郭元亨，張利軍，曹麗麗，陳金金，劉伯言，趙慶生，趙 兵,*

（1.中國科學(xué)院過程工程研究所，生化工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生物煉制工程研究部，北京 100190；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

植物多糖中單糖組成分析技術(shù)的研究進(jìn)展

郭元亨1,2，張利軍1,2，曹麗麗1，陳金金1，劉伯言1,2，趙慶生1，趙 兵1,*

（1.中國科學(xué)院過程工程研究所，生化工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生物煉制工程研究部，北京 100190；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

植物多糖是重要的藥用和食用資源。在植物多糖的研究中，單糖組成分析是基礎(chǔ)性和關(guān)鍵性的環(huán)節(jié)。單糖組成分析包括植物多糖的降解、單糖的相互分離及檢測等環(huán)節(jié)。本文圍繞近年來植物多糖研究，綜述了植物多糖降解技術(shù)和單糖化學(xué)修飾及分離檢測技術(shù)，為植物多糖的研究提供理論參考。

植物多糖；單糖組成；定量分析

在1993年美國召開的第一屆國際糖類工作年會(huì)上，會(huì)議主席稱“Glycobiology”（糖生物學(xué)）是生物學(xué)領(lǐng)域的最后一個(gè)重大前沿。2001年，Science雜志以“Cinderella’s coach is ready”為題專門出版了“糖化學(xué)和糖生物學(xué)”專輯，介紹了糖類的最新研究成果和前景展望[1]。以此為標(biāo)志，人類對糖類的研究進(jìn)入快速通道。從原來將糖類視為生物體中維持細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)和提供能量來源的物質(zhì)，逐漸轉(zhuǎn)移到研究糖類多方面的、復(fù)雜的生理生化功能。隨著研究的深入，越來越多的人意識(shí)到多糖研究的重要性和學(xué)科前沿性。近十多年來，大量研究結(jié)果表明，許多植物多糖具有多種生物活性和生理功能，包括免疫調(diào)節(jié)[2-3]、抗腫瘤[4-6]、抗氧化[7-9]、抗疲勞[10]、抗炎[11-12]、控制血糖[13]和代謝膽固醇[14]、降血脂[15]以及肝功能保護(hù)[16]等，而且對機(jī)體幾乎無毒副作用，具有高效低毒的特點(diǎn)。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前全球至少有數(shù)10 種多糖已進(jìn)入到抗腫瘤、抗艾滋病及糖尿病治療等臨床實(shí)驗(yàn)階段，并且已有多種多糖藥物成功應(yīng)用于臨床，如香菇多糖、人參多糖以及豬苓多糖。

在植物多糖的結(jié)構(gòu)特征、理化性質(zhì)及其構(gòu)效關(guān)系的研究中，單糖組成是最基本的研究對象。另外，隨著越來越多的多糖類藥品、食品和保健品出現(xiàn)在市面上，這些產(chǎn)品的質(zhì)量控制也顯得愈加緊迫，甚至一些原料藥材的質(zhì)量控制也需要借助其中糖類的指紋圖譜來控制。因此對植物多糖中的單糖組成分析逐漸成為一個(gè)非常重要的環(huán)節(jié)。

在分析植物多糖的單糖組成過程中，最基本的環(huán)節(jié)包括多糖水解為單糖、單糖之間相互分離、單糖的化學(xué)修飾以及對逐個(gè)分離的單糖進(jìn)行檢測分析。幾乎所有對植物多糖的單糖組成分析的研究都是圍繞上述環(huán)節(jié)展開。因此，本文將圍繞上述環(huán)節(jié)，對近年來單糖組成分析領(lǐng)域中取得的進(jìn)展及存在的問題逐一分析綜述。

1 植物多糖降解

降解多糖大分子的方法有多種，包括電磁輻射、超聲波[17-19]、酶催化[20-21]、堿催化、酸催化等。

1.1 電磁輻射降解

目前報(bào)道用于降解多糖的輻射多指γ射線，主要通過γ光子斷裂糖苷鍵或者γ射線產(chǎn)生的自由基斷裂糖苷鍵[22-23]，但輻射通常很難將多糖完全降解成單糖；因此目前在單糖組成分析中還未見使用輻射手段進(jìn)行多糖鏈降解的報(bào)道。

