馮 云 劉 津 唐海丹 黃曉華 陳海燕 蘇 麗

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣西 百色 533000)

枸杞多糖對(duì)癲癇大鼠神經(jīng)的保護(hù)作用及機(jī)制

馮 云 劉 津 唐海丹 黃曉華 陳海燕 蘇 麗

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣西 百色 533000)

目的探討枸杞多糖(LBP)對(duì)癲癇大鼠神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。方法選擇健康5周齡雄性SD大鼠75只，隨機(jī)分為對(duì)照組、癲癇組和LBP干預(yù)組各25只，LBP干預(yù)組灌服50 mg/kg LBP，癲癇組和LBP干預(yù)組大鼠癲癇模型制備采用腹腔注射氯化鋰-匹羅卡品法，對(duì)照組給予等劑量生理鹽水。大鼠海馬組織由溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)標(biāo)記，并進(jìn)行免疫熒光染色，對(duì)比各組BrdU陽性細(xì)胞數(shù)量、抗兔微管相關(guān)蛋白(MAP)-2及抗小鼠神經(jīng)元核抗原(NeuN)陽性神經(jīng)元細(xì)胞周長及分化率。結(jié)果與對(duì)照組相比，癲癇組BrdU陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增加(P<0.05)；LBP干預(yù)組BrdU陽性細(xì)胞數(shù)低于癲癇組(P<0.05)；癲癇組大鼠MAP-2、NeuN陽性神經(jīng)元周長及分化率低于對(duì)照組(P<0.05)，LBP干預(yù)組大鼠MAP-2、NeuN陽性神經(jīng)元周長及分化率顯著高于癲癇組(P<0.05)。結(jié)論LBP對(duì)癲癇模型大鼠進(jìn)行干預(yù)后，大鼠海馬齒狀回顆粒層BrdU陽性細(xì)胞數(shù)、MAP-2和NeuN陽性神經(jīng)元細(xì)胞表達(dá)均出現(xiàn)一定程度改善，具有較好的神經(jīng)保護(hù)作用。

癲癇；枸杞多糖；NeuN陽性神經(jīng)元

有研究〔1〕報(bào)道在生長發(fā)育階段若存在癲癇長期反復(fù)發(fā)作或是癲癇持續(xù)狀態(tài)，可導(dǎo)致個(gè)體存在語言、記憶甚至學(xué)習(xí)等認(rèn)知功能障礙。病理生理學(xué)研究證實(shí)〔2〕，在癲癇發(fā)作情況下，能夠?qū)е潞ｑR神經(jīng)出現(xiàn)異常。枸杞是一種中醫(yī)滋補(bǔ)藥材，富含多種營養(yǎng)成分、微量元素，其中重要的一種有效成分是枸杞多糖(LBP)。LBP能夠發(fā)揮降血脂、降血糖、抗氧化及抗腫瘤等作用，還能有效保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)，并對(duì)損傷的神經(jīng)起到一定修復(fù)作用〔3〕。本研究旨在探討LBP對(duì)癲癇大鼠神經(jīng)細(xì)胞的作用，分析LBP對(duì)海馬神經(jīng)元相關(guān)保護(hù)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇健康清潔級(jí)雄性SD大鼠75只，體重(200.1±15.5)g(寧夏醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供)。大鼠飼養(yǎng)每籠放置2只，室內(nèi)溫度控制在(20.5±1.2)℃，相對(duì)濕度控制在(50.3±5.1)%，飲食飲水均進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化供給，所有SD實(shí)驗(yàn)大鼠均先適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w。將實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行隨機(jī)均衡分組，分為對(duì)照組、癲癇組及LBP干預(yù)組，各25只。

