周炎，丁松爽，趙莉，趙世民，史宏志，楊惠娟

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 國(guó)家煙草栽培生理生化基地，河南 鄭州 450002；2 河南省煙草公司 洛陽市公司，河南 洛陽 471026

隨著全球的氣候變暖，人類及動(dòng)植物所面臨的生態(tài)問題愈加嚴(yán)峻。對(duì)于作物生長(zhǎng)來說，水資源短缺導(dǎo)致的干旱問題正是亟待解決的問題之一[1]。干旱導(dǎo)致植物失水，體內(nèi)活性氧積累，對(duì)組織造成傷害，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。煙草是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，也是常用的模式植物。研究煙草對(duì)干旱脅迫的生理響應(yīng)可為培育煙草耐旱品種提供理論依據(jù)，也可為其他作物的抗旱研究提供思路。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)近年來在多領(lǐng)域均有廣泛應(yīng)用，植物的干旱脅迫也是較為熱門的研究領(lǐng)域，但目前以煙草為對(duì)象，以轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?yàn)槭侄窝芯科鋵?duì)干旱脅迫信號(hào)響應(yīng)的文章尚不多見。

LY1306是由系統(tǒng)選育的G80變異株系依次與K326、89112雜交育成的適應(yīng)性強(qiáng)、抗性好、易烘烤的烤煙品系，該品系較適應(yīng)丘陵山區(qū)的氣候條件，在干旱少雨、灌溉不充分的地區(qū)生長(zhǎng)較好，表現(xiàn)出明顯的抗旱特性[2]。對(duì)LY1306品系的抗旱機(jī)理的研究可以深入了解該品系的抗旱特性。本文通過PEG模擬干旱條件并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析，闡述了干旱脅迫條件下LY1306品系煙葉的生理變化及應(yīng)激響應(yīng)基因表達(dá)組學(xué)特征，繼而為煙草抗旱育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)于2015年至2016年于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家煙草栽培生理生化基地實(shí)施， 供試品系為L(zhǎng)Y1306，設(shè)置3個(gè)處理，分別是15%PEG-6000處理0 h、16 h、24 h，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。運(yùn)用漂浮育苗培育LY1306 46 d，煙草幼苗長(zhǎng)至4片葉后移栽至珍珠石中，以MS培養(yǎng)基（不含糖，不含瓊脂）為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng)。移栽后23 d，選取長(zhǎng)勢(shì)相同的煙株進(jìn)行處理。分別在移入15%PEG-6000前和移入后16 h、24 h時(shí)，選取煙草葉片（統(tǒng)一選取大于5 cm葉片，從上往下數(shù)第4和第5片葉子），液氮速凍后，保存于-70℃ 冰箱。并將3個(gè)重復(fù)樣品等量混合，提取RNA，對(duì)其進(jìn)行后續(xù)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。另外選取長(zhǎng)勢(shì)相同的未處理煙苗作為對(duì)照組（CK），在每次取樣前分別拍照記錄實(shí)驗(yàn)組和處理組的葉片狀態(tài)。

1.2 煙草生理指標(biāo)測(cè)定

1.2.1 葉片水勢(shì)測(cè)定

采用小液流法測(cè)定葉片水勢(shì)。

1.2.2 抗氧化酶活性測(cè)定

超氧化物歧化酶（SOD），過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）的活性測(cè)定均采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的相應(yīng)微量法試劑盒。

1.2.3 丙二醛（MDA）和脯氨酸（PRO）含量測(cè)定

分別采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司的丙二醛(malondialdehyde，MDA)微量法試劑盒和脯氨酸（PRO）微量法試劑盒測(cè)定樣品中MDA和PRO含量。

1.3 煙草葉片RNA 提取及測(cè)序

樣品總RNA提取由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司進(jìn)行。DNase消化DNA后，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA；加入打斷試劑將mRNA打斷成短片段，以打斷后的mRNA為模板, 用六堿基隨機(jī)引物合成一鏈cDNA，二鏈合成反應(yīng)體系合成二鏈cDNA，在cDNA二鏈合成時(shí)以dUTP代替dTTP，連接不同接頭，再利用UNG酶法將含有dUTP的一條鏈進(jìn)行消化，只保留連接不同接頭的cDNA一鏈；采用試劑盒純化cDNA一鏈；純化的cDNA一鏈進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測(cè)序接頭，再進(jìn)行片段大小選擇，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增；構(gòu)建好的文庫(kù)用Agilent 2100 Bioanalyzer質(zhì)檢合格后，使用Illumina HiSeqTM 2500測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。

