張夢(mèng)玥，史宏志，周駿，白若石，王俊，楊興有，劉扣珠

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 國家煙草栽培生理生化研究基地/煙草行業(yè)煙草栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州450002；2 上海煙草集團(tuán)北京卷煙廠，北京100024；3 四川省煙草公司達(dá)州市公司，達(dá)州，635000

煙草特有亞硝胺(tobacco-specific nitrosamines,TSNAs) 是煙草中重要的一類有害成分，由生物堿發(fā)生亞硝化反應(yīng)生成，多年來持續(xù)引起人們廣泛關(guān)注[1-3]。煙草特有亞硝胺主要有4種：N-亞硝基降煙堿(NNN)、4-(甲基亞硝氨)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亞硝基新煙草堿(NAT)、N-亞硝基假木賊堿(NAB)，動(dòng)物試驗(yàn)表明NNN,NNK具有較強(qiáng)致癌活性。一般情況下，TSNAs在鮮煙葉中幾乎不存在，主要在調(diào)制和貯藏過程中產(chǎn)生和積累[4-10]。研究證明，白肋煙在貯藏階段， TSNAs含量可比貯藏前大幅提高[11-12]。貯藏在室溫下的白肋煙樣品，6個(gè)月后TSNAs含量可增加數(shù)倍[13]，因此貯藏階段對(duì)于TSNAs含量的增加不容小覷。生物堿和亞硝酸是TSNA的直接前體物,煙葉內(nèi)TSNA的產(chǎn)生和積累與兩者含量密不可分[14-18]。在實(shí)際生產(chǎn)中，由于多種原因煙葉于倉庫中的自然貯藏時(shí)間多達(dá)5年以上，所以明確長時(shí)間貯藏過程中煙草特有亞硝胺含量的變化有重要意義。目前關(guān)于貯藏過程中TSNAs含量變化方面的研究，樣品貯藏時(shí)間較短，且多數(shù)僅局限于單個(gè)類型的煙葉。本試驗(yàn)通過對(duì)5個(gè)產(chǎn)地烤煙、白肋煙和曬紅煙樣品在5年長時(shí)間貯藏期間煙葉TSNAs、生物堿以及硝態(tài)氮含量的測(cè)定，以揭示長期貯藏過程中不同類型煙葉內(nèi)三者的變化規(guī)律以及三者間的相關(guān)關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)材料為典型產(chǎn)區(qū) 2011 年調(diào)制后的上二棚煙葉，包括一種曬煙A（品種為萬毛1號(hào)）、兩種白肋煙B和C（品種為達(dá)白1號(hào)和TN86）、兩種烤煙D和E（品種為紅花大金元和中煙100），曬煙A和白肋煙B由四川省達(dá)州煙草公司提供；白肋煙C和烤煙D由云南省大理煙草公司提供；烤煙E由河南省平頂山市煙草公司提供。

1.2 試驗(yàn)方法

取調(diào)制后的每個(gè)類型和產(chǎn)地?zé)熑~10 kg。煙葉去除主脈后，剪成3～5 cm2大小的碎片，充分混勻，2011年12月第1次取樣后自然貯藏，每隔4個(gè)月進(jìn)行下一次取樣，每次取煙樣20 g，分別進(jìn)行冷凍干燥后磨碎，過60目篩，最終測(cè)定TSNAs和生物堿以及硝酸鹽的含量,每樣品重復(fù)測(cè)3次。

1.3 化學(xué)成分含量的測(cè)定

1.3.1 TSNA含量的測(cè)定

樣品均由上海煙草集團(tuán)北京卷煙廠進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定方法為在線SPE-液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（SPE-LC-MS/MS）法（SPE-LC：Spark Holland, Symbiosis (Pico)；MS/MS：AB Sciex triple quad 5500）。稱取1.0 g煙樣，將其放入50 mL錐形瓶中，加入40 μL 4種氘代TSNAs（內(nèi)標(biāo)）溶液（5000 ng/mL）和30 mL 100 mmol/L乙酸銨水溶液，在室溫下用振蕩器（200 r/min）萃取1小時(shí)，萃取液過0.45 μm水相濾膜后使用LC-MS/MS檢測(cè)TSNAs含量[19]。NNN、NNK、NAT和NAB含量之和即為TSNA總量。

