謝小娟 樊冬梅 馬立剛 宋紹團(tuán) 孔金玉 李前輝 郭孝龍

(河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科，河南 洛陽 471300)

七氟烷對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲遷移能力的影響及相關(guān)機(jī)制

謝小娟 樊冬梅1馬立剛 宋紹團(tuán) 孔金玉2李前輝 郭孝龍

(河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科，河南 洛陽 471300)

目的探討七氟烷對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲遷移能力的影響及相關(guān)機(jī)制。方法接種對數(shù)生長期的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251于培養(yǎng)皿中，細(xì)胞傳代后分為對照組及七氟烷組。對照組通入含5%CO2及95%的空氣，七氟烷組通入5%CO2及92.5%的空氣和2.5%七氟烷，氣流量為2 L/min，處理4 h。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測兩組細(xì)胞侵襲能力的變化，細(xì)胞劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力，Western印跡檢測兩組細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)分子〔包括E-鈣黏蛋白(cadherin)、N-cadherin、snail及緊密連接蛋白(Zo)-1〕、腫瘤干細(xì)胞相關(guān)分子(包括CD133)及侵襲相關(guān)分子〔包括基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9〕表達(dá)的變化。結(jié)果七氟烷組穿透基底膜細(xì)胞數(shù)顯著低于對照組(P<0.05)。七氟烷組細(xì)胞24 h后劃痕修復(fù)面積差顯著低于對照組(P<0.05)。七氟烷組相比對照組細(xì)胞E-cadherin及Zo-1表達(dá)顯著上調(diào)，N-cadherin、snail、CD133、MMP-2及MMP-9表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)。結(jié)論七氟烷可顯著抑制人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲遷移能力，相關(guān)機(jī)制可能與其對細(xì)胞干性、EMT及MMP的抑制作用有關(guān)。

七氟烷；人腦膠質(zhì)瘤；侵襲及遷移；上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化；腫瘤干細(xì)胞

人腦膠質(zhì)瘤是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性腫瘤，發(fā)病率約占全部中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的40%〔1〕。手術(shù)切除原發(fā)病灶聯(lián)合術(shù)后放化療是治療腦膠質(zhì)瘤最有效的方式之一，但由于腦組織功能及結(jié)構(gòu)的限制及腫瘤細(xì)胞放化療抵抗的形成，絕大多數(shù)患者難以根治進(jìn)而復(fù)發(fā)，導(dǎo)致患者5年生存率低于5%〔2〕。七氟烷具有保護(hù)腦功能的作用〔3〕，是顱腦手術(shù)中常用的吸入性麻醉劑。研究顯示七氟烷可影響多種惡性腫瘤的侵襲遷移能力〔4〕，但其對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的影響及相關(guān)機(jī)制尚不明確。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)探究七氟烷與人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251侵襲遷移能力的關(guān)系及其對侵襲遷移能力相關(guān)分子的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251來自美國模式菌種收集中心(ATCC)，由國內(nèi)北納生物公司提供。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器 ECO1.8超凈工作臺、Forma3110生化培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific公司)；DM500顯微鏡(德國Leica公司)；3-16KL高速冷凍離心機(jī)(德國Sigma公司)；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀及GelDoc XR凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)；麻醉氣體監(jiān)測儀(德國Drager公司)，Aestiva7900型麻醉機(jī)、七氟烷揮發(fā)罐(美國GE Datex-Ohmeda公司)；10、100 μl、1 ml移液器(德國Eppendorf公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)耗材 6孔板、Transwell小室、6 cm培養(yǎng)皿(美國Corning公司)，各規(guī)格移液槍頭(美國Invitrogen公司)，1.5 ml離心管(德國Sigma公司)，15 ml離心管(中國NEST公司)，聚偏氟乙烯膜(PVDF膜，德國Millipore公司)等。

1.4實(shí)驗(yàn)試劑 七氟烷(批號：161226，日本Maruishi Pharmaceutical公司)，RPMI1640培養(yǎng)基及胎牛血清(BSA，美國Thermo Scientific公司)，30%聚丙烯酰胺(美國Thermo Scientific公司)，四甲基乙二胺、乙二胺四乙酸(EDTA)胰蛋白酶(德國Sigma公司)，無核酶水(美國Invitrogen公司)，十二烷基硫酸鈉及甲醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，過硫酸銨(中國上海Yeasen公司)，細(xì)胞裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒及化學(xué)增強(qiáng)發(fā)光法(ECL)發(fā)光顯色液(中國碧云天公司)等，蛋白酶抑制劑cocktail及蛋白marker(日本Takara公司)?？贵w購自美國abcam公司，E-鈣黏蛋白(cadherin)抗體(ab15148)，N-cadherin抗體(ab18203)，snail抗體(ad180714)，CD133抗體(ab19898)，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2抗體(ab37150)，MMP-9抗體(ab73734)，β-Actin(M ab8226)，鼠二抗(ab6728)，兔二抗(ab150077)。

