孔博，張宏瑞，和淑琪，谷星慧，楊碩媛，張立猛，李正躍

1 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，云南昆明 650201；2 云南省煙草公司玉溪市公司，云南玉溪 653100

蚜繭蜂科（Aphidiidae）隸屬昆蟲(chóng)綱（Insecta）膜翅目（Hymenoptera）姬蜂總科（Ichneumonoidea），許多種類(lèi)廣泛分布于世界各地[1]。蚜繭蜂作為蚜蟲(chóng)的一種重要寄生性天敵，一些種類(lèi)在蚜蟲(chóng)的生物防治中已被廣泛應(yīng)用。其中燕麥蚜繭蜂（Aphidius evenaeHaliday）、麥蚜繭蜂（Ephedrus plagiator（Nees））、粗脊蚜繭蜂（A.colemaniVicreck）、和煙蚜繭蜂（A.gifuensisAshmead）對(duì)麥蚜、棉蚜（Aphis gossypiiGlover）和煙蚜（Myzus persicae（Sulzer））的防治效果顯著[2-5]。

深入研究蚜繭蜂的分類(lèi)鑒定及其起源和進(jìn)化，對(duì)利用蚜繭蜂防治蚜蟲(chóng)具有重要的指導(dǎo)意義。由于蚜繭蜂體型微?。ù蠖嘣?.0 ～ 2.4 mm之間），種間相似度高，種內(nèi)還存在體色、觸角節(jié)數(shù)等變異，僅依靠外部形態(tài)特征難以對(duì)其種類(lèi)進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。此外，田間采集到僵蚜后，必須帶回室內(nèi)等蚜繭蜂成蟲(chóng)羽化后才能進(jìn)行形態(tài)鑒定，對(duì)僵蚜內(nèi)的蛹或其寄生蚜體內(nèi)的蚜繭蜂幼蟲(chóng)則很難進(jìn)行形態(tài)鑒定，因此，迫切需要開(kāi)展蚜繭蜂的分子鑒定，并探討其物種的起源及進(jìn)化。

目前，研究人員已成功利用DNA條形碼對(duì)蚜蟲(chóng)類(lèi)[6]、雙翅目[7]、鱗翅目[8]、鞘翅目[9]等昆蟲(chóng)進(jìn)行種類(lèi)鑒定及系統(tǒng)發(fā)育研究。對(duì)于體型較大的昆蟲(chóng)，一般可以利用蟲(chóng)體較小的部分（如左前足脛節(jié)）提取DNA，從而保留標(biāo)本用于形態(tài)鑒定或種類(lèi)核對(duì)。對(duì)于蚜繭蜂這類(lèi)小型昆蟲(chóng)來(lái)說(shuō)，一般采用常規(guī)試劑盒提取DNA的方法（柱離心法），研磨整個(gè)蟲(chóng)體提取DNA，但該方法無(wú)法保留標(biāo)本做形態(tài)鑒定及種類(lèi)核對(duì)。在保留蟲(chóng)體標(biāo)本的前提下，找到一種適宜的提取方法從單個(gè)個(gè)體中獲得較高質(zhì)量的DNA，是利用分子手段進(jìn)行物種鑒定和系統(tǒng)發(fā)育研究的關(guān)鍵。因此，本研究在參考前人工作的基礎(chǔ)上[10-13]，對(duì)DNA提取的柱離心法進(jìn)行改進(jìn)，建立了穿刺昆蟲(chóng)腹部DNA提取方法，并通過(guò)DNA產(chǎn)量、質(zhì)量和線(xiàn)粒體DNA COI基因序列擴(kuò)增對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)。旨在為進(jìn)一步研究蚜繭蜂的親緣關(guān)系及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系提供一定的基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

蚜繭蜂標(biāo)本采集信息見(jiàn)表1，用于實(shí)驗(yàn)的7種蚜繭蜂標(biāo)本，均為75%乙醇浸泡并冷藏于4℃冰箱中，一些蚜繭蜂保存時(shí)間超過(guò)2年。