1.3.2 生物堿含量的測(cè)定

200 mg樣品在堿性條件下，用甲基叔丁基醚（MTBE）提取生物堿，通過氣相色譜-氫火焰離子化檢測(cè)器（GC-FID）(Agilent 7890A，Agilent Technologies，USA) 定量分析檢測(cè)其中4種生物堿的含量，以正十六烷為內(nèi)標(biāo)，具體參照J(rèn)ack 和Bush的方法[20]。

1.3.3 硝酸鹽含量的測(cè)定

煙葉樣品送至美國肯塔基大學(xué)煙草化學(xué)分析實(shí)驗(yàn)室按Burton等[21]方法測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007進(jìn)行基礎(chǔ)數(shù)據(jù)處理和繪圖。運(yùn)用SPSS 20.0軟件建立一元二次方程分析貯藏過程中三者的變化情況并對(duì)煙草貯藏過程中TSNA含量和變化量與生物堿、硝酸鹽含量和減少量進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草貯藏過程中TSNAs含量的變化

2.1.1 貯藏過程中NNN含量的變化

5年自然貯藏期間NNN含量動(dòng)態(tài)變化規(guī)律如圖1和表1。由圖可看出，曬煙和白肋煙NNN含量上升明顯，其中白肋煙B較未貯藏前增加1073.04%，白肋煙C、曬煙A分別增加283.48%、213.80%?？緹烡、E中NNN增加幅度小。不同類型煙葉間NNN含量差異較大。白肋煙顯著大于曬煙，且兩者均顯著大于烤煙。在貯藏期間NNN含量動(dòng)態(tài)變化采用一元二次曲線模型，曬煙以及白肋煙與該模型的擬合程度較高，相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.95以上。

圖1 不同類型煙草貯藏過程中NNN含量的變化Fig.1 Changes in NNN content of different types of tobacco during storage

表1 不同類型煙草貯藏過程中NNN含量的變化Tab.1 Changes in NNN content of different types of tobacco during storage

2.1.2 貯藏過程中NNK含量的變化

從不同類型煙草5年自然貯藏期間NNK含量變化（圖 2和表2）可看出，隨貯藏時(shí)間增加，3種類型煙葉NNK含量均逐漸增加，曬煙A NNK含量多于白肋煙B，但差異不顯著，兩者NNK含量均顯著大于白肋煙C、兩種烤煙NNK含量最低。白肋煙C和曬煙A增加量最多，分別較貯藏前增加1274.44 %和1167.88 %。其次是白肋煙B，增加818.35%，烤煙D和E NNK含量增加695.59%和72.50%。五種煙葉一元二次曲線模型的擬合程度均達(dá)到了極顯著水平 。

圖2 不同類型煙草貯藏過程中NNK含量的變化Fig.2 Changes in NNK content of different types of tobacco during storage

表2 不同類型煙草貯藏過程中NNK含量的變化Tab.2 Changes in NNK content of different types of tobacco during storage

2.1.3 貯藏過程中NAB含量的變化

從不同類型煙草5年貯藏期間NAB含量變化情況（圖3和表3）可看出，隨貯藏時(shí)間增加，5種煙葉NAB含量均增加。同地區(qū)兩種類型煙葉NAB含量差異較大，白肋煙顯著大于曬煙，白肋煙、曬煙與烤煙NAB之間差異達(dá)到顯著水平?？緹烡增加率較高，為936.63%。白肋煙B和C增加比例高達(dá)779.07%、731.82%，曬煙NAB增加360.53%。曬煙、兩種白肋煙模擬方程相關(guān)系數(shù)均達(dá)0.96以上，呈現(xiàn)極顯著相關(guān)。

圖3 不同類型煙草貯藏過程中NAB含量的變化Fig.3 Changes in NAB content of different types of tobacco during storage

表3 不同類型煙草貯藏過程中NAB含量的變化Tab.3 Changes in NAB content of different types of tobacco during storage