1.4 RNA-Seq 序列的分析

由Illumina HiSeqTM2500測(cè)序所得的數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)控（QC）過濾得到clean reads，用tophat/bowtie2將clean reads比對(duì)到參考序列。再通過統(tǒng)計(jì)reads在參考序列上的分布情況及覆蓋度，判斷比對(duì)結(jié)果是否通過第二次質(zhì)控(QC of alignment)。通過后進(jìn)行一系列后續(xù)分析，依據(jù)DESeq[3]軟件包中的NB（負(fù)二項(xiàng)分布檢驗(yàn)的方式）對(duì)reads數(shù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，并采用basemean值來估算表達(dá)量。并從基因表達(dá)結(jié)果中，篩選FC＞2，且P＜=0.05的基因?yàn)闃悠烽g差異表達(dá)的基因。

1.5 差異表達(dá)基因的注釋及分析

對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO（Gene Ontology）富集分析，結(jié)合GO注釋結(jié)果對(duì)其功能進(jìn)行描述。統(tǒng)計(jì)每個(gè)GO條目中所包括的差異基因個(gè)數(shù)，并用超幾何分布檢驗(yàn)方法計(jì)算每個(gè)GO條目中差異基因富集的顯著性。利用KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異基因進(jìn)行Pathway分析，并用超幾何分布檢驗(yàn)的方法計(jì)算每個(gè)Pathway條目中差異基因富集的顯著性。分析結(jié)果top20按照每個(gè)條目對(duì)應(yīng)的-log10Pvalue排序，同時(shí)過濾掉包含差異基因數(shù)目小于3的條目。

2 結(jié)果與分析

2.1 15%PEG-6000處理前后烤煙LY1306品系葉片形態(tài)和水勢(shì)變化

經(jīng)過對(duì)比可以看出（圖1），PEG處理16 h后，烤煙LY1306品系葉片出現(xiàn)少量失水癥狀，葉尖發(fā)軟。處理24 h后，葉尖葉緣出現(xiàn)失水萎蔫癥狀。但總體來說，與對(duì)照組相比萎蔫癥狀不明顯。

圖1 15%PEG-6000處理不同時(shí)間對(duì)烤煙LY1306品系葉片狀態(tài)的影響Fig.1 Influence of 15% PEG-6000 treatment of different duration on leaf status

在實(shí)驗(yàn)中，葉片水勢(shì)隨著干旱處理時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，且前16 h水勢(shì)下降較多，比0 h下降了20.6%，16 h后水勢(shì)下降較少，24 h比0 h降低了26.5%（圖2）。

圖2 15%PEG-6000處理不同時(shí)間對(duì)烤煙LY1306品系葉片水勢(shì)的影響Fig.2 Influence of 15% PEG-6000 treatment of different duration on leaf water potential

2.2 15%PEG-6000模擬干旱脅迫對(duì)烤煙LY1306品系抗氧化酶活性的影響

實(shí)驗(yàn)表明（圖3，圖4），隨干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，SOD和POD活性隨干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)均呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)，但上升速率不同。SOD活性前期上升緩慢，后期迅速上升，16 h與24 h時(shí)分別是0 h的1.13倍和2.75倍。POD活性隨干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增強(qiáng)，且前期上升速度與SOD相比更快。16 h、24 h時(shí)POD活性分別為0 h的2.56倍和4.2倍。與SOD、POD相反，CAT活性隨干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸下降，且下降速度先慢后快（圖5）。16 h與24 h的CAT活性分別比0 h下降了4.7%和22.8%。

圖3 15%PEG-6000處理下LY1306葉片中SOD活性變化Fig.3 changes of SOD activity in LY1306 leaves under the treatment of 15%PEG-6000

圖4 15%PEG-6000處理下LY1306葉片中POD活性變化Fig.4 changes of POD activity in LY1306 leaves under the treatment of 15%PEG-6000

圖5 15%PEG-6000處理下LY1306葉片中CAT活性變化Fig.5 changes of CAT activity in LY1306 leaves under the treatment of 15%PEG-6000

