分別降低至80%和22%，引起細(xì)胞膜膜電位超極化；場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡觀測(cè)表明百里醌使阪崎克羅諾腸桿菌細(xì)胞膜褶皺，菌體干癟。綜上所述，百里醌是通過(guò)影響細(xì)胞膜通透性和改變細(xì)胞形態(tài)抑制阪崎克羅諾腸桿菌。這些結(jié)果表明百里醌有潛力作為控制阪崎克羅諾腸桿菌的天然抑菌劑應(yīng)用于食品中。

阪崎克羅諾腸桿菌；百里醌；細(xì)胞膜；膜電位

阪崎克羅諾腸桿菌（Cronobacter sakazakii）是一種革蘭氏陰性、桿狀、無(wú)芽孢、兼性厭氧、周生鞭毛的食源性條件致病菌[1]，它能造成新生兒腦膜炎、菌血癥、壞死性小腸結(jié)腸炎等多種疾病，致死率高達(dá)50%以上[2]。免疫力低下的成年人（主要是老人）食用被阪崎克羅諾腸桿菌污染的食物也能導(dǎo)致骨髓炎、膿毒癥、腳潰瘍等多種疾病的發(fā)生。目前在臨床治療中多使用抗生素治療阪崎克羅諾腸桿菌感染，雖可以使患者康復(fù)，但是常常伴隨有嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥和發(fā)育障礙等癥狀[3]。鑒于阪崎克羅諾腸桿菌的巨大潛在危害，2 0 0 2年食品微生物標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（I n t e r n a t i o n a l Commissionon Microbiological Specifications for Foods，ICMSF）把阪崎腸桿菌描述為“對(duì)特定人群造成嚴(yán)重危害，危及生命或引起長(zhǎng)期慢性實(shí)質(zhì)性后遺癥的細(xì)菌”[4]。

預(yù)防和控制食源性致病菌對(duì)于各國(guó)的公共健康衛(wèi)生具有重要的意義。為抑制和殺滅食品中的病原微生物，食品加工生產(chǎn)過(guò)程中通常以添加天然合成防腐劑來(lái)保證食品安全、延長(zhǎng)食品貨架期。然而由于合成的物質(zhì)往往具有潛在的毒性，近年來(lái)部分研究者將目光集中到植物來(lái)源，尤其是水果、蔬菜和中草藥等的活性物質(zhì)上[5]。消費(fèi)者在消費(fèi)過(guò)程中也傾向于選擇“零添加”或低含量防腐劑的產(chǎn)品[6]。植物源活性物質(zhì)以其消費(fèi)者接受度高及來(lái)源范圍廣被認(rèn)為是合成防腐劑的最佳替代品[7]。

百里醌（thymoquinone，TQ），是黑種草（Nigella sativa）中的主要成分，占黑種草油含量的28%～57%[8]。黑種草，又稱為黑小茴香，是一種毛莨科一年生草本芳香植物[9]，被用作香料、食品添加劑在食品生產(chǎn)中廣為應(yīng)用，同時(shí)它也被作為藥物用來(lái)治療哮喘、腹瀉、頭痛、鼻塞、背部疼痛、高血壓和胃腸道問(wèn)題[9-10]，目前黑種草已被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局確認(rèn)為公認(rèn)安全的食品成分（GRAS 182.10）。研究表明，百里醌具有多種生物活性作用，包括抗腫瘤、抗炎、抑菌、抗氧化等[8,11-12]。

盡管百里醌已被報(bào)道對(duì)多種微生物有抑制效果，但其對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌的抑制作用及機(jī)理鮮有研究。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)旨在探討百里醌對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌的抑菌效果，并通過(guò)檢測(cè)其對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型、胞內(nèi)ATP、胞內(nèi)pH值、膜電位、細(xì)胞膜完整性及細(xì)胞形態(tài)的影響探討其可能的抑菌機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

阪崎克羅諾腸桿菌（Cronobacter sakazakii）ATCC 29544、ATCC 29004、ATCC 12868和ATCC BAA-894購(gòu)于美國(guó)模式菌株收集中心；阪崎克羅諾腸桿菌分離菌株12-2、14-15、18-7、18-8和18-13由西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院食品微生物研究團(tuán)隊(duì)分離自市售嬰幼兒乳粉及米粉。