1.1.2主要設(shè)備和試劑 HM650V振動(dòng)切片機(jī)(Microm公司提供)；激光熒光顯微鏡(Olympus公司提供)；培養(yǎng)板、培養(yǎng)箱等。主要試劑包括氯化鋰、溴化甲基阿托品、阿托品、地西泮、苯巴比妥(天津市化學(xué)試劑研究所提供)；匹羅卡品、溴脫氧尿嘧啶(BrdU)，Sigma公司提供；小鼠抗大鼠BrdU (Immunologicals Direect公司提供)；抗兔微管相關(guān)蛋白(MAP)-2多克隆抗體(購自Chemicon公司)；抗小鼠神經(jīng)元核抗原(NeuN)單克隆抗體(購自Millipore公司)；DMEM/F12(1∶1)無血清培養(yǎng)液；磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.2 )。

1.2方法

1.2.1癲癇模型 制備癲癇模型采用經(jīng)典的氯化鋰-匹羅卡品注射法〔4〕：腹腔注射濃度為127 mg/kg的氯化鋰，12 h后進(jìn)行10 mg/kg溴化甲基阿托品腹腔注射，注射完成后30 min進(jìn)行(100 ±5)mg/kg劑量的匹羅卡品腹腔注射。若大鼠癇性持續(xù)發(fā)作時(shí)間超過1 h，或大鼠出現(xiàn)嚴(yán)重抽搐至瀕危狀態(tài)，則需要腹腔注射4 mg/kg地西泮、1 mg/kg阿托品 或25 mg/kg苯巴比妥，直至癇性解除。經(jīng)典癲癇發(fā)作標(biāo)準(zhǔn)〔4〕分為6級(jí)：0級(jí)：實(shí)驗(yàn)大鼠無任何異常反應(yīng)；Ⅰ級(jí)：大鼠出現(xiàn)面部節(jié)律性抽動(dòng)；Ⅱ級(jí)：大鼠出現(xiàn)甩尾或是點(diǎn)頭動(dòng)作；Ⅲ級(jí)：大鼠某一肢體出現(xiàn)抽動(dòng)動(dòng)作；Ⅳ級(jí)：大鼠軀體僵直或是四肢抽動(dòng)；V級(jí)：大鼠完全僵直，并出現(xiàn)陣攣。大鼠癲癇發(fā)作在Ⅳ級(jí)以上，且發(fā)作解除后狀態(tài)良好，可判斷為合格癲癇大鼠模型。對(duì)照組則采用等量生理鹽水替代氯化鋰-匹羅卡品，其他處理方式與癲癇組相同。癲癇組、LBP干預(yù)組實(shí)驗(yàn)均選擇等級(jí)在Ⅳ級(jí)以上的大鼠。LBP干預(yù)組采用LBP(寧夏啟元藥業(yè)有限公司，批號(hào)：040603)50 mg/kg灌服，并在造模后持續(xù)灌服2 w。

1.2.2BrdU標(biāo)記處理 所有大鼠在進(jìn)行末次相關(guān)操作后24 h進(jìn)行BrdU腹腔注射〔5〕，劑量為100 mg/kg，注射后24 h采用4%多聚甲醛PB液150 ml對(duì)大鼠進(jìn)行灌注，直至大鼠全身呈僵硬狀。把大鼠處死后，取腦，放入相同固定液固定24 h，再把大腦置于PB液(含10%～20%蔗糖)中，4℃環(huán)境中過夜，直至沉底。取出樣本后置于冠狀位，切取1～2 mm3大腦中海馬組織，并由濃度為0.01 mol/L的PBS配制成5%瓊脂，并用其固定海馬組織切片，厚度50 μm，每只連續(xù)取片10張。