2.3 15%PEG-6000模擬干旱脅迫對(duì)烤煙LY1306品系丙二醛和脯氨酸含量的影響

LY1306葉片中的丙二醛（MDA）含量呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)（圖6），其峰值出現(xiàn)在16 h。葉片中脯氨酸含量隨著干旱處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)出先上升后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)（圖7）。具體表現(xiàn)為24 h＞16 h＞0 h。脯氨酸含量在干旱脅迫前16 h迅速增長(zhǎng)，比0 h增加了2.8倍；16 h后增長(zhǎng)緩慢，處理24 h葉片脯氨酸含量?jī)H略高于16 h，這與葉片水勢(shì)的變化趨勢(shì)基本吻合。

圖6 15%PEG-6000處理下LY1306葉片中丙二醛（MDA）含量變化Fig.6 changes of MDA content in LY1306 leaves under the treatment of 15%PEG-6000

圖7 15%PEG-6000處理下LY1306葉片中脯氨酸（PRO）含量變化Fig.7 changes of PRO content in LY1306 leaves under the treatment of 15%PEG-6000

上述結(jié)果表明，15%PEG模擬的干旱脅迫下，烤煙品系LY1306葉片中POD和SOD升高較為明顯，但對(duì)干旱信號(hào)的響應(yīng)速度不同；脯氨酸在干旱脅迫發(fā)生后迅速響應(yīng)并大量積累。

2.4 15%PEG-6000處理后LY1306葉片轉(zhuǎn)錄組表達(dá)分析

3個(gè)樣本（15%PEG-6000處理0 h、16 h、24 h）經(jīng)測(cè)序后分別得到原始序列52493886，53206758，53175198條，經(jīng)質(zhì)控過濾后分別得到干凈序列51423972，51969504，52153830條，其中比對(duì)上參考序列的分別有49135898，49576507，49257835條，占總干凈序列的百分比分別為95.55%，95.39%，94.44%，說明測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量良好。

經(jīng)差異表達(dá)分析，相比于0 h，15%PEG處理16 h的樣本共篩選出3547個(gè)差異表達(dá)基因，其中1589個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，1958個(gè)基因表達(dá)下調(diào)；PEG處理24 h的樣本共篩選出3141個(gè)差異表達(dá)基因，其中1579個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，1562個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。

2.5 PEG處理后葉片差異表達(dá)基因的GO分析

差異表達(dá)基因GO分類，共對(duì)應(yīng)到生物過程（Biological process，BP）、細(xì)胞組成（Cellular component，CC）和分子功能（Molecular Function，MF）3大類。15%PEG處理16 h樣本的差異基因中，上調(diào)基因共注釋到1331個(gè)條目（圖8）。其中注釋到生物過程、細(xì)胞組成和分子功能的條目數(shù)量分別為741、138和452個(gè)。15%PEG處理24 h的樣本中上調(diào)基因共注釋到1507個(gè)條目（圖9），其中注釋到生物過程、細(xì)胞組成、分子功能的條目數(shù)分別為839、189、479個(gè)。

從圖中可以看出，生物過程中的鹽脅迫響應(yīng)（response to salt stress）、赤霉素響應(yīng)（response to gibberellin），細(xì)胞成分中的細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)（perinuclear region of cytoplasm）和分子功能中的轉(zhuǎn)錄因子活性（transcription factor activity）在處理16 h和24 h樣本中均表現(xiàn)為上調(diào)。

2.6 PEG處理后葉片差異表達(dá)基因的KEGG代謝通路分析

經(jīng)過KEGG代謝通路分析（圖10），15%PEG處理16 h的樣本中，差異表達(dá)基因被富集到184個(gè)代謝通路，其中112個(gè)通路發(fā)生上調(diào)，141個(gè)通路發(fā)生下調(diào)；顯著富集（P＜0.05）的通路為36個(gè)，其中28個(gè)上調(diào)，31個(gè)下調(diào)。PEG處理24 h的樣本差異表達(dá)基因被富集到164個(gè)通路，其中上調(diào)通路117個(gè)，下調(diào)通路128個(gè)；其中P＜0.05發(fā)生顯著富集的共有38個(gè)，30個(gè)上調(diào)通路，35個(gè)下調(diào)通路?？煽闯鲭S著干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，顯著富集的通路數(shù)目無論上調(diào)還是下調(diào)均有所增加。

圖8 15%PEG-6000處理16 h后烤煙LY1306品系相對(duì)于0 h上調(diào)表達(dá)基因GO分析Fig.8 GO analysis of up-regulated genes in LY1306 the flue-cured tobacco line under the treatment of 15%PEG-6000 for 16 h

