王俊，史宏志，靳彤，張夢(mèng)玥，周駿，楊惠娟，白若石

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家煙草栽培生理生化研究基地/煙草行業(yè)煙草栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/煙草農(nóng)業(yè)減害研究中心，河南 鄭州450002；2 上海煙草集團(tuán)北京卷煙廠，北京100024

煙草特有亞硝胺（Tobacco Specific N-nitrosamines,TSNAs）是由煙草生物堿與含氮氧化物發(fā)生亞硝化反應(yīng)生成的主要存在于煙葉和煙氣中的有害成分，主要有N-亞硝基降煙堿（NNN）、4-(N-甲基-亞硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮（NNK）、N-亞硝基新煙草堿（NAT）和N-亞硝基假木賊堿（NAB）4種[1-3]。一般來說鮮煙葉中不含TSNAs或含量極低，TSNAs的形成和積累主要在調(diào)制和貯藏過程中[4]。NNN、NAT和NAB分別由降煙堿、新煙草堿和假木賊堿發(fā)生亞硝化反應(yīng)生成，而NNK則是煙堿的氧化產(chǎn)物假氧環(huán)煙堿（PON）進(jìn)一步發(fā)生亞硝化反應(yīng)的產(chǎn)物[5]。調(diào)制過程中，煙葉的硝酸鹽被微生物還原為亞硝酸鹽進(jìn)而與生物堿作用形成TSNAs[6]。調(diào)制后煙葉生物堿含量及組成與貯藏過程中TSNAs的形成和積累密切相關(guān)[7-9]，煙草類型[10-11]、品種[4,8]、調(diào)制方式[12-13]和晾制的溫、濕度條件[14]對(duì)煙葉生物堿含量有重要影響。Lewis等[15]報(bào)道白肋煙TSNAs含量高于烤煙，是由于其兩個(gè)隱性基因位點(diǎn)（Yb1和Yb2）導(dǎo)致生物堿水平提高，氮利用效率降低，葉片硝態(tài)氮含量增加。煙草栽培品種的煙堿轉(zhuǎn)化程度和降煙堿含量與NNN和TSNAs總量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系[16-17]。Cai等[18]研究表明調(diào)制過程中，受煙堿脫甲基酶基因CYP82E4的影響，晾曬煙中NNN的形成與降煙堿密切相關(guān)，而NNK、NAT和NAB幾乎不受相應(yīng)的前體物影響。

白肋煙的貯藏階段是TSNAs形成的又一個(gè)重要時(shí)期，煙葉貯藏過程TSNAs含量可提高50%至數(shù)倍，尤其在高溫季節(jié)TSNAs的積累更為迅速[19]。De Roton等[20]報(bào)道貯藏在環(huán)境溫度下的白肋煙粉碎樣品，6個(gè)月后TSNAs含量由1.3～1.4 μg/g增加到8.1～9.5 μg/g。白肋煙TSNAs含量隨著貯藏時(shí)間的延長大幅增加[19]；貯藏后TSNAs增加量與溫度和硝態(tài)氮含量有密切關(guān)系[21]，高溫下硝態(tài)氮產(chǎn)生氮氧化物可能是造成TSNAs積累的主要原因。而關(guān)于TSNAs另一前體物生物堿對(duì)貯藏過程中TSNAs形成和積累的影響尚不清楚。本研究通過TN86不同煙堿轉(zhuǎn)化株系在相同的種植、田間管理以及晾制方式下，選擇總生物堿含量相近，而生物堿組成差異明顯的煙葉樣品進(jìn)行高溫貯藏處理，探究煙葉生物堿含量對(duì)貯藏過程中TSNAs形成的影響，為進(jìn)一步揭示煙葉貯藏過程中TSNAs的形成機(jī)理和制定抑制煙葉貯藏過程中TSNAs形成的有效技術(shù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和地點(diǎn)

本實(shí)驗(yàn)于2014年在云南省大理州進(jìn)行，以經(jīng)鑒別具有不同煙堿轉(zhuǎn)化率PNC（Percentage nicotine conversion）的TN86株系為試驗(yàn)材料，包括改良種1（PNC＜5）、低轉(zhuǎn)化株系（5＜PNC＜20）、高轉(zhuǎn)化株系1（PNC＞20）、高轉(zhuǎn)化株系2（PNC＞50）[22]。