1.2 超聲波降解

超聲波在介質(zhì)中傳播時(shí)，介質(zhì)質(zhì)點(diǎn)作疏密振動(dòng)，當(dāng)質(zhì)點(diǎn)之間的瞬時(shí)距離超過臨界距離之后，介質(zhì)結(jié)構(gòu)的完整性遭到破毀，形成空穴。空穴破碎產(chǎn)生局部性的高溫高壓，為自由基產(chǎn)生提供了條件，而自由基可以攻擊大分子導(dǎo)致長鏈斷裂[19]；另一方面，超聲波產(chǎn)生的激烈而快速變化的機(jī)械運(yùn)動(dòng)，可導(dǎo)致多糖長鏈分子斷裂。但超聲波和輻射一樣，很難將多糖分子徹底降解為單糖分子；因此單糖組成分析中，尚未有使用超聲波進(jìn)行多糖降解的報(bào)道。

1.3 酶催化降解

糖苷酶可以有效降低糖苷鍵的活化能，提高多糖降解的反應(yīng)速率。糖苷酶可以分為2 類：一類是外切糖苷酶，這類酶只能從多糖鏈的非還原末端逐個(gè)切下單糖，對糖基的組成和糖苷鍵的類型有專一性要求；另一類是內(nèi)切糖苷酶，這類酶水解糖鏈內(nèi)部的糖苷鍵，釋放糖鏈片段[24]。Zha Shenghua等[25]在提取瑪咖多糖時(shí)，就使用了酶催化法，其可促進(jìn)纖維素?cái)嗔眩铀佻斂е锌扇苄远嗵堑娜艹?。但酶催化法降解植物多糖有諸多不利因素：1）酶對底物的專一性要求較高，因此在實(shí)際應(yīng)用中往往很難找到與底物相吻合的酶制劑；2）雖然目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的糖苷酶有多種，但絕大多數(shù)在生物體內(nèi)，實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)的很少，因此合適的酶來源非常有限；3）如果酶不是固定在某種載體上，而是以游離的形態(tài)加入，則酶催化水解完成后，水解液中酶的去除也是一個(gè)新增問題。因此，目前酶解法應(yīng)用于水解多糖受到一定限制。

1.4 堿催化降解

堿也可以催化多糖的水解，根據(jù)有機(jī)化學(xué)反應(yīng)機(jī)理，堿催化水解反應(yīng)只能從糖鏈的還原末端逐個(gè)脫下單糖，而不能從非還原末端或者鏈中間的糖苷鍵上進(jìn)行[26]，因此水解速率較慢。另外，堿催化過程常伴隨著產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的變化[27]；因此目前堿催化降解尚無法滿足植物多糖中單糖組成分析研究的需要。

1.5 酸催化降解

在分析多糖中單糖組成時(shí)，需要快速、完全、徹底地對多糖進(jìn)行水解，以保證較高的單糖回收率。多糖的水解是糖苷鍵斷裂的過程，糖苷鍵的酸水解實(shí)質(zhì)上是使糖苷鍵O原子質(zhì)子化，從而將糖苷鍵打開的過程。而酸性條件提供了大量H+，有利于糖苷鍵O原子的質(zhì)子化進(jìn)程。糖苷鍵O原子質(zhì)子化后，隨后糖苷鍵斷裂，苷元脫離，碳正離子溶劑化，最后脫去質(zhì)子形成單糖[28]。與堿水解不同，酸催化水解可發(fā)生在糖鏈中，也可發(fā)生在糖鏈的還原端或者非還原端；因此反應(yīng)速率快，水解產(chǎn)物發(fā)生結(jié)構(gòu)變化的機(jī)率較小。所以在多糖的單糖組成分析中，酸催化降解是目前的主流技術(shù)。

早期催化多糖水解多采用不同體積比的鹽酸和硫酸混合液[29]。但這兩種酸水解操作相當(dāng)復(fù)雜，此外，水解完成后，還需要將水解樣品的pH值調(diào)成中性后再進(jìn)行檢測[30]；另一方面，硫酸水解多糖完成后，最終需要以碳酸鋇中和調(diào)整pH值，且硫酸鋇沉淀過程中往往會(huì)吸附一部分的單糖，使其回收率降低，影響樣品檢測的準(zhǔn)確性。近年來有關(guān)多糖水解的報(bào)道更多采用三氟乙酸或氫氟酸[30-31]，但氫氟酸易腐蝕玻璃容器，且多糖水解過程需要加熱，相比三氟乙酸，氫氟酸在受熱時(shí)更易揮發(fā)，因此在多糖水解過程中三氟乙酸更為常用。Harazono等[30]研究表明，氨基糖在使用三氟乙酸水解的過程中，會(huì)出現(xiàn)一定程度的破毀。由于糖苷鍵對水解的敏感性不同以及解聚成單糖的難易程度不同，因此目前還無一種通用的技術(shù)可使中性以及氨基糖完全水解而不使其出現(xiàn)降解。植物多糖中氨基糖相對較少，因而多采用三氟乙酸催化水解。