1.5實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將3碟同一來源培養(yǎng)于10 cm培養(yǎng)皿中融合度為80%以上的U251細(xì)胞使用500 μl胰蛋白酶消化3 min，以1.5 ml/碟含10% BSA的RPMI1640培養(yǎng)基終止消化，其中2碟傳代至另外2碟10 cm培養(yǎng)皿中，得到4碟10 cm培養(yǎng)皿的U251細(xì)胞，另外1碟細(xì)胞計數(shù)，以5×105/孔在2塊6孔板中進(jìn)行種板。24 h細(xì)胞貼壁且6孔板細(xì)胞長滿后對4碟細(xì)胞進(jìn)行編號，隨機(jī)數(shù)字表法將4碟細(xì)胞平均分為兩組，對照組細(xì)胞在通入含5%CO2及95%空氣的氣體環(huán)境下培養(yǎng)4 h，七氟烷組細(xì)胞在通入5%CO2及92.5%的空氣和2.5%七氟烷的氣體環(huán)境下培養(yǎng)4 h，處理完成后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5.2Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力 用50 mg/L，1∶8的Matrigel膠稀釋液包被Transwell小室底的上室面，4℃風(fēng)干。風(fēng)干后吸出殘余液體，50 μl含10 g/L的BSA無血清培養(yǎng)液，生化培養(yǎng)箱中37℃放置30 min水化基底膜。將處理好的兩組細(xì)胞胰酶消化并重懸，1 ml含10% BSA的RPMI1640培養(yǎng)基終止消化后轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管，500 r/min室溫離心5 min，去上清后磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，1% BSA無血清培養(yǎng)液重懸并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，取200 μl，5×105/孔細(xì)胞加入Transwell上小室，下小室加入600 μl 10% BSA的RPMI1640培養(yǎng)基，置于生化培養(yǎng)箱中37℃，5%CO2培養(yǎng)24 h。10%甲醇固定10 min，0.1%結(jié)晶紫染色10 min后，洗凈結(jié)晶紫，光鏡下細(xì)胞計數(shù)，200倍光鏡下觀察膜背面侵襲的細(xì)胞數(shù)，隨機(jī)統(tǒng)計從中間和四周5個視野的總數(shù)，重復(fù)3次，求其平均值及標(biāo)準(zhǔn)差。

1.5.3細(xì)胞劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力 將6孔板中處理好的兩組細(xì)胞含10% BSA的RPMI1640培養(yǎng)基棄去，5 ml PBS洗2次，100 μl移液槍頭垂直水平面進(jìn)行劃痕，每孔3～5條，再次5 ml PBS洗2次后加入無血清RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，于0、12 h進(jìn)行拍照。ImageJ軟件對細(xì)胞12 h前后的劃痕面積占視野的百分比進(jìn)行計算，取同一視野12 h前后面積的差值(△S)，對照組細(xì)胞△S為△S0，七氟烷組為△S1，重復(fù)5個視野計算平均值及標(biāo)準(zhǔn)差。

1.5.4Western印跡檢測細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá) 收集10 cm培養(yǎng)皿中處理好的兩組細(xì)胞，500 μl胰蛋白酶消化3 min，1 ml含10% BSA的RPMI1640培養(yǎng)基終止消化后轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中，500 r/min離心5 min，去上清液，PBS洗2次，加入500 μl細(xì)胞裂解液及55 μl 10×cocktail，冰上進(jìn)行裂解2 h后，最大轉(zhuǎn)速16 000 r/min，4℃離心15 min，收集上清液于新的1.5 ml離心管中，使用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量分析，和上樣緩沖液混合并配平體系，每孔上樣量50 μg。配制10%丙烯酰胺膠，蛋白marker上至兩側(cè)上樣孔中，中間孔進(jìn)行上樣，上樣后80 V穩(wěn)壓跑出積層膠，調(diào)整電壓至120 V穩(wěn)壓跑1 h，250 mA穩(wěn)流濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，2 h后取出膜，麗春紅染色，剪取目的條帶后10%脫脂奶粉封閉2 h，一抗4℃搖床孵育過夜，孵育濃度為：E-cadherin抗體(1∶1 000)，N-cadherin(1∶1 000)，snail抗體(1∶500)，CD133(1∶500)，MMP-2抗體(1∶1 000)，MMP-9抗體(1∶1 000)，β-Actin(1∶2 000)，12 h后PBS洗膜3次，每次10 min，相應(yīng)二抗孵育1 h，孵育濃度為1∶2 000，發(fā)光液按A、B液1∶1混合后曝光顯影，ImageLab4.2軟件進(jìn)行灰度掃描，樣品目的蛋白灰度比值為樣品DPI值與內(nèi)參基因β-Actin DPI值的比值。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1兩組細(xì)胞侵襲能力比較 七氟烷組細(xì)胞24 h后穿透基底膜的細(xì)胞數(shù)〔(48.1±8.7)個〕顯著低于對照組〔(76.3±11.5)個，t=11.31，P<0.01〕，見圖1。