1.2 試驗(yàn)方法

田間種植4個(gè)TN86的改良種和轉(zhuǎn)化株系各 100株。供試土壤為壤土，中等肥力。試驗(yàn)田面積約400 m2，密度16500株/ hm2，氮用量225 kg/hm2，N∶P2O5∶K2O比例為l∶l∶3。按常規(guī)方法育苗，5月8日移栽，移栽后30 d在每類改良種和轉(zhuǎn)化株系中隨機(jī)選取20～25株掛牌編號(hào)，共90株。煙葉成熟后，整株砍收，在標(biāo)準(zhǔn)晾房內(nèi)晾制后，每株均單獨(dú)取樣，選取中部葉，切絲測(cè)定其生物堿含量，計(jì)算煙堿轉(zhuǎn)化率。

根據(jù)煙堿轉(zhuǎn)化率（[降煙堿含量/（煙堿含量+降煙堿含量）]×100），將煙株分為非轉(zhuǎn)化株（煙堿轉(zhuǎn)化率低于5%）、低轉(zhuǎn)化株（煙堿轉(zhuǎn)化率5%到20%）、中轉(zhuǎn)化株（煙堿轉(zhuǎn)化率20% ～ 50%）和高轉(zhuǎn)化株（煙堿轉(zhuǎn)化率大于50%）[14]。取樣的90個(gè)煙株中煙堿轉(zhuǎn)化程度差異較大，非轉(zhuǎn)化株占17.8%，低轉(zhuǎn)化株占31.3%，中轉(zhuǎn)化株占27.8%，高轉(zhuǎn)化株為23.3%。選取生物堿總量在4% ～ 6%之間的樣品，根據(jù)煙堿、降煙堿及煙堿轉(zhuǎn)化率的不同分為6組，每組樣品包括4% ～ 6%個(gè)轉(zhuǎn)化株，分別將各組煙絲樣品混合均勻，測(cè)定生物堿、NO3-N、NO2-N和TSNAs的含量。

分別稱取混合后的6組煙絲樣品各20 g，裝入藍(lán)蓋玻璃瓶中，放置到45℃、60%RH恒溫恒濕箱內(nèi)貯藏12 d后取出，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。45℃處理前后煙葉的平均含水率分別為12%和11.6%。

1.3 化學(xué)成分的測(cè)定

煙葉貯藏12 d后進(jìn)行冷凍干燥，磨碎后過250μm篩。

1.3.1 TSNAs含量測(cè)定

樣品送至上海煙草集團(tuán)北京卷煙廠進(jìn)行TSNAs測(cè)定。測(cè)定方法為在線SPE-液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（SPE-LC-MS/MS）法 （SPE-LC：Spark Holland,Symbiosis (Pico)；MS/MS：AB Sciex triple quad 5500）。稱1.0 g煙樣，放入50 mL錐形瓶中，加40μL 4種氘代TSNAs（內(nèi)標(biāo)）溶液（5000 ng/mL）和30 mL 100 mmol/L乙酸銨水溶液，室溫下振蕩（200 r/min）萃取60 min，萃取液過0.45 μm水相濾膜，LC-MS/MS檢測(cè)TSNAs[23]?？俆SNAs是NNN、NNK、NAT和NAB的含量之和。

1.3.2 NO3-N和NO2-N的測(cè)定

NO3-N和NO2-N的測(cè)定采用比色法，參照Crutchfield 和Grove[24]的方法。

1.3.3 生物堿的測(cè)定

在堿性條件下，用甲基叔丁基醚（MTBE）提取200 mg樣品的生物堿，以正十六烷為內(nèi)標(biāo)，參照J(rèn)ack 和Bush的方法[25]，氣相色譜-氫火焰離子化檢測(cè)器（GC-FID）(Agilent 7890A，Agilent Technologies，USA) 定量檢測(cè)4種生物堿的含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel和Origin 8.5進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖。運(yùn)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行相關(guān)分析、偏相關(guān)分析和逐步回歸分析。設(shè)P＜0.05，P＜0.01 。