百里醌（色譜級(jí)，純度≥9 8%）、熒光探針DiBAC4(3)及cFDA-SE 美國(guó)Sigma公司；胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptone soya agar，TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（tryptone soya broth，TSB）培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限公司；ATP檢測(cè)試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)公司；LIVE/DEAD?BacLightTM細(xì)菌活性檢測(cè)試劑盒 美國(guó)賽默飛世爾科技公司；其他所用有機(jī)溶劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

InfiniteTMM200 PRO多功能酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；SmartSpecTMPlus分光光度計(jì) 美國(guó)Bio-Rad公司；5804R低溫冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；S-4800場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司；微生物全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀 芬蘭Bioscreen公司；SCIENTZ-IID超聲波裂解儀 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

將凍存于-80 ℃的阪崎克羅諾腸桿菌采用劃線法在TSA平板上活化，挑取單菌落接種于30 mL TSB培養(yǎng)基中，將其置于37 ℃培養(yǎng)18 h使細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，培養(yǎng)后的菌液經(jīng)5 000×g離心15 min，去除上清液，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌菌體沉淀，反復(fù)洗滌3 次后，用一定量的PBS懸浮菌體沉淀，測(cè)定并調(diào)整菌懸液的OD600nm為0.5，使菌液濃度約為108CFU/mL。

1.3.2 最小抑菌濃度測(cè)定

最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentrations，MIC）的測(cè)定采用瓊脂稀釋法[13]。將冷卻至45 ℃的TSA培養(yǎng)基加入24 孔培養(yǎng)板中，向其中加入百里醌并進(jìn)行稀釋，使百里醌質(zhì)量濃度為0.80、0.60、0.40、0.30、0.20、0.10、0.05 mg/mL，充分吹打混勻，培養(yǎng)基在室溫下放置至凝固。吸取2 μL菌懸液（1.3.1節(jié)方法制備）接種至24 孔板各孔中央。將24 孔板放置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀測(cè)結(jié)果，其中可抑制阪崎克羅諾腸桿菌出現(xiàn)增長(zhǎng)的最低質(zhì)量濃度即為百里醌的MIC。實(shí)驗(yàn)以不含有百里醌的培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，含有1 mg/mL氨芐西林的培養(yǎng)基為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.3 百里醌對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型影響的測(cè)定

按照1.3.1節(jié)中的方法制備ATCC 29544菌懸液，調(diào)整菌懸液OD600nm為0.5并稀釋100 倍，使菌懸液濃度約為106CFU/mL。向96 孔培養(yǎng)板中每孔加入125 μL的菌懸液和125 μL不同質(zhì)量濃度的百里醌溶液（TSB培養(yǎng)基配制），使百里醌的最終質(zhì)量濃度為2×MIC、MIC、1/2×MIC、1/4×MIC、1/8×MIC、1/16×MIC和1/32×MIC，背景空白對(duì)照組添加250 μL TSB培養(yǎng)基，樣品對(duì)照組添加125 μL菌懸液及125 μL TSB培養(yǎng)基。設(shè)置微生物全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀培養(yǎng)溫度為37 ℃并每隔1 h檢測(cè)600 nm波長(zhǎng)處的OD值。

以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌懸液OD600nm值為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。選取修正Gompertz模型（式（1～3））擬合其生長(zhǎng)狀況，并表征菌株的生長(zhǎng)參數(shù)。利用SPSS軟件中的非線性回歸方法擬合A、B、μ、λ、M和μmax等參數(shù)值，以相關(guān)系數(shù)R2作為評(píng)估因子模型的擬合度。

式中：ODt為在t時(shí)菌液的OD600nm值；t為培養(yǎng)時(shí)間/h；B為最大菌液濃度時(shí)的OD600nm值；A為初始菌液濃度時(shí)的OD600nm值；tmax為菌株達(dá)到指數(shù)期所用時(shí)間/h；μ為指數(shù)期的相對(duì)生長(zhǎng)速率/h-1；λ為遲滯期/h；μmax為最大生長(zhǎng)速率/h-1。