表1 蚜繭蜂標(biāo)本的來(lái)源及保存方式Tab.1 The sources and ways of preservation of Aphidiidae specimens

1.2 DNA提取方法

1.2.1 穿刺法提取DNA

提取7種蚜繭蜂的基因組DNA，除菜蚜繭蜂和煙蚜繭蜂各提取2頭外，其余每種均提取1頭，共9個(gè)樣品。參照HiPure Tissue DNA Kits（昆明速科生物科技有限公司，Magen）試劑盒提取方法，部分步驟有改進(jìn)。

（1）將蚜繭蜂從75%乙醇儲(chǔ)存液中取出置于載玻片上，待蟲(chóng)體上的乙醇揮發(fā)后，向蟲(chóng)體上滴加2 μL Buffer ATL消化液，解剖鏡下，用滅菌的“00”號(hào)昆蟲(chóng)針由蚜繭蜂腹部4 ～ 5節(jié)間膜穿刺。將穿刺過(guò)的蚜繭蜂移入1.5 mL離心管，移液槍吸取50 μL Buffer ATL消化液滴入離心管，再取178 μL Buffer ATL消化液來(lái)回沖洗載玻片上穿刺蚜繭蜂的位置，連同之前的Buffer ATL消化液一同吸入離心管中。最后加入20 μL Proteinase K，低速渦旋混勻。55℃水浴3 h，水浴期間偶爾輕微搖晃離心管，使標(biāo)本充分與消化液接觸。

（2）轉(zhuǎn)移步驟(1)中得到的消化液至1.5 mL離心管中，將蚜繭蜂取出保存于75%乙醇中，以便制作玻片標(biāo)本進(jìn)行形態(tài)鑒定。

（3）加入250 μL Buffer DL至消化液中，最高速度渦旋混勻30 s，70℃水浴10 min。之后向消化液中加入250 μL無(wú)水乙醇，最高速度渦旋混勻30 s。

（4）將柱子放入2 mL收集管，轉(zhuǎn)移上一步驟（3）所得到的混合液至柱子中，10000×g離心1 min。

（5）棄慮液，將柱子放入收集管，加500 μL Buffer GW1入柱子中，10000×g 離心1 min。

（6）棄慮液，將柱子放入收集管，加650 μL Buffer GW2入柱子中，10000×g離心1 min。該步驟重復(fù)2次。

（7）棄慮液，將柱子放入收集管中，10000×g離心2 min。

（8）將柱子裝于新的1.5 mL離心管中，加90 μL預(yù)熱至70℃的Buffer AE入柱子中。放置3 min，10000×g離心1 min。

（9）棄柱子，把含蚜繭蜂DNA的濾液保存于4℃冰箱中。

1.2.2 研磨法提取DNA

對(duì)4種蚜繭蜂進(jìn)行研磨提取DNA。除菜蚜繭蜂和煙蚜繭蜂各提取2頭外，豆柄瘤蚜繭蜂和麥蚜繭蜂各提取1頭，共6個(gè)樣品。參照HiPure Tissue DNA Kits（昆明速科生物科技有限公司，Magen）試劑盒的提取方法。

（1）將蚜繭蜂從75%乙醇液中取出，置于載玻片上，待蟲(chóng)體上的乙醇充分揮發(fā)后，將蚜繭蜂移至1.5 mL離心管中，用滅菌的研磨棒研磨蚜繭蜂。磨碎后用230 μL Buffer ATL消化液沖洗研磨棒，沖洗液進(jìn)入離心管，加入20 μL Proteinase K，渦旋混勻。55℃水浴3 h，水浴期間偶爾輕微搖晃離心管，使標(biāo)本充分與消化液接觸。