2.1.4 貯藏過程中NAT含量的變化

從不同類型煙草5年貯藏期間NAT含量變化（圖4和表4）中可看出，貯藏過程中，5種樣品中的NAT含量均隨時(shí)間增加而增加。白肋煙、曬煙中NAT含量、絕對(duì)增加量顯著大于烤煙，其中白肋煙B中NAT含量顯著高于曬煙。白肋煙B和C增加率達(dá)520.14%和442.86%?？緹烢和D的NAT含量增加1026.81%和4.92%。

圖4 不同類型煙草貯藏過程中NAT含量的變化Fig.4 Changes in NAT content of different types of tobacco during storage

表4 不同類型煙草貯藏過程中NAT含量的變化Tab.4 Changes in NAT content of different types of tobacco during storage

2.1.5 貯藏過程中TSNAs總量的變化

從不同類型煙葉5年貯藏期間TSNAs總量變化情況（圖5和表5）可看出，3種類型煙葉TSNAs總量不斷上升，且TSNAs總量、變化趨勢(shì)與煙葉內(nèi)NNN含量以及變化趨勢(shì)較相像。白肋煙B的TSNAs總量、增加幅度最大，白肋煙C和曬煙A的TSNAs總量以及變化量差異不明顯，但大于兩種烤煙，同類型煙葉中，白肋煙B TSNAs總量顯著大于白肋煙C，此結(jié)果可能與NNN含量差異較大有關(guān)。

圖5 不同類型煙草貯藏過程中TSNAs總量的變化Fig.5 Changes in total TSNAs content of different types of tobacco during storage

表5 不同類型煙草貯藏過程中TSNAs總量的變化Tab.5 Changes in total TSNAs content of different types of tobacco during storage

2.2 煙草貯藏過程中生物堿含量的變化

生物堿是煙草特有亞硝胺的直接前體物[5],取經(jīng)過5年自然貯藏的3種不同類型煙葉，對(duì)其生物堿含量進(jìn)行測(cè)量， 得到生物堿含量的變化規(guī)律，并采用一元二次模型進(jìn)行動(dòng)態(tài)模擬。

2.2.1 貯藏過程中煙堿含量的變化

從煙堿含量的測(cè)量結(jié)果（圖6和表6）可以看出，曬煙A煙堿初始量最高,其次為白肋煙B,烤煙煙堿含量最低。同類型煙葉中，白肋煙B煙堿含量顯著大于白肋煙C,烤煙E顯著大于烤煙D。從圖中可以看出，3種類型煙葉煙堿含量隨貯藏時(shí)間增加逐漸減少，其中白肋煙C下降幅度最大，較未貯藏前下降26.30%。白肋煙B和曬煙A生物堿含量下降程度相近，分別下降14.13%和14.96%,烤煙E和D煙堿分別下降了18.91%和17.29%。

圖6 不同類型煙草貯藏過程中煙堿含量的變化Fig.6 Changes in nicotine content of different types of tobacco during storage

表6 不同類型煙草貯藏過程中煙堿含量的變化Tab.6 Changes in nicotine content of different types of tobacco during storage

2.2.2 貯藏過程中降煙堿含量的變化

從不同類型煙葉自然貯藏期間降煙堿含量變化（圖7和表7）可看出，白肋煙降煙堿含量最高，顯著高于曬煙和烤煙樣。曬煙A和兩種烤煙降煙堿含量差異不明顯。同類型煙葉中，白肋煙B降煙堿含量顯著高于白肋煙C。兩種烤煙降煙堿含量接近。3種類型煙葉降煙堿含量呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，其中白肋煙C下降幅度最大，較未貯藏前下降36.59%，其次是白肋煙B，降低了31.01%，曬煙A減少20.14%，烤煙E和D降煙堿含量少，但下降率較高，分別為36.27%和31.38%。

圖7 不同類型煙草貯藏過程中降煙堿含量的變化Fig.7 Changes in nornicotine content of different types of tobacco during storage

表7 不同類型煙草貯藏過程中降煙堿含量的變化Tab.7 Changes in nornicotine content of different types of tobacco during storage