1.3.4 百里醌對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌胞內(nèi)ATP的影響

按照1.3.1節(jié)方法制備菌懸液，用PBS調(diào)整菌懸液的OD600nm為0.5。樣品實(shí)驗(yàn)組中添加菌懸液及百里醌溶液（0、MIC和2×MIC），背景空白對(duì)照組添加PBS及百里醌溶液，將樣品置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min。隨后裂解超聲，具體方法如下：將樣品冰浴，逐個(gè)超聲，每超聲3 s停頓5～7 s，一輪超聲10 次，超聲4 輪；超聲時(shí)，探頭置于液面下約1 cm處，同時(shí)與離心管底部保持一定距離。每個(gè)樣品超聲結(jié)束后立即將離心管于100 ℃溫度下處理2～3 min使樣品中ATP酶滅活。將樣品離心取上清液，根據(jù)ATP檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，使用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定樣品上清液的熒光強(qiáng)度。同時(shí)，使用ATP檢測(cè)裂解液將ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成0.01、0.10、1.00、10.00 μmol/L的4 個(gè)濃度梯度，繪制熒光強(qiáng)度與ATP濃度間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中ATP的濃度。

1.3.5 百里醌對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌腸桿菌胞內(nèi)pH值的影響

菌液制備同1.3.1節(jié)，將培養(yǎng)后的菌液4 ℃、5 000×g離心5 min，去除上清液，并用磷酸鉀緩沖液洗滌一次，調(diào)整菌懸液的OD600nm為0.5。用4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液洗滌菌體2 次，加入磷酸鉀緩沖液重懸浮，加入cFDA-SE熒光探針使其終濃度為3 μmol/L（37 ℃培養(yǎng)箱中孵育20 min），隨后用磷酸鉀緩沖液洗滌一次，重新懸浮，加入葡萄糖使其終濃度為10 μmol/L（37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min），最后用磷酸鉀緩沖液洗滌菌體2 次并重懸浮菌體。實(shí)驗(yàn)使用磷酸鉀緩沖液配制百里醌溶液，實(shí)驗(yàn)組將百里醌溶液添加至菌懸液中，使百里醌質(zhì)量濃度分別為0、MIC和2×MIC，背景空白對(duì)照組為磷酸鉀緩沖液配制的百里醌溶液，樣品于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 min。

為構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，使用50 mmol/L甘氨酸、50 mmol/L氯化鉀、50 mmol/L檸檬酸、50 mmol/L磷酸二氫鈉溶液配制pH值為3、4、5、6、7、8、9、10的緩沖液，用氫氧化鈉、鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值。標(biāo)準(zhǔn)曲線組每孔加入200 μL上述緩沖液、30 μL菌液、10 μL尼日利亞菌素（10 μmol/L）和10 μL纈氨霉素（10 μmol/L）。使用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定發(fā)射波長(zhǎng)520 nm，激發(fā)波長(zhǎng)分別為490、440 nm時(shí)的熒光強(qiáng)度，繪制490 nm和440 nm時(shí)熒光強(qiáng)度的比值與pH值間的線性關(guān)系，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品組胞內(nèi)pH值。

1.3.6 百里醌對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌膜電位的影響

細(xì)菌膜電位的測(cè)定參照Sanchez等[14]的方法，菌液制備同1.3.1節(jié)，以PBS洗滌菌體2 次并調(diào)整菌懸液OD600nm為0.5。將125 μL菌懸液加入黑色96 孔酶標(biāo)板中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min。隨后向每孔中加入細(xì)胞膜電位熒光探針DiBAC4(3)（1 μmol/L），并再次37 ℃孵育30 min。然后將125 μL百里醌溶液加入黑色酶標(biāo)板各孔中，使百里醌的質(zhì)量濃度分別為0、MIC和2×MIC。百里醌作用5 min后使用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，激發(fā)、發(fā)射波長(zhǎng)分別為492、515 nm。激發(fā)和發(fā)射縫隙寬度分別為3、5 nm。通過(guò)計(jì)算百里醌作用組與對(duì)照組的相對(duì)熒光強(qiáng)度（處理組檢測(cè)所得熒光強(qiáng)度減去對(duì)照組檢測(cè)所得熒光強(qiáng)度），分析細(xì)菌膜電位的變化。若細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度增加，即膜電位增加，表示細(xì)胞去極化；反之，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度降低，即膜電位降低，表示細(xì)胞超極化[24]。

