陸林杰 盧 怡 (錦州醫(yī)科大學(xué)中國人民解放軍第306醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，北京 100101)

HTRA1在中老年人牙周膜組織中的表達(dá)及對(duì)細(xì)胞增殖的作用

陸林杰 盧 怡 (錦州醫(yī)科大學(xué)中國人民解放軍第306醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，北京 100101)

目的探討絲氨酸蛋白酶(HTRA)1在中老年人牙周膜組織中的表達(dá)及對(duì)細(xì)胞增殖的作用。方法收集該院口腔頜面外科50歲以上患者的患者前磨牙8顆和第三磨牙4顆，要求牙根結(jié)構(gòu)完整，無明顯牙周組織炎癥。RT-PCR和免疫組化法分別檢測人牙周膜組織中HTRA1 mRNA和蛋白表達(dá)情況；組織塊法培養(yǎng)原代人牙周膜細(xì)胞，3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2'5-二苯基四氮唑溴藍(lán)(MTT)法檢測增殖情況；慢病毒轉(zhuǎn)染使細(xì)胞中HTRA1過表達(dá)和基因沉默，以空載體為對(duì)照，使用細(xì)胞增殖與活性檢測試劑盒(CCK8)檢測HTRA1對(duì)人牙周膜細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果RT-PCR顯示HTRA1 mRNA在牙周膜組織中呈陽性表達(dá)；免疫組化染色顯示，HTRA1在牙周組織中呈陽性表達(dá)，主要表達(dá)于牙周膜細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)中。人牙周膜細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)后生長曲線符合該細(xì)胞的生長特征。慢病毒轉(zhuǎn)染成功干預(yù)HTRA1基因表達(dá)后，在培養(yǎng)1、3、5、7、9 d時(shí)，過表達(dá)組牙周膜細(xì)胞增殖速度明顯低于過表達(dá)空載體對(duì)照組，基因沉默組牙周膜細(xì)胞增殖速度明顯高于基因沉默空載體對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論HTRA1 mRNA及蛋白均表達(dá)于中老年人牙周膜組織中，并對(duì)牙周膜細(xì)胞增殖起到明顯調(diào)節(jié)作用。

絲氨酸蛋白酶1；牙周膜；細(xì)胞增殖

隨著年齡的增長，牙周膜中膠原纖維增多，細(xì)胞成分減少，厚度變薄，易引發(fā)牙周病，是中老年人失牙的主要原因之一〔1〕。絲氨酸蛋白酶(HTRA)廣泛存在于人體多個(gè)組織中，參與細(xì)胞增殖、凋亡、炎性反應(yīng)等生理和疾病過程，其中HTRA1是重要的礦化調(diào)節(jié)因子，與關(guān)節(jié)炎、血管鈣化等病理性礦化存在明顯關(guān)聯(lián)〔2〕。目前HTRA1在人牙周膜中的生物學(xué)作用尚未明確。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，HTRA1在人牙周膜細(xì)胞成骨分化中起到重要調(diào)節(jié)作用〔3〕，本研究擬探討HTRA1在中老年人牙周膜組織中的表達(dá)及對(duì)牙周膜細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Sigma)；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)細(xì)胞增殖試劑盒、cDNA合成試劑盒(北京賽馳生物科技有限公司)；兔抗人HTRA1多克隆抗體(上海領(lǐng)成生物科技有限公司)；細(xì)胞增殖與活性檢測試劑盒(CCK8)(北京利維寧生物科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定 收集錦州醫(yī)科大學(xué)中國人民解放軍第306醫(yī)院口腔頜面外科拔除的50歲以上患者的前磨牙4顆，牙根結(jié)構(gòu)完整，無明顯牙周組織炎癥。磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后刮取牙根部1/3的牙周膜組織，放入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37℃ CO2孵箱中培養(yǎng)。牙周膜細(xì)胞約90%匯合后進(jìn)行傳代，每3 d換1次細(xì)胞培養(yǎng)液。免疫細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定細(xì)胞來源，選4～6代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2標(biāo)本收集和蘇木素-伊紅(HE)染色 收集該院口腔頜面外科拔除的50歲以上第三磨牙4顆，無明顯牙周炎癥。沖洗后用4%多聚甲醛溶液固定48 h，10%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片備用。取部分切片進(jìn)行常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3RT-PCR檢測 收集與上述要求相同的4顆前磨牙，刮取牙根部1/3的牙周膜組織，研碎后用Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)體系為20 μl，常規(guī)反應(yīng)條件下共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，引物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。電泳分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.4免疫組化染色 取部分切片脫蠟后在3% H2O237℃下孵育45 min，PBS沖洗后血清封閉30 min，加兔抗人HTRA1多克隆抗體(1∶100)，4℃孵育過夜，PBS代替一抗作陰性對(duì)照；37℃孵育30 min后加二抗，37℃孵育20 min，沖洗后加辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的工作液，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色、蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封片，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5人牙周膜細(xì)胞增殖情況檢測 采用MTT法進(jìn)行檢測，將第3代人牙周膜細(xì)胞按1×103個(gè)/孔的密度接種到96孔板，培養(yǎng)第1、3、5、7、9、11、14天時(shí)，每孔分別加入MTT溶液20 μl，終濃度為5 mg/ml，孵育4 h后終止反應(yīng)，棄去上清后每孔加150 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩20 min后放入酶標(biāo)儀，在490 nm波長處讀取各孔的吸光度值，以培養(yǎng)第1天吸光度值為對(duì)照數(shù)據(jù)。