2.2.3 貯藏過程中假木賊堿含量的變化

從不同類型煙草自然貯藏期間假木賊堿含量變化中（圖8和表8）可看出，5種煙樣的假木賊堿含量均逐漸下降，而下降的速度不一，烤煙D下降率為27.94%，其次是兩種白肋煙，其中白肋煙C比白肋煙B下降趨勢(shì)更明顯，分別較貯藏前下降22.22%、15.38%。而曬煙假木賊堿僅較未處理前下降11.63%。曬煙A貯藏前假木賊堿含量最高，顯著高于白肋煙B，白肋煙C和烤煙D之間差異未達(dá)到顯著水平，但兩者均顯著大于烤煙E。

圖8 不同類型煙草貯藏過程中假木賊堿含量的變化Fig.8 Changes in anabasine content of different types of tobacco during storage

表8 不同類型煙草貯藏過程中假木賊堿含量的變化Tab.8 Changes in anabasine content of different types of tobacco during storage

2.2.4 貯藏過程中新煙草堿含量的變化

從不同類型煙草經(jīng)自然貯藏后新煙草堿含量變化（圖9和表9）可看出，曬煙A、白肋煙B新煙草堿含量差異不顯著。白肋煙C含量顯著低于白肋煙B，烤煙中新煙草堿含量最低。從下降程度來看，烤煙D較貯藏前降低34.95%。其次是白肋煙C，下降率為32.41%，曬煙A下降率為14.72%。白肋煙B下降程度最小。新煙草堿含量變化經(jīng)擬合二次曲線模型相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.83以上，全部呈現(xiàn)極顯著相關(guān)狀態(tài)。

圖9 不同類型煙草貯藏過程中新煙草堿含量的變化Fig.9 Changes in anatabine content of different types of tobacco during storage

表9 不同類型煙草貯藏過程中新煙草堿含量的變化Tab.9 Changes in anatabine content of different types of tobacco during storage

2.2.5 貯藏過程中生物堿總量的變化

從不同類型煙草在自然貯藏條件下生物堿總量變化（圖10和表10）中可以看出，三種類型煙葉生物堿總量均有所下降。白肋煙B和曬煙A的生物堿總量顯著高于其他兩地區(qū)煙葉，其中白肋煙B生物堿總量最高，白肋煙C居第三.白肋煙和曬煙的生物堿總量顯著高于烤煙，烤煙E高于烤煙D。白肋煙C下降27.91%，幅度最大。白肋煙B下降18.97%，兩種烤煙分別降低了20.68%和19.68%。

圖10 不同類型煙草貯藏過程中生物堿總量的變化Fig.10 Changes in total alkaloid content of different types of tobacco during storage

表10 不同類型煙草貯藏過程中生物堿總量的變化Tab.10 Changes in total alkaloid content of different types of tobacco during storage

2.3 煙草貯藏過程中硝酸鹽含量的變化

從不同類型煙草五年自然貯藏期間硝酸鹽含量變化（圖11和表11）可看出，隨時(shí)間增加，白肋煙和晾曬煙硝酸鹽含量逐漸降低，烤煙不明顯。曬煙A下降最多，降低56.15%，其次為白肋煙C和B，分別降低31.98%、30.26%。從圖中可看出白肋煙硝酸鹽含量高于曬煙，兩者均顯著高于烤煙，其中白肋煙B硝酸鹽含量為烤煙的145.92倍，白肋煙C為烤煙的72.74倍。同種類型煙葉中，白肋煙B硝酸鹽含量較白肋煙C高出100.54%。硝酸鹽含量一元二次模型的相關(guān)系數(shù)均為0.84以上，擬合程度較高。

圖11 不同類型煙草貯藏過程中NO3-N含量的變化Fig.11 Changes in NO3-N content of different types of tobacco during storage

表11 不同類型煙草貯藏過程中NO3-N含量的變化Tab.11 Changes in NO3-N content of different types of tobacco during storage