1.3.7 百里醌對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌細(xì)胞膜完整性的影響

參照Shi Chao等[15]的方法，使用LIVE/DEAD?BacLightTM細(xì)菌活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)百里醌對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌細(xì)胞膜完整性的影響。具體方法如下：菌液制備同1.3.1節(jié)，將菌液4 ℃、10 000×g離心15 min，使用0.85% NaCl溶液洗滌菌體2 次，隨后加入2 mL 0.85% NaCl溶液。將重懸菌懸液分別取1 mL加入到20 mL 0.85% NaCl溶液（活菌組）和70%異丙醇溶液（死菌組）中，于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h。使用0.85% NaCl溶液洗脫2～3 次后將兩組樣品調(diào)整至OD600nm為0.5（兩組誤差不超過(guò)0.01）。添加百里醌于0.85% NaCl溶液處理的菌液中，使百里醌質(zhì)量濃度為0、MIC和2×MIC，并在37 ℃孵育30 min后，離心去掉上清液，加入相同體積的0.85% NaCl溶液重懸。

以不同體積活菌組菌懸液和死菌組菌懸液配制不同活菌比例（0%、10%、50%、90%、100%）的菌懸液，在黑色96 孔酶標(biāo)板中設(shè)置樣品空白對(duì)照孔（0.85% NaCl溶液）、樣品孔和標(biāo)準(zhǔn)曲線孔，并向所有孔內(nèi)加入相同體積2×SYTO/PI染料，充分吹打混勻。將96 孔酶標(biāo)板置于25 ℃條件下培養(yǎng)5～10 min。使用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，SYTO染料的激發(fā)及發(fā)射波長(zhǎng)分別為485、542 nm，PI染料的激發(fā)及發(fā)射波長(zhǎng)分別為485、610 nm。

1.3.8 百里醌對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌細(xì)胞形態(tài)的影響

場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌細(xì)胞形態(tài)的觀測(cè)參照Li Guanghui等[16]的方法，具體如下：按1.3.1節(jié)方法制備菌懸液，將添加不同質(zhì)量濃度百里醌（0、MIC和2×MIC）的菌液（OD600nm為0.5）置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在2 h和4 h取出樣品。隨后，使用PBS洗滌菌體2 次，并將菌體重新懸浮于2.5%戊二醛-PBS中固定（4 ℃）。12 h后依次使用PBS、無(wú)菌水洗滌菌體，并將菌體置于1%鋨酸中固定5 h，隨后使用不同體積分?jǐn)?shù)（30%、50%、70%、80%、90%和100%）的乙醇梯度脫水，每次10 min。將樣品滴加至專用蓋玻片并貼附于場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡載物臺(tái)，樣品抽真空脫水2 h后鍍金，使用場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡觀測(cè)細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 百里醌對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌的MIC

表1 百里醌對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌的MICTable 1 Minimum inhibitory concentrations of thymoquinone against C. sakazakii

百里醌對(duì)9 株食品或臨床來(lái)源的阪崎克羅諾腸桿菌有良好的抑制效果。由表1可知，百里醌對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌ATCC 29544、ATCC 29004的MIC為0.4 mg/mL，對(duì)4 種食品來(lái)源的分離菌（14-15、18-7、18-8、18-13）的MIC也為0.4 mg/mL。百里醌對(duì)ATCC 12868及分離菌12-2的MIC為0.6 mg/mL，對(duì)ATCC BAA-894的MIC為0.3 mg/mL。為了進(jìn)一步探討百里醌對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌的抑菌機(jī)理，選擇ATCC 29544進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。國(guó)內(nèi)外一些研究也報(bào)道了植物源抑菌劑對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌有抑制效果，如香芹酚和百里酚[17]、辛酸、檸檬酸、香草醛[18]、反式-肉桂醛[18]、藍(lán)莓花青素和野生藍(lán)莓汁[19]，對(duì)比其他的植物源抑菌劑，百里醌對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌具有較強(qiáng)的抑菌效果。