2 結(jié)果與分析

2.1 白肋煙TN86不同轉(zhuǎn)化株的煙葉TSNAs前體物含量

由表1和圖1可知，TN86不同轉(zhuǎn)化株在相同的栽培方式、施肥量以及取樣和晾制方法的條件下，煙葉的4種生物堿及煙堿轉(zhuǎn)化率株間差異明顯。假木賊堿和新煙草堿的含量較低，樣品間變異性較小。煙葉中煙堿和降煙堿含量稍高，煙株間的差異明顯，其中以降煙堿的變異性最大，最大值為6.21%，最小值僅為0.03%。煙堿含量的變化為0.25%～7.69%，差異較大，這與煙株間煙堿轉(zhuǎn)化率變異程度較高有密切的關(guān)系。取樣的90株樣品中，生物堿總量最高的達(dá)到9.22%，最低的僅為0.76%，其中42%的煙株生物堿總量在4% ～ 6%。

表1 TN86群體生物堿含量及煙堿轉(zhuǎn)化率Tab.1 Alkaloid content and nicotine conversion rate in cured leaves of TN86

圖1 TN86不同煙株調(diào)制后的煙堿轉(zhuǎn)化率Fig.1 Distribution of nicotine conversion rate in individual plants of TN86

為了研究4種生物堿組成的差異對(duì)高溫貯藏過程中TSNAs形成的影響，進(jìn)一步篩選了生物堿含量在4%～6%左右，煙堿和降煙堿含量差異較大，煙堿轉(zhuǎn)化率呈梯度差異的煙葉樣品，分為6組，將組內(nèi)樣品混合均勻后，測(cè)定其生物堿和NO3-N、NO2-N含量。從表2可以看出，隨著煙堿轉(zhuǎn)化率的提高，煙堿含量明顯減少，降煙堿含量逐漸增多，假木賊堿含量較低，且組間無明顯差異。與煙堿和降煙堿的組間差異相比較，6組樣品的總生物堿、NO3-N和NO2-N含量的差異較小。

表2 TN86不同煙堿轉(zhuǎn)化率的分組情況Tab.2 Groups of different nicotine conversion rate in TN86

2.2 生物堿組成差異對(duì)高溫貯藏前后煙葉TSNAs含量的影響

將煙堿和降煙堿含量有較大差異的6組樣品（表2）在45℃高溫貯藏12 d，貯藏前后TSNAs的含量如圖2和圖3所示。貯藏前后，隨著降煙堿和煙堿轉(zhuǎn)化率的提高，煙葉NNN和總TSNAs含量的增長幅度逐漸加大。當(dāng)煙堿轉(zhuǎn)化率為76.7%，TSNAs總量最高，是煙堿轉(zhuǎn)化率為2.8%的2.7倍；45℃貯藏后總TSNAs的增加值最多，高出2.8%處理時(shí)增加值411 ng/g。煙葉NNK的含量隨著前體物煙堿的降低而逐漸減少，貯藏后的增加值也明顯降低。

圖2 不同煙堿轉(zhuǎn)化率的白肋煙45℃貯藏12 d后TSNAs含量Fig.2 Four individual TSNAs contents in burley tobacco with different nicotine conversion rate after 45°C storage for 12d

2.3 生物堿含量與高溫貯藏前后TSNAs含量關(guān)系

2.3.1 與貯藏前TSNAs含量的關(guān)系

表3為貯藏前TSNAs含量與生物堿及硝態(tài)氮等相關(guān)分析的結(jié)果，煙葉NNN含量和TSNAs總量與降煙堿含量及煙堿轉(zhuǎn)化率呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）。在本實(shí)驗(yàn)條件下，NNK含量與其前體物煙堿呈顯著的正相關(guān)關(guān)系，與降煙堿和煙堿轉(zhuǎn)化率表現(xiàn)出負(fù)相關(guān)。貯藏前，煙葉TSNAs的形成受NO3-N和NO2-N的影響不顯著。

表3 煙葉TSNAs含量與生物堿、NO3-N和NO2-N含量的相關(guān)系數(shù)Tab.3 Correlation coefficients of tobacco TSNAs content and alkaloid, NO3-N, NO2-N content