2.4 煙草貯藏過程中TSNAs的含量和變化量與生物堿、硝酸鹽的相關(guān)關(guān)系

將貯藏前后TSNAs的含量和變化量與生物堿、硝酸鹽貯藏前和減少量進(jìn)行相關(guān)性分析得出表12，可看出，貯藏前四種TSNAs含量和生物堿相關(guān)性較大,在貯藏后有所下降，如NNN和降煙堿，NNK和煙堿以及NAB和假木賊堿的相關(guān)系數(shù)均較貯藏前有所減小，而與硝酸鹽相關(guān)關(guān)系有相反趨勢(shì)。NNN貯藏前后含量與降煙堿、硝酸鹽含量關(guān)系密切，貯藏過程中增加量與降煙堿貯藏前、貯藏期間減少量之間有極顯著相關(guān)關(guān)系，該結(jié)果與TSNAs總量和降煙堿、硝酸鹽各項(xiàng)指標(biāo)之間的相關(guān)關(guān)系相似。NNK增加量與煙堿等貯藏前含量、減少量之間相關(guān)關(guān)系顯著。NAB含量上升情況與生物堿尤其是假木賊堿和總生物堿減少量相關(guān)關(guān)系顯著。NAT的增加量與新煙草堿、硝酸鹽貯藏前含量、減少量之間相關(guān)關(guān)系多為極顯著。

表12 煙草貯藏過程中TSNAs的含量以及變化量和生物堿、硝酸鹽的相關(guān)關(guān)系Tab.12 Relationship between the change in TSNAs and alkaloid and nitrate during storage

續(xù)表12

3 討論

調(diào)制后的貯藏階段是白肋煙和曬煙TSNAs形成的重要時(shí)期。相關(guān)分析表明，TSNAs的增加量與貯藏前較高的生物堿、硝酸鹽含量密不可分，其中NNN與降煙堿， NNK與煙堿，NAB與假木賊堿，NAT與新煙草堿，總TSNAs與總生物堿，TSNAs與硝酸鹽的關(guān)系密切。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，貯藏前后TSNA含量與生物堿、硝態(tài)氮含量相關(guān)性大小變化規(guī)律表明煙葉貯藏過程中TSNA的形成與硝態(tài)氮關(guān)系更為密切，降低煙葉硝態(tài)氮含量對(duì)于減少貯藏過程中TSNAs形成更為重要。煙葉貯藏過程中TSNAs的增加伴隨著生物堿和硝態(tài)氮含量的下降，表明煙葉貯藏過程中TSNAs生物合成十分活躍。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，貯藏環(huán)境對(duì)TSNAs形成影響很大，高溫低濕可使煙葉硝態(tài)氮產(chǎn)生氣態(tài)氮氧化物，其與生物堿結(jié)合生成TSNAs[22-23]，夏季溫度較高，提供了高溫條件，促進(jìn)了TSNAs的生成。由于本研究所采用的不同煙葉類型樣品硝態(tài)氮含量差異較大造成不同類型煙葉TSNAs變化幅度不同[24-26]，孫榅淑等人研究表明，白肋煙的硝態(tài)氮含量是烤煙的數(shù)十到數(shù)百倍[27]。關(guān)于不同類型煙草硝態(tài)氮含量差異的原因可能與不同基因型氮效率差異和栽培方式不同有關(guān)，研究得出，白肋煙氮效率低，最適施氮量達(dá)到了12.5-15kg/667m2[28],烤煙最適施氮量為2.5-3.5kg/667m2[29]，曬煙介于兩者之間。白肋煙吸收氮較多，而光合速率弱，光合產(chǎn)物少，因此被同化的氮素較少，多余氮未被利用以硝態(tài)氮形式儲(chǔ)存。四川和云南白肋煙TSNAs的差異可能是兩地?zé)熑~種植的品種煙堿轉(zhuǎn)化率不同所致，四川宣漢達(dá)白1號(hào)平均煙堿轉(zhuǎn)化率為14.30%，較云南賓川TN86的4.25%高出3.36倍[18]，因此選擇合適的主栽品種、在大田生育期通過合理措施提高煙葉的光合性能以適當(dāng)降低施肥量、不同類型煙草在貯藏過程中合理降溫控濕都可以在一定程度上降低TSNAs含量，提高煙葉的安全性。

4 結(jié)論

在5年自然貯藏過程中，白肋煙、曬煙和烤煙中TSNA含量不斷升高，符合二次曲線增長模型。白肋煙TSNAs尤其是NNN的含量最高，產(chǎn)生量最大，其次是曬煙，烤煙的TSNAs含量相對(duì)較低且在貯藏過程中增加幅度較小。生物堿和硝態(tài)氮含量在貯藏過程中與TSNAs呈相反變化趨勢(shì)，其中生物堿含量與貯藏前TSNAs含量相關(guān)性大于貯藏后TSNAs含量，而硝態(tài)氮含量與貯藏后TSNAs含量相關(guān)性更大，降低煙葉硝態(tài)氮含量是減少貯藏過程中TSNAs形成的有效途徑。

[1]史宏志, 張建勛.煙草生物堿[M].北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社,2004： 106-108.SHI Hongzhi, ZHANG Jianxun.Tobacco alkaloids[M].Beijing：China Agriculture Press, 2004： 106-108.