2.2 百里醌對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型的影響

圖1 百里醌對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌ATCC 29544生長(zhǎng)曲線的影響Fig. 1 Growth curves of C. sakazakii ATCC 29544 cultured in TSB with various concentrations of thymoquinone

阪崎克羅諾腸桿菌在含有不同質(zhì)量濃度百里醌的TSB中的生長(zhǎng)曲線如圖1所示，應(yīng)用修正Gompertz方程擬合ATCC 29544的生長(zhǎng)曲線，各擬合方程的R2均大于0.98，表明此方程能夠較好地?cái)M合菌株的生長(zhǎng)狀況。由圖1可以看出，在TSB培養(yǎng)液中，質(zhì)量濃度為MIC的百里醌幾乎完全抑制阪崎克羅諾腸桿菌的生長(zhǎng)。當(dāng)百里醌質(zhì)量濃度為1/2×MIC時(shí)，阪崎克羅諾腸桿菌在6 h內(nèi)幾乎沒(méi)有生長(zhǎng)，生長(zhǎng)17 h達(dá)到細(xì)菌數(shù)量的最大值。

表2 阪崎克羅諾腸桿菌在含有不同質(zhì)量濃度百里醌的TSB中的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)（n＝6）Table 2 Kinetic parameters of C. sakazakii cells during growth in TSB with different concentrations of thymoquinone (n= 6)

菌株的生長(zhǎng)參數(shù)如表2所示，百里醌使阪崎克羅諾腸桿菌在TSB中生長(zhǎng)遲滯期增長(zhǎng)，最大生長(zhǎng)速率減小，并呈現(xiàn)濃度依賴效應(yīng)。

2.3 百里醌對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌胞內(nèi)ATP濃度的影響

螢火蟲(chóng)熒光素酶催化熒光素產(chǎn)生熒光時(shí)需要ATP提供能量，并當(dāng)螢火蟲(chóng)熒光素酶和熒光素都過(guò)量時(shí)，在一定的濃度范圍內(nèi)熒光的產(chǎn)生和ATP的濃度成正比，據(jù)此首先構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到ATP濃度與相對(duì)熒光強(qiáng)度之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（y＝21 365x+2 381；R2＝0.999）。

由圖2可知，百里醌對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌胞內(nèi)ATP含量有極顯著的降低作用（P＜0.01），并呈現(xiàn)濃度依賴效應(yīng)。未經(jīng)百里醌處理的對(duì)照組胞內(nèi)ATP濃度為6.52 μmol/L，經(jīng)質(zhì)量濃度為MIC的百里醌處理的實(shí)驗(yàn)組胞內(nèi)ATP濃度降為0.27 μmol/L，經(jīng)質(zhì)量濃度為2×MIC的百里醌處理的實(shí)驗(yàn)組降為0.17 μmol/L。ATP是細(xì)胞內(nèi)能量代謝、酶反應(yīng)和信號(hào)調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂和存活等細(xì)胞功能有著關(guān)鍵作用[20]。本實(shí)驗(yàn)中百里醌使阪崎腸桿菌胞內(nèi)ATP顯著降低，從而影響細(xì)菌存活。Li Guanghui等[16]也有類似的發(fā)現(xiàn)，綠原酸處理金黃色葡萄球菌細(xì)胞使細(xì)菌胞內(nèi)ATP濃度降低。胞內(nèi)ATP濃度的降低可以歸因于細(xì)菌自身水解速率增加[14]，以及細(xì)胞膜通透性的損傷，使胞內(nèi)ATP流出[20]。

圖2 百里醌對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌ATCC 29544胞內(nèi)ATP濃度的影響Fig. 2 Effect of thymoquinone on intracellular ATP production in C. sakazakii ATCC 29544

2.4 百里醌對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌胞內(nèi)pH值的影響

圖3 百里醌對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌ATCC 29544胞內(nèi)pH值的影響Fig. 3 Effect of thymoquinone on intracellular pH of C. sakazakii ATCC 29544