2 單糖的化學(xué)修飾技術(shù)

單糖分子本身缺少發(fā)色基團(tuán)，因此一定程度上限制了單糖的分析檢測。為在單糖分析過程中獲得較高的檢測靈敏度，人們逐漸將注意力轉(zhuǎn)移到單糖分子的化學(xué)修飾上。目前，已有多種結(jié)構(gòu)修飾技術(shù)被報(bào)道可用于修飾單糖分子，包括3-甲基硅烷修飾技術(shù)[32]、α-萘胺衍生化技術(shù)[33-34]、糖腈乙酸酯衍生化法[35]、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）衍生化法[36]、1-（4-異丙基）苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-(4-isopropyl) phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PPMP）修飾法[37]、乙酸酐修飾法[38]、2-氨基吖啶酮（2-amino acridone，AMAC）修飾法[39]、苯并吖啶酮-5-乙酰肼（benzoacridinone-5-acetyl hydrazine，BAAH）衍生化法[40]和鄰苯氨基苯甲酸衍生化法[41]。在上述修飾技術(shù)中，由于PMP是一種可以在溫和的條件下與糖反應(yīng)的通用化學(xué)修飾試劑，無需酸催化劑，且產(chǎn)物無唾液酸的異構(gòu)，因此多數(shù)單糖檢測使用PMP做為修飾物。雖然PMP修飾的單糖最初只用于高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測[42]，但后來成功地應(yīng)用于毛細(xì)管電泳[43]、毛細(xì)管區(qū)帶電泳[44]、膠束電動(dòng)色譜[45]和離子交換毛細(xì)管電動(dòng)色譜[46]等檢測技術(shù)中。

然而，上述化學(xué)修飾技術(shù)均存在不足，即果糖無法修飾，而果糖是天然產(chǎn)物多糖，尤其是植物多糖組成中非常常見且含量較高的一種單糖。另外，甘露醇和山梨醇也無法使用上述常見的修飾試劑修飾，這就極大地降低了化學(xué)修飾法在檢測天然產(chǎn)物多糖，尤其是植物多糖中的可信度。后面將以PMP修飾葡萄糖為例逐一分析單糖修飾的機(jī)理，以及果糖、甘露醇及山梨醇等不能被修飾的機(jī)理。

圖1 堿性介質(zhì)中PMP轉(zhuǎn)變?yōu)橛H核試劑的機(jī)理Fig. 1 Mechanism of PMP conversion to pro-nuclear agent in alkaline medium

如圖1所示，PMP分子結(jié)構(gòu)中，2-位的氮原子和羰基氧原子有較強(qiáng)的電負(fù)性。由于在堿性介質(zhì)中，缺少如H+一類的正電荷去中和2-位的氮原子和羰基氧原子上的電負(fù)性，因此，這兩個(gè)基團(tuán)的電負(fù)性誘導(dǎo)吡唑環(huán)上電子轉(zhuǎn)移。4-位碳原子上電子云密度減小，最終造成氫鍵斷裂，氫以正離子的形式離開吡唑環(huán)，與OH-結(jié)合形成一個(gè)水分子，而PMP則形成一個(gè)以4-位碳為活性中心的親核試劑。