2.2兩組細(xì)胞遷移能力比較 △S1(13.82±4.73)顯著低于△S0(22.96±6.45，t=7.23，P<0.01)，見圖2。

2.3兩組細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)分子表達(dá)比較 七氟烷組相比對照組細(xì)胞E-cadherin及Zo-1表達(dá)顯著上調(diào)，N-cadherin及snail表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)；七氟烷組E-cadherin、Zo-1相對灰度值(0.336±0.052，0.406±0.065)顯著高于對照組(0.218±0.067，0.310±0.042;t=8.80，7.85;均P<0.01)。N-cadherin、snail相對灰度值(0.479±0.046,0.381±0.063)顯著低于對照組(0.623±0.064，0.537±0.054;t=11.56，11.89;均P<0.01)。見圖2。

圖1 兩組細(xì)胞穿透基底膜的情況(×200)

圖2 兩組細(xì)胞劃痕修復(fù)情況

圖3 Western印跡檢測兩組細(xì)胞EMT蛋白表達(dá)情況

2.4兩組細(xì)胞干性相關(guān)分子及侵襲相關(guān)分子表達(dá)比較 七氟烷組相比對照組CD133、MMP-2及MMP-9表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)，七氟烷組細(xì)胞CD133、MMP-2、MMP-9相對灰度值(0.383±0.061,0.486±0.055,0.160±0.034)顯著低于對照組(0.452±0.072，0.579±0.074，0.241±0.038；t=4.62，6.38，10.04；均P<0.01)。見圖4。

圖4 Western印跡檢測兩組細(xì)胞干性相關(guān)及侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)情況

3 討 論

七氟烷是臨床上廣泛應(yīng)用的吸入性麻醉藥，有研究顯示其可選擇性舒張腦血管平滑肌，降低腦血管阻力，增加麻醉過程中腦組織的供氧及灌注〔5〕，同時可降低腦的氧代謝率，起到對腦組織的保護(hù)作用〔6〕。Liang等〔7～10〕研究顯示，七氟烷可通過抑制p38/MAPK、缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α及MMP家族的表達(dá)抑制非小細(xì)胞肺癌侵襲轉(zhuǎn)移能力，且可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞放療敏感性增加。徐紅萌等〔11〕發(fā)現(xiàn)七氟烷可下調(diào)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞MMP-9的表達(dá)，進(jìn)而抑制其侵襲遷移能力。Wei等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)七氟烷可誘導(dǎo)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的凋亡，進(jìn)而降低細(xì)胞活力，增加凋亡小體〔13〕。

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示七氟烷可減弱人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。EMT是與腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的生物學(xué)過程〔13〕，其代表性分子包括E-cadherin、N-cadherin、snail及Zo-1等。E-cadherin是上皮細(xì)胞表達(dá)的一種重要的黏附分子，代表細(xì)胞的黏附強(qiáng)度，惡變過程中E-cadherin的表達(dá)下調(diào)往往意味著細(xì)胞活動性增加，腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)〔14〕；N-cadherin及snail是間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，其表達(dá)上調(diào)意味著細(xì)胞EMT程度加深，是腫瘤分化不良的標(biāo)志；Zo-1是細(xì)胞間隙封閉的關(guān)鍵因子，其下調(diào)可導(dǎo)致細(xì)胞間緊密連接中斷，促進(jìn)癌細(xì)胞的擴(kuò)散〔15〕。本研究結(jié)果提示七氟烷可能通過抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞EMT過程，抑制細(xì)胞的侵襲和遷移。MMP-2及MMP-9是MMP家族的重要成員，可降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力〔16〕；CD133是腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物，其表達(dá)上調(diào)往往意味著腫瘤細(xì)胞惡性程度加深，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的惡性行為〔17〕。本研究結(jié)果提示七氟烷抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力可能與下調(diào)MMP及逆轉(zhuǎn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞干性有關(guān)。

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R73

A

1005-9202(2017)24-6054-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.021

1 河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科

2 河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科

郭孝龍(1972-)，男，博士，主任醫(yī)師，主要從事神經(jīng)外科研究。

謝小娟(1976-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，副教授，主要從事腫瘤患者圍麻醉期應(yīng)激調(diào)控研究。

〔2017-05-17修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)