由圖3可知，百里醌對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌胞內(nèi)pH值有極顯著的影響（P＜0.01）。未經(jīng)百里醌處理的阪崎腸桿菌胞內(nèi)pH值為5.69±0.01，經(jīng)質(zhì)量濃度為MIC的百里醌處理后，阪崎腸桿菌胞內(nèi)pH值降低為5.22±0.02，經(jīng)質(zhì)量濃度為2×MIC的百里醌處理后，阪崎腸桿菌胞內(nèi)pH值降低為4.99±0.05。

細(xì)菌pH值對(duì)于細(xì)胞內(nèi)的DNA的轉(zhuǎn)錄與合成、酶活性及蛋白質(zhì)合成等有非常重要的影響[21]。Turgis等[22]研究表明了芥末精油使大腸桿菌O157:H7胞內(nèi)pH值從6.23降低為5.20，使鼠傷寒沙門氏菌胞內(nèi)pH值從6.59降至5.44，胞內(nèi)pH值的改變意味著細(xì)胞膜的損傷[14]。

2.5 百里醌對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌細(xì)胞膜電位的影響

圖4 百里醌對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌ATCC 29544細(xì)胞膜電位的影響Fig. 4 Effect of thymoquinone on membrane potentials of C. sakazakii ATCC 29544

由圖4可知，經(jīng)百里醌處理的阪崎克羅諾腸桿菌細(xì)胞膜出現(xiàn)超級(jí)化（負(fù)相對(duì)熒光強(qiáng)度），并且經(jīng)質(zhì)量濃度為2×MIC百里醌處理比質(zhì)量濃度MIC的處理后超級(jí)化現(xiàn)象更加明顯。靜息膜電位是活細(xì)胞的重要參數(shù)之一，與抑菌物質(zhì)殺滅細(xì)菌作用密切相關(guān)[23]。實(shí)驗(yàn)所使用的陰離子熒光染料DiBAC4(3)是一種細(xì)胞膜電位敏感的親脂性陰離子熒光染料，可以指示細(xì)胞膜電位的變化[18]。DiBAC4(3)本身無(wú)熒光，當(dāng)進(jìn)人細(xì)胞與胞漿內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)合后才發(fā)出熒光，DiBAC4(3)進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度增加，即膜電位增加表示細(xì)胞去極化；反之，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度降低即膜電位降低表示細(xì)胞超極化[24]。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)可以得出，百里醌引起阪崎腸桿菌細(xì)胞膜超極化，這與紫蘇、白蒿和金合歡提取物引起細(xì)菌細(xì)胞膜的超極化現(xiàn)象一致[14]。研究表明，出現(xiàn)超極化和去極化現(xiàn)象的原因?yàn)椋簆H值的改變及抑菌物質(zhì)影響細(xì)菌細(xì)胞膜上離子的運(yùn)動(dòng)，特別是K+，從而影響胞體的自動(dòng)調(diào)節(jié)[25]。

2.6 百里醌對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌細(xì)胞膜完整性的影響

表3 不同質(zhì)量濃度百里醌處理對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌ATCC 29544細(xì)胞膜熒光強(qiáng)度的影響Table 3 Fluorescence of C. sakazakii ATCC 29544 treated with various concentrations of thymoquinone

綠色熒光強(qiáng)度與細(xì)胞膜完整細(xì)胞百分比呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性擬合方程為y＝32 769x+10 632（R2＝0.99）。由表3可知，與對(duì)照組相比，經(jīng)百里醌處理的阪崎克羅諾腸桿菌細(xì)胞膜完整性極顯著下降（P＜0.01）。未經(jīng)百里醌處理的對(duì)照組細(xì)胞膜完整菌體比例為96%，僅經(jīng)過(guò)質(zhì)量濃度為MIC的百里醌處理15 min后，細(xì)胞膜完整菌體比例下降至80%。經(jīng)質(zhì)量濃度為2×MIC百里醌處理后，細(xì)胞膜完整的細(xì)菌比例僅為22%。Campos等[26]也得到相似結(jié)論，添加不同濃度的沒(méi)食子酸能夠顯著降低希氏乳桿菌的細(xì)胞膜完整性。Cherrat等[27]證明最小抑菌濃度的月桂精油能夠在細(xì)菌適宜生長(zhǎng)的溫度下?lián)p傷大腸桿菌及單增李斯特菌細(xì)胞膜。