（2）10000×g 離心3 min，轉(zhuǎn)移上清液至新的1.5 mL離心管中。

之后的步驟與1.2.1中步驟（3）—（9）相同。

1.3 DNA質(zhì)量檢測(cè)

取2 μL DNA提取物，無(wú)菌水稀釋100倍，充分混勻，紫外分光光度計(jì)測(cè)定在260 nm和280 nm處的吸光度值（OD值）。通過(guò)OD260和OD280的比值來(lái)評(píng)價(jià)所提取DNA的產(chǎn)量和純度。

1.4 PCR擴(kuò)增

利用COI基因的通用引物L(fēng)CO1490（5'-GGTCAA CAAATCATAAAGATATTGG-3'）和HCO2198（5'-TA AACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'）[14]提取的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系：DNA模板5 μL、10 pmol/L的上游和下游引物各1 μL、15 μL Master Mix、用ddH2O定容至30 μL。擴(kuò)增的條件：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)，最后在72℃充分延伸10 min。

1.5 PCR產(chǎn)物檢測(cè)

配制1%的瓊脂糖凝膠，內(nèi)含5 μL GoldView I型核酸染色劑。Marker采用的是DL-1000，電泳緩沖液為0.5×TBE（PH 8.0），電壓80 V，室溫下電泳1.5 h，紫外分析儀下觀(guān)察、拍照。

1.6 測(cè)定蚜繭蜂COI序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)

將穿刺法獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物送昆明碩擎生物有限公司測(cè)序。采用MEGA5.1對(duì)所得序列進(jìn)行整理，通過(guò)GenBank的blast功能進(jìn)行COI序列比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取物DNA純度和產(chǎn)量評(píng)價(jià)

兩種方法提取蚜繭蜂DNA的OD值及DNA質(zhì)量和濃度如表2所示。穿刺法提取的DNA提取物的OD260/OD280在1.51 ～ 1.91之間，研磨法提取的DNA提取物的OD260/OD280在1.63 ～ 1.82之間，兩種DNA提取物的純度OD260/OD280無(wú)顯著性差異，均在正常范圍內(nèi)。兩種方法的DNA提取物濃度分別在29 ～ 55 ng/μL、85 ～ 116 ng/μL之間，平均濃度分別為41 ng/μL、100 ng/μL。提取物濃度存在顯著性差異，研磨法提取的DNA產(chǎn)量明顯高于穿刺法提取的DNA產(chǎn)量。

表2 蚜繭蜂基因組DNA的OD比值和質(zhì)量濃度Tab.2 OD value and concentration of Aphidiidae genomic DNA

2.2 DNA提取物的PCR擴(kuò)增

DNA提取物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。實(shí)驗(yàn)所獲得的DNA條帶完整清晰，DNA提取物片段在500 ～ 700 bp之間，不存在雜帶?？梢?jiàn)穿刺法提取的DNA質(zhì)量較好，PCR擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定。

圖1 利用引物L(fēng)CO1490和HCO2198的穿刺法提取（A）和研磨法提?。˙）擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification pattern of genomic DNA using the primer pairs of LCO1490 and HCO2198 by puncturing extraction (A) and grinding extraction (B)