單糖是以環(huán)狀結(jié)構(gòu)在堿性溶液中與親核試劑發(fā)生反應(yīng)的[37,47-48]。在溶液中，單糖主要以環(huán)狀形式存在，且單糖半縮醛在堿性介質(zhì)中更穩(wěn)定，在酸中不穩(wěn)定[49]，這也佐證了上述研究的觀點(diǎn)。但上述研究的觀點(diǎn)很難解釋同為環(huán)狀結(jié)構(gòu)的果糖為何不能被修飾試劑修飾。根據(jù)有機(jī)化學(xué)的相關(guān)理論，單糖分子雖然以環(huán)狀結(jié)構(gòu)為主，但在溶液（或在生物體）中，很多化學(xué)反應(yīng)是通過鏈形結(jié)構(gòu)完成的，鏈?zhǔn)浇Y(jié)構(gòu)盡管比例很小，但在理論和有機(jī)合成應(yīng)用中都十分重要[49]。因此可以推斷，單糖是以鏈狀結(jié)構(gòu)與PMP發(fā)生修飾反應(yīng)的。單糖中的羰基是一個(gè)具有極性的官能團(tuán)，由于氧原子的電負(fù)性比碳原子的大，因此氧帶有負(fù)電性，而碳帶有正電性，親核試劑容易進(jìn)攻帶正電的碳原子，導(dǎo)致羥基的π鍵異裂，而形成兩個(gè)δ鍵，這個(gè)過程就是羰基的親核加成[50]。其反應(yīng)歷程如圖2所示。

圖2 羰基發(fā)生親核反應(yīng)的歷程Fig. 2 Reaction mechanism of nucleophilic substitution of carbonyl group

由此可以看出，PMP親核試劑易與羰基反應(yīng)，而不易與羥基反應(yīng)。甘露醇和山梨醇分子結(jié)構(gòu)中不含羰基，因此PMP不能修飾甘露醇和山梨醇。在常見的單糖分子中，果糖是酮糖，就羰基的活潑程度而言，由于空間位阻和電子效應(yīng)，酮糖活潑程度遠(yuǎn)低于醛糖，因此果糖也不能被PMP修飾。

綜上所述，PMP修飾單糖的過程如圖3所示。首先，在堿性條件下，PMP轉(zhuǎn)變?yōu)橛H核試劑后，PMP吡唑環(huán)的4-位碳原子與極少數(shù)以開鏈形式存在的醛糖在其1-位碳原子上發(fā)生親核反應(yīng)，然后失去一個(gè)水分子，同時(shí)，醛糖1-位碳原子和PMP的4-位碳原子之間形成雙鍵，產(chǎn)生單分子PMP修飾的糖。此后，另一個(gè)處于親核狀態(tài)的PMP分子的4-位碳原子攻擊上一個(gè)PMP吡唑環(huán)與單糖1-位碳之間新形成的雙鍵。最終，2 個(gè)PMP分子和1 個(gè)醛糖分子形成雙PMP衍生單糖；另一方面，以環(huán)狀半縮醛形式存在的醛糖和以開鏈形式存在的醛糖之間存在著相互轉(zhuǎn)化的平衡，開鏈醛糖隨著親核反應(yīng)的減少，以環(huán)狀半縮醛形式存在的醛糖轉(zhuǎn)化成鏈狀結(jié)構(gòu)的醛糖，繼續(xù)與PMP發(fā)生親核反應(yīng)，直到所有單糖均被PMP修飾。

圖3 PMP在堿性介質(zhì)中衍生化修飾L-葡萄糖的機(jī)理Fig. 3 Mechanism of PMP Derivatization reaction of L-glucose in an alkaline medium

Wu Xiaodan[48]和Zhang Ping[37]等的研究中描述，在雙PMP衍生糖中，PMP吡唑環(huán)上的雙鍵是在2-位和3-位碳原子之間。而Guan等[47]的研究則認(rèn)為，在雙PMP衍生糖中，PMP吡唑環(huán)上的雙鍵應(yīng)該是3-位和4-位碳原子之間。如圖3所示，單PMP衍生單糖中，吡唑環(huán)上2-、3-位之間的雙鍵與新形成的雙鍵共軛，后一個(gè)PMP分子的4-位碳原子攻擊單PMP衍生單糖中吡唑環(huán)與單糖1-位碳之間形成的雙鍵的同時(shí)，單PMP衍生物中吡唑環(huán)上2-位氮原子由于電負(fù)性強(qiáng)發(fā)生溶劑分解反應(yīng)，獲得一個(gè)氫原子，而3-位和4-位碳之間形成雙鍵。綜上所述，雙PMP衍生糖中，PMP吡唑環(huán)上的雙鍵應(yīng)該在3-位和4-位碳原子之間，而不是2-位和3-位碳原子之間。