2.7 百里醌對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌細(xì)胞形態(tài)的影響

圖5 場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡觀測(cè)百里醌對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌ATCC 29544細(xì)胞形態(tài)的影響（20 000×）Fig. 5 Field emission scanning electron electron microscopic observation of the effect of thymoquinone on morphology of C. sakazakii ATCC 29544 (20 000 ×)

由圖5可知，未經(jīng)百里醌處理和經(jīng)由百里醌處理的細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)存在明顯差異。未經(jīng)百里醌處理的阪崎克羅諾腸桿菌表面光滑、飽滿，具有典型的革蘭氏陰性桿菌的形態(tài)，并且細(xì)胞能夠生長(zhǎng)和分裂（圖5A1、A2）。但經(jīng)過(guò)百里醌處理后，阪崎腸桿菌表面褶皺，菌體干癟。經(jīng)4×MIC的百里醌處理后，阪崎腸桿菌菌體出現(xiàn)大面積塌陷，喪失了其固有形態(tài)（圖5D1、D2）。阪崎克羅諾腸桿菌細(xì)胞的受損程度和受損的比例隨著百里醌質(zhì)量濃度的增加而升高。

植物源活性物質(zhì)對(duì)其他多種病原菌細(xì)胞形態(tài)的改變也有類似報(bào)道。di Pasqua等[28]發(fā)現(xiàn)丁子香酚能夠破壞大腸桿菌O157:H7的細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物流出。然而其他天然物質(zhì)（香芹酚、肉桂醛、檸檬烯和百里酚）僅能導(dǎo)致外膜形態(tài)的改變。Rhayour等[29]發(fā)現(xiàn)丁香精油對(duì)于不同病原菌細(xì)胞形態(tài)的作用不同。作用大腸桿菌后，細(xì)胞膜表面出現(xiàn)孔洞，但對(duì)于枯草芽孢桿菌，菌體僅出現(xiàn)變形。在本實(shí)驗(yàn)中，百里醌使菌體細(xì)胞表面塌陷但并沒(méi)有造成細(xì)胞膜破裂、瓦解。這說(shuō)明百里醌是通過(guò)與細(xì)胞膜表面特定位點(diǎn)結(jié)合然后滲透到靶位點(diǎn)并影響其目標(biāo)分子[30]。

3 結(jié) 論

本研究以百里醌為研究對(duì)象，以阪崎克羅諾腸桿菌為作用主體，探究百里醌對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌的抑菌作用及可能的抑菌機(jī)理。利用瓊脂稀釋法測(cè)定了百里醌對(duì)9 株阪崎克羅諾腸桿菌的MIC為0.3～0.6 mg/mL。測(cè)定百里醌對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌生長(zhǎng)曲線的影響，并利用修正Gompertz模型擬合其生長(zhǎng)狀況，表征菌株的生長(zhǎng)參數(shù)。結(jié)果表明百里醌使阪崎克羅諾腸桿菌生長(zhǎng)遲滯期顯著增長(zhǎng)，最大生長(zhǎng)速率顯著減小。接著探索了百里醌對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌細(xì)胞膜通透性的影響：利用螢火蟲(chóng)熒光素酶檢測(cè)百里醌對(duì)胞內(nèi)ATP的影響，利用cFDA-SE熒光探針檢測(cè)百里醌對(duì)胞內(nèi)pH值的影響，利用DiBAC4(3)熒光探針檢測(cè)百里醌對(duì)細(xì)胞膜電位的影響，利用LIVE/DEAD?BacLightTM細(xì)菌活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)百里醌對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌細(xì)胞膜完整性的影響。結(jié)果表明百里醌影響了阪崎克羅諾腸桿菌細(xì)胞膜的通透性，表現(xiàn)為：質(zhì)量濃度為MIC和2×MIC的百里醌使細(xì)胞內(nèi)ATP濃度由6.52 μmol/L分別降低為0.27 μmol/L和0.17 μmol/L，胞內(nèi)pH值由5.69分別降低為5.22和4.99，細(xì)胞膜完整菌體比例分別降低至80%和22%，引起細(xì)胞膜膜電位超極化。最后通過(guò)場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡觀測(cè)百里醌對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌細(xì)胞形態(tài)的影響，結(jié)果表明百里醌作用使細(xì)胞膜皺縮，細(xì)胞干癟，部分菌體喪失了原有的細(xì)胞形態(tài)。上述結(jié)果表明：百里醌對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌有著良好的抑制效果，是通過(guò)影響細(xì)胞膜的通透性及引起細(xì)胞功能紊亂來(lái)實(shí)現(xiàn)其抑菌作用。研究結(jié)果為百里醌作為天然抑菌劑在食品中發(fā)揮其控制阪崎克羅諾腸桿菌的作用提供了理論依據(jù)。然而，百里醌對(duì)于食品感官品質(zhì)的影響及食品成分對(duì)于百里醌抑菌作用的干擾需要在實(shí)際應(yīng)用前進(jìn)一步探討。