圖9 15%PEG-6000處理24 h后烤煙LY1306品系相對(duì)于0 h上調(diào)表達(dá)基因GO分析Fig.9 GO analysis of up-regulated genes in LY1306 the flue-cured tobacco line under the treatment of 15%PEG-6000 for 24 h

經(jīng)分析，15%PEG處理16 h的樣品中，苯丙烷生物合成（Phenylpropanoid biosynthesis）、苯丙氨酸代謝（Phenylalanine metabolism）、亞油酸代謝（Linoleic acid metabolism）、萜類合成（Monoterpenoid biosynthesis）、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（Plant hormone signal transduction）、氮代謝（Nitrogen metabolism）和α-亞麻酸代謝（alpha-Linolenic acid metabolism）等通路上調(diào)。

苯丙烷生物合成（ko00940）和苯丙氨酸代謝（ko00360）通路中苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）、等發(fā)生上調(diào)。亞油酸代謝（ko00591）和α-亞麻酸代謝（ko00592）通路中，脂氧合酶（lipoxygenase，LOX2S）等基因表達(dá)上調(diào)。植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（ko04075）中的脫落酸、乙烯、茉莉酸途徑均上調(diào)表達(dá)。氮代謝（ko00910）中碳酸酐酶（carbonic anhydrase，CA）基因表達(dá)上調(diào)。

15%PEG處理24 h的樣品中，發(fā)生上調(diào)的代謝通路為植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（Plant hormone signal transduction）、抗原加工提呈（Antigen processing and presentation）、淀粉蔗糖代謝（Starch and sucrose metabolism）、磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)（Phosphatidylinositol signaling system）和精氨酸脯氨酸代謝（Arginine and proline metabolism）等。

植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（ko04075）中，脫落酸途徑明顯表達(dá)上調(diào)。生長(zhǎng)素途徑中的生長(zhǎng)素響應(yīng)因子（auxin response factor,ARF）基因和茉莉酸途徑的MYC2轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)上調(diào)。抗原加工提呈（ko04612）通路中免疫系統(tǒng)的核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear transcription factor Y，NFY）等表達(dá)上調(diào)。淀粉蔗糖代謝（ko00500）中6-磷酸海藻糖合成酶（trehalose 6-phosphate synthase，2.4.1.15，otsA）、α-淀粉酶（alpha-amylase ，amyA ）、β-淀粉酶（beta-amylase）等表達(dá)上調(diào)。精氨酸脯氨酸代謝（ko00330）中的谷氨酸-5-激酶（glutamate 5-kinase，proB）、δ-1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（delta-1-pyrroline-5-carboxylate synthetase，P5CS）、1-吡咯啉-5-羧酸脫氫酶（1-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase）、脯氨酸脫氫酶（ proline dehydrogenase，putA）等基因表達(dá)上調(diào)。

圖10 15%PEG處理后烤煙LY1306品系相對(duì)于0 h上調(diào)表達(dá)基因KEGG代謝通路分析Fig.10 KEGG pathway analysis of up-regulated genes in LY1306 the flue-cured tobacco line under the treatment of 15%PEG-6000.

3 討論

3.1 15%PEG-6000模擬干旱脅迫下烤煙LY1306品系中SOD和POD是主要應(yīng)激酶

當(dāng)植物遭受干旱脅迫時(shí)，體內(nèi)原有的氧化平衡被破壞，細(xì)胞膜脂發(fā)生強(qiáng)烈的過氧化作用，MDA大量積累，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害，導(dǎo)致植株失水甚至死亡[4]，SOD、POD、CAT這幾種酶彼此協(xié)調(diào)作用，提高了植株對(duì)活性氧清除的能力[5]。SOD是活性氧清除的第一步,它將活性氧歧化成H2O2，再由POD和CAT進(jìn)一步分解[6]。有研究表明，適度的干旱脅迫誘導(dǎo)能夠提高植物體內(nèi)抗氧化酶活性，降低植物細(xì)胞膜脂過氧化程度[7-8]。