2.3.2 與貯藏過程中TSNAs增加量的關(guān)系

為了明確貯藏后煙葉TSNAs的增加值與生物堿含量的關(guān)系，探究高溫貯藏過程中TSNAs積累的來源，采用簡單相關(guān)、偏相關(guān)和逐步回歸分析對(duì)TSNAs增加值與生物堿和硝態(tài)氮含量進(jìn)行分析，結(jié)果見表4。對(duì)NNN，NNK和TSNAs的增加值與前體物進(jìn)行簡單相關(guān)和偏相關(guān)分析，結(jié)果基本一致，由相關(guān)系數(shù)可知，NNN和TSNA總量的增加值與降煙堿和煙堿轉(zhuǎn)化率呈極顯著正相關(guān)，說明降煙堿對(duì)TSNAs積累的直接作用較大。NNK的增加值與煙堿成顯著正相關(guān)，也受到降煙堿的影響，這與實(shí)驗(yàn)設(shè)置中煙堿和降煙堿的含量有關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)的條件下，NAT和NAB的增加值與它們的前體物新煙草堿、假木賊堿表現(xiàn)出負(fù)相關(guān)，可能是由降煙堿亞硝化的競(jìng)爭導(dǎo)致的。

進(jìn)一步以高溫貯藏后4種TSNAs及TSNAs總量的增加值為因變量，NNN增加值（Y1）、NAT增加值（Y2）、NAB增加值（Y3）、NNK增加值（Y4）和TSNAs增加值（Y5），以NO3-N（X1）、NO2-N（X2）、煙堿（X3）、降煙堿（X4）、假木賊堿（X5）、新煙草堿（X6）、總生物堿（X7）和煙堿轉(zhuǎn)化率（X8）為自變量，進(jìn)行逐步回歸分析，建立回歸方程如下：

Y1=432.2-287.3X4（R2=0.97），說明NNN的增加量與前體物降煙堿（偏相關(guān)系數(shù)0.98，P＜0.01）有密切關(guān)系。

Y2=318.3-95.8X4（R2=0.82），說明NAT的增加量受降煙堿（偏相關(guān)系數(shù)-0.90，P＜0.05）的影響。

Y3=73.7 -4.5X2＋1.5X3（R2=0.94），NAB的增加值與NO2-N（偏相關(guān)系數(shù)-0.68，P＜0.05）和煙堿（偏相關(guān)系數(shù)0.42，P＜0.05）的關(guān)系更為密切。

Y4=157.4-36.5X4（R2=0.89），NNK的增加量與降煙堿（偏相關(guān)系數(shù)-0.94，P＜0.05）有密切關(guān)系。

Y5=1687.4-338.9X4（R2=0.94），TSNAs的增加量與降煙堿（偏相關(guān)系數(shù)0.97，P＜0.01）有密切關(guān)系。

由上述結(jié)果可知，在總生物堿、NO3-N和NO2-N含量相近的條件下，4種生物堿中，降煙堿與NNN增加量密切相關(guān)，是影響高溫貯藏后TSNAs積累程度的主要因素。

表4 45℃貯藏后TSNAs增加值與生物堿、NO3-N和NO2-N含量的相關(guān)系數(shù)Tab.4 Correlation coefficients of the TSNAs increment in tobacco after 45°C storage with alkaloid, NO3-N, NO2-N contents

3 討論

普通煙草（N.tabacum）的生物堿以煙堿為主，占總生物堿含量的93%以上，降煙堿占2.5%～5%，個(gè)別煙株因不穩(wěn)定轉(zhuǎn)化基因位點(diǎn)被激活而具備了煙堿去甲基的能力，導(dǎo)致煙堿轉(zhuǎn)化成降煙堿，白肋煙群體中煙堿轉(zhuǎn)化的問題較突出[5,7,9]。TSNAs是煙草生物堿發(fā)生亞硝化反應(yīng)的產(chǎn)物，關(guān)于TSNAs與前體物的關(guān)系有一些矛盾的報(bào)道，這無疑與試驗(yàn)所用材料的生物堿和亞硝酸鹽含量[8]、調(diào)制環(huán)境和方法[12-13]以及煙堿脫甲基酶的功能等有關(guān)[18,26]。本實(shí)驗(yàn)采用同樣的栽培條件和調(diào)制方式，使白肋煙煙葉的硝態(tài)氮含量相近，貯藏12d后NNN和TSNAs總量與降煙堿及煙堿轉(zhuǎn)化率呈極顯著的正相關(guān)（P＜0.01），這與前人的研究結(jié)果一致[5,17,27]?？赡苁怯捎谥侔奉惖慕禑焿A比叔胺類的煙堿更容易發(fā)生亞硝化反應(yīng)生成TSNAs，煙堿大量向降煙堿轉(zhuǎn)化直接促進(jìn)了NNN的積累。