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Antimicrobial Activity of Thymoquinone against Cronobacter sakazakii

SHI Chao, SUN Huihui, SUN Zheng, GUO Du, ZHANG Wenting, SUN Yi, CHEN Yifei, XIA Xiaodong*
(College of Food Science and Engineering, Northwest A & F University, Yangling 712100, China)

The objective of the present study was to evaluate the effectiveness of thymoquinone (TQ) against Cronobacter sakazakii strains. The minimum inhibitory concentration (MIC) of TQ against C. sakazakii and its effect on microbial growth kinetics were determined. Changes in intracellular ATP concentration, intracellular pH (pHin), membrane potential and membrane integrity were measured to elucidate the possible antimicrobial mechanism. Cell morphology changes were also observed under a fi eld emission scanning electron microscope. The results showed that the MICs of TQ against C. sakazakii strains ranged from 0.3 to 0.6 mg/mL, and TQ exposure resulted in a longer lag phase and lower specif i c growth rate compared to the control. TQ affected the cell membrane permeability of C. sakazakii, as evidenced by a reduction in intracellular ATP concentration from 6.52 to 0.27 and 0.17 μmol/L and a decrease in pHinfrom 5.69 to 5.22 and 4.99 at MIC and 2 × MIC, respectively. TQ at both tested concentrations caused 80% and 22% reduction in cell integrity, respectively. In addition, cells treated with TQ showed hyperpolarized cell membrane. Field emission scanning electron microscopy illustrated that C. sakazakii cells exposed to TQ exhibited a more wrinkled surface compared with the smooth surface of untreated cells. In conclusion, TQ exerts its antimicrobial action partly by causing excessive permeability of the cell membrane and changing cell morphology. These fi ndings suggest that TQ has potential application in controlling C. sakazakii in foods.

Cronobacter sakazakii; thymoquinone; cell membrane; membrane potential

10.7506/spkx1002-6630-201801009

Q939.9

A

1002-6630（2018）01-0058-07

石超, 孫慧慧, 孫正, 等. 百里醌對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌的抑制作用[J]. 食品科學(xué), 2018, 39(1): 58-64.

10.7506/spkx1002-6630-201801009. http://www.spkx.net.cn

SHI Chao, SUN Huihui, SUN Zheng, et al. Antimicrobial activity of thymoquinone against Cronobacter sakazakii[J]. Food Science,2018, 39(1): 58-64. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201801009. http://www.spkx.net.cn

2016-09-04

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2015BAD16B08）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（2452017146）

石超（1989—），女，講師，博士，研究方向?yàn)樘烊换钚晕镔|(zhì)的抗菌功能。E-mail：meilixinong@126.com

*通信作者簡(jiǎn)介：夏效東（1981—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樘烊换钚晕镔|(zhì)的營(yíng)養(yǎng)及抗菌功能。E-mail：foodscixiaodong@yahoo.com