脯氨酸是植物體內(nèi)最有效的一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，有助于植物細(xì)胞和組織的持水和防止脫水。Kramble等最早在萎蔫的黑麥草葉片中發(fā)現(xiàn)脯氨酸大量積累。有研究表明，水稻幼苗在干旱脅迫下脯氨酸含量增加，并與丙二醛和質(zhì)膜透性呈極顯著相關(guān)，脯氨酸還具有清除活性氧的作用[9-11]。

總的來說烤煙LY1306品系中POD、SOD是響應(yīng)PEG模擬干旱的主要抗氧化酶。脯氨酸能迅速響應(yīng)外界信號(hào)并大量積累，其產(chǎn)生機(jī)制受反饋調(diào)節(jié)，將葉片水勢(shì)維持在較低水平，防止大量失水并清除部分活性氧，減少細(xì)胞損傷。水勢(shì)的變化與脯氨酸變化基本吻合。

3.2 15%PEG-6000處理后烤煙LY1306品系有多條抗旱相關(guān)通路上調(diào)

15%PEG處理16 h的葉片中，影響光合作用放氧反應(yīng)和固碳過程的半乳糖脂及碳酸酐酶（CA）表達(dá)上調(diào)，維持了干旱脅迫下光合速率的相對(duì)穩(wěn)定[12-13]。

L-苯丙氨酸代謝通路中上調(diào)的苯丙氨酸解氨酶（PAL）是連接初級(jí)代謝和苯丙烷類代謝、催化苯丙烷類代謝第一步反應(yīng)的酶，也是苯丙氨酸代謝途徑的關(guān)鍵酶和限速酶[14]，還可以參與植保素的合成，包括酚類、異黃酮類和萜烯類，提高植物防御反應(yīng)。許多植物激素如生長(zhǎng)素、赤霉素和乙烯都可誘導(dǎo)植物PAL基因的表達(dá)。GO及KEGG分析顯示赤霉素等植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑表達(dá)上調(diào)。研究擬南芥幼苗對(duì)滲透脅迫的耐受性發(fā)現(xiàn)，赤霉素可響應(yīng)非生物脅迫信號(hào)，使植物生長(zhǎng)停滯以增強(qiáng)脅迫耐受性[15-16]。

在亞油酸和α-亞麻酸代謝通路中上調(diào)表達(dá)的脂氧合酶（LOX）在響應(yīng)干旱脅迫過程中有重要作用。在植物中，LOX主要以亞油酸、亞麻酸為底物，參與調(diào)控與生成一些抗性信號(hào)分子如ABA、茉莉酸（JA）及植物揮發(fā)性物質(zhì)等[17-22]。JA不僅本身作為信號(hào)分子參與了對(duì)干旱脅迫的防御反應(yīng)，還能誘導(dǎo)PAL等抗逆相關(guān)酶基因的表達(dá)，同時(shí)能提高植物體內(nèi)PRO含量和SOD、POD等抗氧化酶活性，提高滲透調(diào)節(jié)能力[23-24]。

本實(shí)驗(yàn)16 h處理中KEGG植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中ABA途徑上調(diào)表達(dá)。ABA是干旱脅迫下植物體內(nèi)主要的信號(hào)傳導(dǎo)物質(zhì)，與JA相似的是，ABA也能夠促進(jìn)PRO的積累，清除部分活性氧；同時(shí)，ABA能夠促使蔗糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖和果糖,有利于提高植物的滲透調(diào)節(jié)能力[25-29]，也有研究表明，在非生物脅迫條件下，ABA可以促進(jìn)碳水化合物的積累[30]，GO結(jié)果中上調(diào)的糖原（淀粉）合酶活性與之相符。此外ABA還可以通過促進(jìn)氣孔關(guān)閉減少蒸騰失水。

PEG處理24 h樣本的轉(zhuǎn)錄組結(jié)果顯示，植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中ABA、 JA、IAA等上調(diào)，與PEG處理16 h的樣本相似。此外，樣本上調(diào)表達(dá)通路還有脯氨酸代謝、糖類合成及代謝、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控等。