1.2.6慢病毒感染人牙周膜細(xì)胞 使用HTRA1過表達(dá)慢病毒載體和shHTRA1慢病毒載體感染人牙周膜細(xì)胞，成功得到HTRA1過表達(dá)人牙周膜細(xì)胞(過表達(dá)組)和基因沉默的人牙周膜細(xì)胞(基因沉默組)；用空載體慢病毒感染的人牙周膜細(xì)胞為空白對(duì)照組，分別為過表達(dá)空載體對(duì)照組(NC1組)和基因沉默空載體對(duì)照組(NC2組)；不加慢病毒的細(xì)胞為陰性對(duì)照組。觀察培養(yǎng)1、3、5、7、9 d時(shí)HTRA1基因?qū)θ搜乐苣ぜ?xì)胞增殖的影響。

1.2.7慢病毒感染后細(xì)胞增殖情況檢測 將過表達(dá)組和NC1組、基因沉默組和NC2組人牙周膜細(xì)胞用胰酶消化后按5×103個(gè)/孔的密度接種到96孔板，培養(yǎng)第1、3、5、7、9天時(shí)用PBS洗滌3次，按試劑盒說明100 μl/孔加入CCK8工作液，孵育4 h，在450 nm波長處讀取吸光度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1HTRA1在牙周膜組織中的蛋白及mRNA表達(dá) RT-PCR顯示，HTRA1 mRNA在牙周膜組織中呈陽性表達(dá)。免疫組化染色顯示，HTRA1在牙周膜組織中的牙周膜細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、基質(zhì)中均呈陽性表達(dá)，主要表達(dá)于牙周膜細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)中，見圖1。

2.2牙周膜細(xì)胞增殖情況 MTT法檢測顯示，牙周膜細(xì)胞培養(yǎng)1～3 d生長相對(duì)緩慢，第1、3天的吸光度值分別為：0.181±0.057、0.208±0.060；3 d后增殖速度明顯增加并持續(xù)到第9天，第5、7、9天吸光度值分別為0.428±0.093、0.581±0.072、0.814±0.052；9～14 d增殖速度明顯減緩并逐漸進(jìn)入平臺(tái)期，第11、14天吸光度值分別為0.782±0.115、0.837±0.160，符合細(xì)胞生長潛伏期、對(duì)數(shù)生長期、平臺(tái)期3個(gè)階段。

2.3慢病毒感染牙周膜細(xì)胞情況 慢病毒感染96 h后觀察綠色熒光蛋白表達(dá)，確定轉(zhuǎn)染效率。熒光顯微鏡下可見NC1和NC2組均存在明顯的綠色熒光蛋白表達(dá)，而陰性對(duì)照組未見綠色熒光(見圖2)。說明慢病毒成功轉(zhuǎn)染牙周膜細(xì)胞。