1.2.3免疫熒光染色 將各組大鼠海馬組織切片進(jìn)行PBS漂洗，每次10 min，并漂洗3次，采用2N-HCl在37℃環(huán)境中進(jìn)行抗原修復(fù)，持續(xù)30 min，后用0.1 mol/L硼酸緩沖液(pH8.5)沖洗10 min，PBS漂洗2次，分別持續(xù)10 min，大鼠BrdU以1∶500比例加入0.01 mol/L胎牛血清(BSA)-PBS，置于4℃冰箱內(nèi)過夜，再進(jìn)行3次PBS漂洗，每次10 min。將0.01 mol/L BSA-PBS內(nèi)加入比例為1∶200標(biāo)記了Cy3的猴抗大鼠IgG，常溫下再孵育1 h，隨后采用PBS漂洗干凈后，甘油封片。 MAP-2/NeuN免疫熒光染色：常規(guī)漂洗、固定、清洗后加入含10%山羊血清的抗體稀釋液(pH7.4)，4℃環(huán)境下行2 h封閉，封閉液清洗后，加入200 μl 1∶1 000稀釋的MAP-2多克隆抗體、200 μl 1∶500 NeuN單克隆抗體，室溫下輕搖1 h，隨后置于4℃冰箱中12 h。設(shè)定激光共聚焦顯微鏡波長，從X、Y、Z軸三個(gè)方向進(jìn)行觀察。

1.2.4觀察指標(biāo) 分析海馬神經(jīng)干細(xì)胞向MAP-2陽性神經(jīng)元、NeuN陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞分化等情況，統(tǒng)計(jì)增殖細(xì)胞的數(shù)量，采用Leica Qiwn Plus軟件分析MAP-2/NeuN陽性神經(jīng)元的周長及分化率。癲癇發(fā)作情況下，位于海馬齒狀回內(nèi)的BrdU陽性細(xì)胞出現(xiàn)紅色熒光，計(jì)算BrdU陽性細(xì)胞數(shù)量。

2 結(jié) 果

2.1BrdU陽性細(xì)胞數(shù) 三組大鼠BrdU陽性顆粒細(xì)胞數(shù)之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組〔(20.23±7.96)個(gè)〕相比，癲癇組大鼠、LBP干預(yù)組BrdU陽性細(xì)胞數(shù)〔(32.42±8.43)個(gè)，(23.58±6.98)個(gè)〕顯著增加(P<0.05)。與癲癇組相比，LBP干預(yù)組BrdU陽性細(xì)胞數(shù)顯著降低(P<0.05)。見圖1。

2.2MAP-2陽性神經(jīng)元周長及分化率 三組大鼠MAP-2陽性神經(jīng)元周長及分化率的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。LBP干預(yù)組、對(duì)照組大鼠MAP-2陽性神經(jīng)元周長及分化率高于癲癇組，且LBP干預(yù)組高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1，圖2。

2.3NeuN陽性神經(jīng)元表達(dá)情況及分化率 三組大鼠的NeuN陽性神經(jīng)元周長和NeuN陽性神經(jīng)元分化率之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。LBP干預(yù)組、對(duì)照組大鼠NeuN陽性神經(jīng)元周長及分化率高于癲癇組，且LBP干預(yù)組高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2，圖3。

圖1 BrdU陽性細(xì)胞免疫熒光染色(×50)

圖2 MAP-2陽性神經(jīng)元免疫熒光染色(×50)

組別MAP?2陽性神經(jīng)元周長(μm)MAP?2陽性神經(jīng)元分化率(%)對(duì)照組93264±88472)486±1432)癲癇組65712±5548322±056LBP干預(yù)組105232±321211)2)785±2671)2)F/P值27000/000043566/0000

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與癲癇組比較：2)P<0.05；下表同

圖3 NeuN陽性神經(jīng)元免疫熒光染色(×50)

組別NeuN陽性神經(jīng)元周長(μm)NeuN陽性神經(jīng)元分化率(%)對(duì)照組64246±119352)471±1342)癲癇組54655±9726346±091LBP干預(yù)組74364±158341)2)724±1631)2)F/P值14936/000052673/0000