PMP衍生法是當(dāng)前最為普遍的單糖修飾技術(shù)，但PMP修飾的單糖穩(wěn)定性較差，尤其是在低濃度時(shí)，穩(wěn)定性更差，且PMP在弱極性溶劑中的溶解性不高；因此有報(bào)道使用PPMP代替PMP作為修飾試劑，在溶解性方面取得了不錯(cuò)的效果[37]。盡管BAAH[40]、PPMP[37]、乙酸酐[38]、AMAC[39]等修飾試劑及α-萘胺衍生化法[33-34]、糖腈乙酸酯衍生化[35]等方法均有報(bào)道修飾單糖分子用于單糖的檢測，但類似PMP，這些修飾方法也無法突破酮糖和多元醇等常見的單糖及衍生物無法被修飾的限制，因此在植物多糖的單糖組成分析中難以取得可信的結(jié)果。

3 單糖的分離檢測技術(shù)

3.1 毛細(xì)管電泳技術(shù)

多糖的毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis，CE）技術(shù)是帶電粒子在電場力的驅(qū)動(dòng)下，在毛細(xì)管中按其淌度或分配系數(shù)不同進(jìn)行高效、快速分離的電泳技術(shù)[51]，具有樣品用量少、時(shí)間短、靈敏度高、分離效果明顯的特點(diǎn)。CE常用于糖蛋白裂解產(chǎn)生的單糖和寡糖[52]以及既帶電荷又有紫外吸收的糖胺聚糖[53]的測定，對分離帶電荷糖類具有獨(dú)特優(yōu)勢[54]。由于植物多糖水解產(chǎn)生的單糖在水溶液中解離能力極差，只有在強(qiáng)堿條件下才能帶上電荷；因此經(jīng)常使用含硼砂的緩沖液讓單糖在較低pH值條件下帶上足夠的負(fù)電荷。不同的單糖在相同介質(zhì)條件下與硼砂的絡(luò)合物有效淌度之間存在差異，這種差異可以被CE技術(shù)分辨。

3.2 氣相色譜技術(shù)

氣相色譜（gas chromatography，GC）測定目標(biāo)樣品的單糖組成具有靈敏度高、結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)適用于樣品含量較低（如10-8或10-9）的多糖組分分析[55-56]。GC技術(shù)被用于靈芝多糖[57]、鎖陽多糖[58]、猴頭菇多糖[59]、稻殼多糖[60]等多種多糖中單糖組成和連接方式的研究中。但GC分離度有限，難以一次性分開很多種單糖，因此如果組成植物多糖的單糖種類較多，GC往往難以逐一分開，且GC出峰的峰面積重現(xiàn)性不佳；因此常需要添加內(nèi)標(biāo)物以輔助單糖含量的定量分析，這增加了操作的繁瑣程度。

3.3 HPLC技術(shù)

在常用的分離設(shè)備中，HPLC穩(wěn)定性好，色譜柱類型較多，技術(shù)相對成熟，可供選擇的色譜柱和操作方法較多，不需要加內(nèi)標(biāo)物。HPLC的峰面積穩(wěn)定性最好，可操作性最強(qiáng)，因此越來越多的單糖分離使用HPLC技術(shù)[32]。

多糖水解為單糖分子以后，可以不經(jīng)過任何化學(xué)修飾，直接通過合適的LC柱使單糖相互分離，最終由檢測器檢出。由于不經(jīng)過化學(xué)修飾，這種方法操作簡單。但單糖由于自身缺少發(fā)色基團(tuán)，因此對檢測器的要求較為苛刻，經(jīng)常只能使用示差檢測器（refractive index detector，RID）或者蒸發(fā)光散射檢測器（evaporative light scattering detector，ELSD）。同時(shí)檢測器的特殊性又限制了分離手段，例如使用RID或ELSD時(shí)，要求流動(dòng)相必須保持不變，這就意味著單糖分離環(huán)節(jié)中不能使用梯度洗脫，而梯度洗脫是分離過程中非常重要且常用的技術(shù)。等梯度洗脫常導(dǎo)致部分單糖之間難以相互分離、峰形相互重疊。例如HPLC（色譜柱為HPX-87H）是一種常用的單糖檢測技術(shù)[61-62]，但此技術(shù)在分析單糖過程中，半乳糖、木糖、果糖及甘露糖的出峰時(shí)間相同，難以相互分離。而植物多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜、組成的單糖種類較多，因此單獨(dú)使用LC技術(shù)難以準(zhǔn)確檢測全部單糖。