圖1 HTRA1在牙周膜組織中的蛋白表達(dá)(×400)

2.4HTRA1基因?qū)ρ乐苣ぜ?xì)胞增殖的影響 培養(yǎng)1、3、5、7、9 d時(shí)過表達(dá)組牙周膜細(xì)胞增殖的吸光度值分別為：0.905±0.094、1.642±0.049、1.122±0.057、1.118±0.041、1.116±0.031；NC1組分別為：1.060±0.064、1.913±0.097、1.953±0.268、1.294±0.157、1.250±0.113；基因沉默組分別為：0.531±

0.055、0.984±0.067、1.637±0.113、2.355±0.183、2.566±0.197；NC2組分別為：0.418±0.026、0.820±0.034、1.178±0.073、1.624±0.082、1.823±0.091。過表達(dá)組牙周膜細(xì)胞增殖速度明顯低于NC1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；基因沉默組周膜細(xì)胞增殖速度明顯高于NC2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 慢病毒感染牙周膜細(xì)胞96 h后熒光蛋白表達(dá)情況(×400)

3 討 論

人牙周膜成纖維細(xì)胞是牙周組織修復(fù)、再生的基礎(chǔ)，HTRA1在不同組織中的表達(dá)具有特異性，與多種病理生理過程有關(guān)。已有研究發(fā)現(xiàn)，人牙周膜細(xì)胞中存在HTRA1表達(dá)〔4〕，但其在人牙周膜組織中的生物學(xué)作用仍未明確。HTRA1存在于體內(nèi)多個(gè)正常組織中〔5〕，本研究結(jié)果提示，HTRA1在人牙周膜組織中可能發(fā)揮生物學(xué)作用。進(jìn)一步分析結(jié)果顯示，高表達(dá)HTRA1后可明顯抑制人牙周膜細(xì)胞增殖，基因沉默后可顯著促進(jìn)牙周膜細(xì)胞增殖。相關(guān)研究顯示，HTRA1可明顯抑制多種細(xì)胞的增殖和遷移，當(dāng)其低表達(dá)時(shí)可起到促進(jìn)作用，如影響卵巢癌細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞、視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞等〔6〕。本研究有研究顯示，HTRA1基因可正向促進(jìn)人牙周膜細(xì)胞成骨分化〔5〕。因此推測HTRA1基因可通過抑制牙周膜細(xì)胞增殖來促進(jìn)向成骨細(xì)胞分化，但確切機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

1羅愛華,謝 紅,岳朝暉,等.中老年牙周病流行趨勢現(xiàn)狀及其相關(guān)危險(xiǎn)因素〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2016;36(17):4334-5.

2Supan JI,Shimomachi M,Hasan M,etal.HtrA1 is induced by oxidative stress and enhances cell senescence through p38 MAPK pathway〔J〕.Exp Eye Res,2013;112(5):79-92.

3Li R,Zhang Q.HtrA1 may regulate the osteogenic differentiation of human periodontal ligament cells by TGF-β1〔J〕.J Mol Histol,2015;46(2):137-44.

4廖雪峰.鹽酸米諾環(huán)素軟膏聯(lián)合甲硝唑緩釋藥膜治療慢性牙周炎的療效觀察〔J〕.北華大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2014;15(2):229-32.

5Wang G,Dubovy SR,Kovach JL,etal.Variants at chromosome 10q26 locus and the expression of HTRA1 in the retina〔J〕.Exp Eye Res,2013;112:102-5.

6Mullany SA,Moslemi-Kebria M,Rattan R,etal.Expression and functional significance of HtrA1 loss in endometrial cancer〔J〕.Clin Cancer Res,2011;17(3):427-36.

R781.4

A

1005-9202(2017)24-6031-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.012

北京市科委首都市民健康項(xiàng)目(No.Z151100003915091)

盧 怡(1971-)，女，碩士，副教授，副主任醫(yī)師，主要從事牙科學(xué)研究。

陸林杰(1985-)，男，碩士，醫(yī)師，主要從事牙科學(xué)研究。

〔2017-05-23修回〕

(編輯 郭 菁/滕欣航)