[2]Hecht S S, Hoffmann D.Tobacco-specific nitrosamines, an important group of carcinogens in tobacco and tobacco smoke [J].Commentary American Health Foundation,1988, 9(6)：875-884.

[3]Boyland E, Roe F J C, Gorrod J W, et al.Induction of pulmonary tumors in mice by nitro so-nornicotine, a possible constituent of tobacco smoke [J].Nature , 1964,202 ：1126.

[4]史宏志,劉國順.白肋煙煙堿轉(zhuǎn)化及煙草特有亞硝胺形成[J].中國煙草學(xué)報(bào), 2008,14(S1)：41-46.SHI Hongzhi, LIU Guoshun.Nicotine conversion and formation of tobacco-specific nitrosamines in burley tobacco[J].Acta Tabacaria Sinica, 2008, 14(S1)： 41-46.

[5]El-Bayoumy K, Latropoulos M, Amin S, et al.Increased expression of cyclooxygenase in rat lung tumors induced by the tobacco specific nitrosamine 4- (Methylnitrosamino)-4-(3-pyridyl)-1-butanone：the impact of a high-fat diet [J].Cancer Research, 1999,59：1400-1403.

[6]Fischer S, Spiegelhalder B, Eisenbarth J, et al.Investigation on the origin of tobacco-specific nitrosamines in main stream smoke of cigarettes [J].Carcinogenesis, 1990, 11：723-730.

[7]Bush L P, Cui M, Shi H, et al.Formation of tobacco-specific nitrosamines in air-cured tobacco[J].Recent Advances in Tobacco Science, 2001, 27：23-46.

[8]Burton H R, Dye N K, Bush L P.Relationship between tobacco specific nitrosamines and nitrate from different air cured tobacco varieties[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1994,42：2007-2011.

[9]Peele D M.Formation of tobacco specific nitrosamines in fluecured tobacco[C].CORESTA October 13,1999．

[10]汪安云,黃瓊.一株降低煙草中特有亞硝胺細(xì)菌的分離鑒定及特性研究[J].環(huán)境科學(xué)報(bào),2006(11)：1914-1920.WANG Anyun, HUANG Qiong.Studies on isolation identification and characteristics of reducing TSNA contents of burley tobacco endophytic bacteria[J].Acta Scientiae Circumstantiae,2006(11)：1914-1920.

[11]Burton H R, Childs G H Jr, Anderson R A, et al.Changes in chemical composition of burley tobacco during senescence and curing.3.Tobacco-specific nitrosamines [J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1989, 37： 426-430.

[12]Cui M.The source and the regulation of nitrogen oxide production for tobacco-specific nitrosamine formation during air-curing tobacco [D].Ph.D.Dissertation, University of Kentucky, USA.1998.

[13]De Roton C, Girard C, Jacquet L, et al.Potential changes of TSNA composition in stored tobacco powder： consequences or sample preparation and ground tobacco storage [C].2004 CORESTA Congress, Kyoto.

[14]MacKown C T, Eivazi F, Sims J L, et al.Tobacco-specific nitrosamines： Effect of burley alkaloid isolines and nitrogen fertility management [J].J Agric Food Chem , 1984 , 32 ： 1269-1272.

[15]Djordjevic M V ,Gay S L, Bush L P ,et al.Tobacco-specific nitrosamines accumulation and distribution in flue-cured tobacco alkaloid isolines [J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,1989,37 ： 752-756.

[16]Brunnemann K D, Mosaryk J, Hoffmann D.Role of tobacco stems in the formation of nitrosamines in tobacco and mainstream and side stream smoke.J.AgricFoodChem.1983,31,1221-1224.