如前文所述，雖然單糖的化學(xué)修飾技術(shù)已經(jīng)發(fā)展了20多年，但目前仍無法突破酮糖和多元醇等常見單糖難以修飾的限制。因此，在植物多糖的單糖組成分析中，單獨(dú)使用此類技術(shù)難以取得可信的結(jié)果。

由于修飾檢測技術(shù)和直接檢測技術(shù)均難以全面檢測植物多糖中的所有單糖。Guo Yuanheng等[63]在研究中發(fā)現(xiàn)，在用離子交換柱（如HPX-87H）分離單糖并以RID作檢測器檢測時(shí)，如果幾種單糖的出峰時(shí)間重疊，則不同單糖的濃度與出峰總面積之間存在著加和效應(yīng)。例如，鼠李糖和甘露醇的出峰時(shí)間重合，將1 mol/L的鼠李糖和1 mol/L的甘露醇溶液混合，其出峰面積與1 mol/L的鼠李糖或1 mol/L的甘露醇十分接近。依此特性，該組研究人員將PMP修飾法和離子交換色譜直接檢測法結(jié)合起來，用于肉蓯蓉多糖中單糖組分分析。其思路是先用PMP修飾所有的酮糖并通過HPLC法測定其含量，然后根據(jù)這些酮糖的含量以及各種單糖在離子交換色譜RID檢測法中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，推算出單糖在色譜圖中所對應(yīng)的峰面積，最后以樣品中疊加峰的總面積減去計(jì)算所得的醛糖的峰面積，得到果糖及甘露醇的虛擬峰面積，根據(jù)這些虛擬峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出果糖和甘露醇的含量。此法雖然操作繁雜，但在現(xiàn)有的技術(shù)條件下，能較快、較準(zhǔn)確地得到植物中盡可能多的單糖組成信息，不失為一種實(shí)用性較強(qiáng)的單糖分析途徑。

3.4 質(zhì)譜技術(shù)

質(zhì)譜（mass spectrum，MS）技術(shù)是一種可以詳細(xì)解析化合物結(jié)構(gòu)特征的分析手段，待測樣品在離子源中電離成不同荷質(zhì)比（z/m）的離子，再利用電場和磁場的雙重作用，使離子發(fā)生速度色散，將各離子分別聚焦，從而得到MS圖。MS與LC或GC技術(shù)聯(lián)用，是糖類化合物分離表征的有效工具，可用于不同類型糖類化合物的定性和定量分析[64-68]。Boldizsar等[69]利用GC-MS技術(shù)分析了香芹果實(shí)和葉子中的黃酮類化合物酶解后產(chǎn)生的糖和糖醇。You Chao等[70]利用GC-MS技術(shù)同步分析了雪樣中痕量的左旋葡萄糖、甘露聚糖和半乳聚糖。Acanski等[71]利用GC-MS技術(shù)分析了不同類型面粉中糖的組成，包括戊糖、己糖和雙糖。HPLC-MS技術(shù)也可以用于糖的分析。Qian Weiliang等[72]等使用HPLC-MS分析了蜂膠樣品中糖的組成。Xu Xianbing等[73]在電噴霧探針的尖端加入鞘液，有效提高了單糖和二糖的電離效率，提高了LC-MS分析的靈敏度。

組成多糖化合物的單糖結(jié)構(gòu)中存在大量異構(gòu)體（例如D型和L型）、異頭構(gòu)型（α構(gòu)型和β構(gòu)型），另外，單糖殘基的連接位置也各有差異。這種高度復(fù)雜的結(jié)構(gòu)降低了常規(guī)方法對糖類化合物結(jié)構(gòu)分析的準(zhǔn)確性。MS技術(shù)通常無法區(qū)分對映異構(gòu)體，因此，被認(rèn)為是“手性失明”技術(shù)。在MS分析技術(shù)中，非對映異構(gòu)體通常產(chǎn)生相似的一級譜圖，而對映異構(gòu)體產(chǎn)生相似的二級譜圖；因此對MS技術(shù)和檢測方法的改進(jìn)十分必要。Nagy等[74]報(bào)道了對24 種己醛糖和2-己酮糖異構(gòu)體的識(shí)別和絕對構(gòu)型檢測，包括葡萄糖、古洛糖、阿洛糖、阿卓糖、半乳糖、艾杜糖、塔羅糖、甘露糖、果糖、阿洛酮糖、山梨糖和塔格糖的D型和L型對映異構(gòu)體，通過使用特定的固定配體動(dòng)力學(xué)組合，產(chǎn)生足夠明顯的能量差異，實(shí)現(xiàn)對24 種己糖的手性識(shí)別，據(jù)報(bào)道該技術(shù)可以用于準(zhǔn)確表征未知來源的任意單糖。MS技術(shù)雖然有其自身的優(yōu)勢，但其設(shè)備費(fèi)用昂貴、操作相對繁瑣，使用受到一定程度的限制。