3 討 論

癲癇易導(dǎo)致患者出現(xiàn)認(rèn)知障礙，記憶、學(xué)習(xí)、語言等功能受到損害，其發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚未完全確認(rèn)，治療也缺少金標(biāo)準(zhǔn)〔6〕。研究〔7〕表明，癲癇發(fā)作與大腦內(nèi)海馬存在密切關(guān)系，動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)海馬神經(jīng)在癲癇發(fā)生發(fā)展過程中起到一定作用，在癲癇發(fā)病早期進(jìn)行海馬神經(jīng)干預(yù)尤為重要。枸杞子作為一種傳統(tǒng)中藥，具有味甘性平等特性，發(fā)揮明目養(yǎng)肝、補(bǔ)髓滋腎及祛風(fēng)等作用。研究表明〔8〕，枸杞中含有主要成分LBP，LBP具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、抗腫瘤等多種生物活性作用。尤其近年來對(duì)神經(jīng)保護(hù)生物活性研究成為熱點(diǎn)，但對(duì)于這種保護(hù)作用機(jī)制并不是有深入明確的研究，且LBP屬于天然藥物提取物，安全易吸收、價(jià)格低廉、易透過血腦屏障，若可以利用LBP的保護(hù)神經(jīng)作用作為治療神經(jīng)損傷相關(guān)疾病的輔助措施，對(duì)癲癇等神經(jīng)功能性疾病的研究具有重要的意義。有研究結(jié)果證實(shí)〔9〕，LBP能夠?qū)Υ笫箦i中毒后神經(jīng)發(fā)生數(shù)量進(jìn)行有效干預(yù)，從而對(duì)小鼠記憶、學(xué)習(xí)能力起到改善作用，與本文結(jié)果一致。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大鼠癲癇發(fā)病后，海馬齒狀回顆粒細(xì)胞層的相關(guān)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目高于對(duì)照組，LBP干預(yù)組在癲癇模型制作前進(jìn)行干預(yù)，干預(yù)完成后齒狀回顆粒層細(xì)胞增生水平顯著降低。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是癲癇一旦發(fā)作，會(huì)導(dǎo)致海馬神經(jīng)異常；LBP具有保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用，LBP干預(yù)后在抑制乳酸脫氫酶釋放的同時(shí)，還可以下調(diào)caspase-3的活性，降低神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率；進(jìn)行LBP干預(yù)后，海馬神經(jīng)干細(xì)胞向 MAP-2/NeuN陽性神經(jīng)元分化，LBP干預(yù)組細(xì)胞周長及分化率均顯著高于癲癇組。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，癲癇發(fā)病機(jī)制主要與大腦內(nèi)氧自由基過高導(dǎo)致的神經(jīng)元脫失有關(guān)〔10〕。LBP易進(jìn)入血腦屏障，提高實(shí)驗(yàn)大鼠體內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)及超氧化物歧化酶(SOD)活性，調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激狀態(tài)，通過P38MAPK途徑有效抑制誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，從而可以清除過量的自由基〔11〕；降低脂質(zhì)過氧化水平，保證神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的完整性，促進(jìn)海馬神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為 MAP-2/NeuN陽性神經(jīng)元，修復(fù)損傷的神經(jīng)元等，降低對(duì)損傷認(rèn)知功能的程度，減輕記憶、學(xué)習(xí)等認(rèn)知功能障礙情況〔12〕。綜上所述，LBP能夠有效保護(hù)大腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞，減輕神經(jīng)元凋亡，對(duì)癲癇、阿爾茨海默病等疾病引起的神經(jīng)元損傷或異常增生起到干預(yù)作用；LBP可以通過清除大腦內(nèi)自由基，降低脂質(zhì)過氧化，而促進(jìn)認(rèn)知功能。本研究的不足之處在于只對(duì)大鼠進(jìn)行了相關(guān)研究，并未在其他的動(dòng)物中重現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最重要的是未真正在人體上進(jìn)行研究，但是依然為臨床上治療癲癇提供了理論依據(jù)，為更好地治療癲癇奠定基礎(chǔ)。

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R749

A

1005-9202(2017)24-6036-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.014

馮 云(1982-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事神經(jīng)病學(xué)研究。

〔2017-01-17修回〕

(編輯 袁左鳴)