KEGG分析表明，精氨酸脯氨酸代謝通路中參與脯氨酸合成的谷氨酸激酶、δ-1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）和負(fù)責(zé)脯氨酸代謝為谷氨酸的1-吡咯啉-5-羧酸脫氫酶（P5CDH）、脯氨酸脫氫酶基因發(fā)生上調(diào)。谷氨酸途徑合成脯氨酸主要是通過谷氨酸激酶（GK）催化生成中間產(chǎn)物△1-吡咯啉-5-羧酸（P5C），再經(jīng)由P5CS和P5CR催化生成脯氨酸[31]。合成途徑中的關(guān)鍵酶GK和P5CS受到脯氨酸的反饋調(diào)控，將脯氨酸濃度控制在適當(dāng)水平[32]。脯氨酸代謝過程中，先經(jīng)由脯氨酸脫氫酶催化為△1-二氫吡咯-5-羧酸（P5C），再由P5CDH催化下氧化為谷氨酸。同時(shí)Iyers等[33]研究發(fā)現(xiàn)，P5C等脯氨酸代謝中間產(chǎn)物可誘導(dǎo)水稻細(xì)胞中部分滲透調(diào)節(jié)基因的高效表達(dá)。

GO分類及KEGG代謝通路分析顯示，PEG處理24 h樣本中，糖類合成及代謝活性也發(fā)生上調(diào)。蔗糖合酶、6-磷酸海藻糖合成酶、β-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶和葡萄糖6-磷酸異構(gòu)酶（GPI）基因表達(dá)上調(diào)。蔗糖、海藻糖合成量升高，大分子淀粉、纖維素被降解為還原糖，參與植物的滲透調(diào)節(jié)。PEG處理16 h的樣本淀粉合酶活性在ABA誘導(dǎo)下上升，隨著干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，大分子糖類逐漸分解，作為滲調(diào)物質(zhì)抵抗干旱脅迫。同時(shí)，GPI參與的糖酵解過程可為植株供能。

此外，GO分析顯示CCAAT-盒結(jié)合因子（CBF）的核轉(zhuǎn)錄因子NFY基因表達(dá)量上調(diào)。NFY廣泛存在于植物中，并可參與調(diào)節(jié)多種生理進(jìn)程，如逆境脅迫、葉綠體發(fā)育和光合作用等[34]。有研究發(fā)現(xiàn)[35]，與野生型對(duì)照相比，遺傳轉(zhuǎn)化NF-Y家族轉(zhuǎn)錄因子TaNFYB3;1的轉(zhuǎn)基因煙草植株，在干旱和鹽分脅迫處理后，植株的形態(tài)和干物質(zhì)重均顯著提高，葉綠素、可溶性蛋白含量明顯增加，SOD、POD活性顯著增強(qiáng)。

同時(shí)有研究表明[36-37]，一些植物激素如乙烯、赤霉素、脫落酸等也能誘導(dǎo) SOD 、POD基因的表達(dá), 其中 ABA對(duì)基因表達(dá)調(diào)控的作用尤為明顯；此外，轉(zhuǎn)錄因子對(duì)SOD、POD基因的表達(dá)調(diào)控作用也十分顯著。GO及KEGG分析表明，不同處理時(shí)間的LY1306葉片中植物激素及轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控發(fā)生上調(diào)，與SOD，POD活性的上升趨勢(shì)相符。

綜上所述，植物激素轉(zhuǎn)導(dǎo)、糖類合成代謝、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控是兩個(gè)處理時(shí)間共同上調(diào)的代謝通路，直接或間接地調(diào)控了SOD、POD及脯氨酸等抗旱相關(guān)物質(zhì)基因的表達(dá)。除此之外，15%PEG-6000處理16 h時(shí)，烤煙LY1306品系還主要通過脯氨酸生成和糖類合成調(diào)節(jié)滲透勢(shì)，亞油酸代謝和次生代謝來響應(yīng)干旱脅迫；PEG處理24 h時(shí)，LY1306主要通過脯氨酸、磷脂、糖類代謝等途徑來響應(yīng)干旱脅迫。可以看出，LY1306有多種應(yīng)對(duì)干旱脅迫的方式，各通路互為補(bǔ)充，互相串聯(lián)，共同對(duì)抗不同程度的干旱脅迫。

4 結(jié)論

在15%PEG模擬的干旱脅迫條件下，烤煙LY1306品系能迅速通過植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、亞油酸代謝和次生代謝等多種方式放大并傳遞脅迫信號(hào)，誘導(dǎo)SOD、POD和脯氨酸的表達(dá)，導(dǎo)致干旱脅迫下煙葉SOD、POD活性和脯氨酸含量大大增加。同時(shí)轉(zhuǎn)錄因子等途徑也被激活，對(duì)抵御干旱起到一定的作用。但烤煙LY1306品系的具體抗旱機(jī)制仍有待深入研究。

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