4 結(jié) 語

單糖組成的分析未來在植物藥物、植物活性多糖甚至中藥材原料的鑒定等領(lǐng)域?qū)?huì)扮演重要的角色。本文詳述了植物多糖的單糖組成分析過程中，水解、分離、檢測等各環(huán)節(jié)的技術(shù)發(fā)展的最新進(jìn)展。在植物多糖的水解環(huán)節(jié)中，目前主流的技術(shù)是酸水解，但隨著生物技術(shù)和酶工程的發(fā)展，利用酶的多樣性和高度特異性，未來有可能從自然界中分離得到甚至人為改造或設(shè)計(jì)出各種適宜的多糖水解酶，這些酶可以切斷某些特定序列的多糖片段，或者打開某些特定構(gòu)型糖苷鍵（α構(gòu)型和β構(gòu)型），或者從特定的位置（如1-位、6-位、4-位或者3-位，目前類似的酶如1,4-糖苷酶或1,6-糖苷酶）斷開多糖的支鏈，根據(jù)所得信息推斷糖鏈結(jié)構(gòu)，將會(huì)使多糖中單糖組成和連接方式的分析更為方便。隨著酶生物制備和酶固定化技術(shù)的發(fā)展，未來有可能大幅降低酶的成本和提高酶重復(fù)使用的次數(shù)，從而有可能實(shí)現(xiàn)以溫和高效的酶水解方式取代現(xiàn)有的酸水解技術(shù)。在單糖相互分離環(huán)節(jié)，分離技術(shù)快速發(fā)展，有望在未來開發(fā)出一款不需要對單糖進(jìn)行修飾，就能一次性分離所有常見單糖的色譜技術(shù)，以替代現(xiàn)有的修飾法檢測技術(shù)，從而大大簡化單糖的分析檢測。

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Recent Advances in Analytical Techniques for Monosaccharide Composition of Plant Polysaccharides

GUO Yuanheng1,2, ZHANG Lijun1,2, CAO Lili1, CHEN Jinjin1, LIU Boyan1,2, ZHAO Qingsheng1, ZHAO Bing1,*
(1. Division of Bioref i nery Engineering, State Key Laboratory of Biochemical Engineering, Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Plant polysaccharides are important medicinal and food resources. Quantitative analysis of the monosaccharide composition of plant polysaccharides plays a fundamental role in the investigation of polysaccharide structures and characteristics. The analytical process includes the degradation of plant polysaccharides, and the separation and detection of monosaccharides. This article reviews recent research on the degradation of plant polysaccharides and the chemical modif i cation, separation and detection of the resulting monosaccharides, which will provide a theoretical basis for further study of plant polysaccharides.

plant polysaccharides; monosaccharide composition; quantitative analysis

10.7506/spkx1002-6630-201801049

TS207.3

A

1002-6630（2018）01-0326-07

郭元亨, 張利軍, 曹麗麗, 等. 植物多糖中單糖組成分析技術(shù)的研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2018, 39(1): 326-332.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201801049. http://www.spkx.net.cn

GUO Yuanheng, ZHANG Lijun, CAO Lili, et al. Recent advances in analytical techniques for monosaccharide composition of plant polysaccharides[J]. Food Science, 2018, 39(1): 326-332. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201801049. http://www.spkx.net.cn

2016-10-06

阿拉善肉蓯蓉產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)研究及應(yīng)用項(xiàng)目（中科）（KFA2013-189）；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（21506220）

郭元亨（1984—），男，博士，研究方向?yàn)楦叨怂幱弥参镔Y源的生化煉制。E-mail：guoyuanheng@163.com

*通信作者簡介：趙兵（1984—），男，研究員，博士，研究方向?yàn)橹参镔Y源開發(fā)利用及植物細(xì)胞工程。E-mail：bzhao@home.ipe.ac.cn