[17]Fischer S, Spiegelhalder.B, Preussmann R.Preformed tobaccospecific nitrosamines in tobacco-role of nitrate and influence of tobacco type.Careinogenesis1989,10,1511-1517.

[18]史宏志.煙草煙堿向降煙堿轉(zhuǎn)化[M].北京：科學(xué)出版社, 2013.SHI Hongzhi.Conversion of nicotine to nornicotine in tobacco[M].Beijing： Science Press, 2013.

[19]Zhou Jun, Bai Ruoshi, Zhu Yongfa.Determination of four tobacco-specific nitrosamines in mainstream cigarette smoke by gas chromatography/ion trap mass spectrometry[J].Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2007,24 (21)： 4086-4092.

[20]Jack A, Bush L.The ‘LC’ protocol-Appendix 3： Laboratory Procedures.2007.pp.21-23.University of Kentucky, Lexington,USA.http：//www.uky.edu /Ag/Tobacco/Pdf/ LC-Protocol.Pdf .Accessed 3 March 2007.

[21]Burton H R, Bush L P, Djordjevic M V. Influence of temperature and humidity on the accumulation of tobacco-specific nitrosamines in stored burley tobacco[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1989, 37： 1372-1377.

[22]Saito H, Miyazaki M, Miki J.Role of nitrogen oxides in tobaccospecific nitrosamine formation in burley tobacco[C].2006 CORESTA Congress .Paris： CORESTA,2006.

[23]Shi H Z, Wang R Y, Bush L P, et al.Changes in TSNA contents during tobacco storage and the effect of temperature and nitrate level on TSNA formation [J].Journal of Agricultural and Food Che mistry,2013,61(47)：11588-11594.

[24]孫榅淑, 王俊, 周駿, 等.硝態(tài)氮含量對(duì)煙葉高溫貯藏過程中TSNA形成的影響 [J].中國煙草學(xué)報(bào)，2015,21(2)：53-57.SUN Wenshu, WANG Jun, ZHOU Jun, et al.Effect of nitrate nitrogen level in tobacco leaves on TSNAs formation during high temperature storage[J].Acta Tabacaria Sinica, 2015, 21(2)： 53-57.

[25]孫榅淑, 楊軍杰, 史宏志, 等.不同氮素形態(tài)對(duì)煙草硝態(tài)氮含量和TSNA形成的影響[J].中國煙草學(xué)報(bào), 2015, 04： 78-84.SUN Wenshu, YANG Junjie, SHI Hongzhi, et al.Effect of different nitrogen forms on nitrate nitrogen conlent and TSNAs formation jn tobacco[J].Acta Tabacaria Sinica, 2015, 04： 78-84.

[26]王俊, 孫榅淑, 周駿, 等.貯藏溫度和煙葉含水率互作對(duì)白肋煙貯藏期間TSNAs形成的影響[J].煙草科技, 2016, 49(9)： 8-14.WANG Jun, SUN Wenshu, ZHOU Jun, et al.Effects of Storage Temperature and Tobacco Moisture Content on TSNAs Formation of Burley Tobacco during Storage[J].Tobacco science＆Technology, 2016, 49(9)： 8-14.

[27]李宗平,覃光炯.不同調(diào)制方法對(duì)煙草煙堿轉(zhuǎn)化及TSNA的影響[J].中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2015, 23(10)：1268 -1276.LI Zongping, QIN Guangjiong.Effects of curing methods on conversion rate of nicotine and TSNAs contents of tobacco[J].Chinese Journal of Eco-Agriculture, 2015, 23(10)：1268 -1276.

[28]王廣山,朱尊權(quán).氮肥用量對(duì)白肋煙產(chǎn)質(zhì)的影響[J].煙草科技,2000,12：34-37.WANG Guangshan, ZHU Zunquan.Effect of the amount of N fertilizer applied on the yield and quality of burley tobacco[J].Tobacco science＆Technology, 2000,12：34-37.

[29]王嬋娟.不同氮水平下烤煙葉片生長發(fā)育規(guī)律的研究[D].鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué),2010.WANG Chanjuan.The growth-development law of flue-cured tobacco Leaves on different nitrogen rates [D].Zhengzhou： Henan agricultural university,2010.