2.3 蚜繭蜂COI序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的比對(duì)結(jié)果

通過(guò)GenBank中的Blast功能，穿刺法獲得蚜繭蜂COI序列的比對(duì)結(jié)果如表3所示。通過(guò)測(cè)序公司測(cè)序獲得菜蚜繭蜂序列2條，與GenBank中其它菜蚜繭蜂序列的相似度為99%，同時(shí)GenBank中還顯示與其他蚜繭蜂種類(lèi)的比對(duì)結(jié)果（表3）。豆柄瘤蚜繭蜂序列1條，與GenBank中其它豆柄瘤蚜繭蜂序列的相似度為99% ～ 100%。翼蚜外繭蜂序列1條，與GenBank中其它翼蚜外繭蜂序列的相似度為95% ～ 99%。麥蚜繭蜂序列1條，在GenBank中與黍蚜繭蜂（E.nacheri）序列的相似度很高，達(dá)到99%，標(biāo)本進(jìn)行形態(tài)學(xué)核對(duì)后鑒定為麥蚜繭蜂。煙蚜繭蜂序列2條，在GenBank中無(wú)相似序列，目前GenBank上只下載到1條煙蚜繭蜂序列，標(biāo)本進(jìn)行形態(tài)學(xué)核對(duì)后鑒定為煙蚜繭蜂。通過(guò)序列比對(duì)可以看出實(shí)驗(yàn)獲得序列均為相應(yīng)蚜繭蜂的序列，從而說(shuō)明DNA提取物的PCR擴(kuò)增條帶正確。

表3 蚜繭蜂COI序列在GenBank中的比對(duì)結(jié)果Tab.3 Blast result of Aphidiidae COI sequence in GenBank

3 討論與結(jié)論

通過(guò)對(duì)比穿刺法和研磨法提取蚜繭蜂DNA，探尋既能有效獲得蚜繭蜂DNA用以PCR擴(kuò)增，又能保留蟲(chóng)體進(jìn)行標(biāo)本核對(duì)的DNA提取方法。結(jié)果表明，兩種方法提取的DNA產(chǎn)量都能滿(mǎn)足PCR擴(kuò)增要求，但穿刺法既能提取到質(zhì)量較好的DNA，同時(shí)還能保留蚜繭蜂的重要形態(tài)鑒定特征。蚜繭蜂寄生于蚜蟲(chóng)體內(nèi)形成僵蚜，從化蛹到羽化無(wú)需取食，因此腹部穿刺提取的DNA模板絕大部分屬于蚜繭蜂DNA，外源DNA極少。本實(shí)驗(yàn)得出的所有PCR產(chǎn)物沒(méi)有經(jīng)過(guò)克隆，直接進(jìn)行PCR產(chǎn)物測(cè)序，而得出序列的峰圖是單峰無(wú)雜質(zhì)背景的。因此，即便含有外源DNA，對(duì)擴(kuò)增蚜繭蜂的COI基因并沒(méi)有影響。用于實(shí)驗(yàn)的一些蚜繭蜂浸液標(biāo)本保存超過(guò)2年，也能提取出質(zhì)量較好的DNA，這與常虹等[15]的研究結(jié)果一致，超過(guò)2年的浸液標(biāo)本，只有動(dòng)物組織DNA提取試劑盒提取到的DNA擴(kuò)增后能得到清晰的單一擴(kuò)增條帶。

在提取DNA的過(guò)程中，需要利用緩沖液對(duì)標(biāo)本進(jìn)行預(yù)處理，有利于細(xì)胞溫和地部分恢復(fù)原有的生理環(huán)境，使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分子與DNA之間交聯(lián)得以解離，為后期提取DNA創(chuàng)造條件[16-17]。由于腹部第一節(jié)（腹柄節(jié)）是蚜繭蜂的主要形態(tài)鑒定特征，微針穿刺法采用從蚜繭蜂腹部的第二節(jié)起用無(wú)菌微針穿刺。目前，本實(shí)驗(yàn)室還利用這種方法在保留標(biāo)本進(jìn)行形態(tài)鑒定的前提下，成功提取薊馬的基因組DNA[18]，表明該方法適用于各類(lèi)體型較小昆蟲(chóng)的DNA提取。

本研究采用改進(jìn)的柱離心法，適用于從保存年限較長(zhǎng)的標(biāo)本中提取符合PCR擴(kuò)增條件的DNA。此外，對(duì)于數(shù)量較少的標(biāo)本，能夠提取到適宜擴(kuò)增的DNA進(jìn)行分子鑒定，并保留蟲(chóng)體標(biāo)本進(jìn)行種類(lèi)核對(duì)。

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