生物堿、硝酸鹽和亞硝酸鹽都是TSNAs形成的前體物，課題組前期的研究通過控制白肋煙氮肥用量、氮素形態(tài)和向煙葉中添加外源硝態(tài)氮等措施得到硝態(tài)氮含量差異較大的樣品，進(jìn)行高溫貯藏后，發(fā)現(xiàn)煙葉硝態(tài)氮含量與貯藏后TSNAs的增加量顯著正相關(guān)[19,21]。本研究對(duì) 總生物堿和硝態(tài)氮含量較一致，而煙堿和降煙堿有較大差異的樣品進(jìn)行45℃高溫貯藏后，發(fā)現(xiàn)4種TSNAs和TSNAs總量雖然均遠(yuǎn)高于貯藏前，但TSNAs在貯藏過程中的增加量受生物堿含量，特別是煙堿和降煙堿含量的強(qiáng)烈影響，一方面由于它們本身含量較高，也與實(shí)驗(yàn)設(shè)置有關(guān)。煙堿轉(zhuǎn)化導(dǎo)致煙堿含量降低和降煙堿含量增高，在高溫貯藏過程中NNK和NNN增加量也呈相反變化，尤其是隨著降煙堿和煙堿轉(zhuǎn)化率的增加，NNN的含量明顯升高，且增長幅度逐漸加大。煙堿轉(zhuǎn)化率為2.8%時(shí)，NNN的增加值占TSNAs總增加值的44%；當(dāng)轉(zhuǎn)化率為76.7%時(shí)，NNN的增加值所占比例增長到94%。這可能是因?yàn)榻禑焿A為仲胺類生物堿，比叔胺類的煙堿更不穩(wěn)定，更容易發(fā)生亞硝化反應(yīng)而生成NNN，這也是造成在總生物堿含量相近的條件下，隨著降煙堿含量比例增加，高溫貯藏后總TSNAs含量顯著增加的主要原因。在本實(shí)驗(yàn)條件下，相關(guān)和逐步回歸分析顯示貯藏后煙葉TSNAs、NNN的增加值均與降煙堿呈直接正相關(guān)，NNK的增加值隨著煙堿含量的降低而逐漸減少，也受到降煙堿的競(jìng)爭性抑制。NAT和NAB的增加值與它們前體物新煙草堿、假木賊堿無顯著的相關(guān)關(guān)系，回歸分析顯示它們受到煙葉煙堿和降煙堿含量的一定影響，這可能是因?yàn)樵赥SNAs形成過程中前體物之間的競(jìng)爭性抑制造成的，與CYP82E4等基因的調(diào)控有關(guān)[18,26]。此外，煙葉中的TSNAs屬于納克級(jí)成分，種植條件、煙草品種和檢測(cè)精度均會(huì)影響TSNAs及其前體物的含量，由于方法的局限本文檢測(cè)的是自由態(tài)的TNSAs，忽略了結(jié)合態(tài)的TSNAs[28]，因此，有關(guān)生物堿之間亞硝化反應(yīng)的競(jìng)爭及其對(duì)TSNAs的影響有待于進(jìn)一步的研究。

綜合本研究結(jié)果和前期的研究結(jié)果，我們認(rèn)為在高溫貯藏過程中，TSNAs形成與前體物硝態(tài)氮和生物堿含量具有密切相關(guān)，在生物堿含量相近的條件下，硝酸鹽和亞硝酸含量的高低成為TSNAs增加量的主導(dǎo)因素；而在硝酸鹽、亞硝酸含量相近的條件下，生物堿的差異，尤其是容易發(fā)生亞硝化反應(yīng)的仲胺類生物堿對(duì)TSNAs的形成和積累起重要作用。

4 結(jié)論

在生物堿總量、NO3-N和NO2-N含量相近條件下，煙葉中降煙堿含量和煙堿轉(zhuǎn)化率與TSNAs形成和積累關(guān)系密切；高溫貯藏后，4種TSNAs和TSNAs總量均遠(yuǎn)高于貯藏前，NNN的增加量與降煙堿呈極顯著正相關(guān)。煙堿轉(zhuǎn)化導(dǎo)致降煙堿比例增加是造成白肋煙貯藏過程中TSNAs大量形成和積累的主要原因。

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