李珊珊，王忠慧，楊會(huì)，全宇航，龔玲俐

云南省腫瘤醫(yī)院 昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院，昆明650118

骨肉瘤是骨組織最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，青少年多發(fā)。目前骨肉瘤的治療主要是新輔助化療和手術(shù)，5年生存率為60%～70%[1]。七氟烷是常用的吸入麻醉劑，藥理研究顯示，七氟烷除了具有麻醉作用外，還可以降低缺血再灌注損傷、保護(hù)重要器官功能以及減輕炎癥反應(yīng)、降低肺泡毛細(xì)血管通透性等[2～4]。近年研究發(fā)現(xiàn)，七氟烷的應(yīng)用與腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)[5]。七氟烷對(duì)不同的腫瘤細(xì)胞的作用表現(xiàn)不完全一致，且不同濃度七氟烷對(duì)同種腫瘤細(xì)胞的作用也不盡相同。臨床常用的七氟烷濃度為1.0%～5.1%。Argano等[6]報(bào)道，1.7%七氟烷可促進(jìn)原發(fā)性犬乳腺癌細(xì)胞的增殖能力，但對(duì)轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞則表現(xiàn)為濃度依賴性的抑制作用。Bundscherer等[7]報(bào)道，5.1%七氟烷可以顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生物活性。還有研究顯示，3.0%七氟烷對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能表現(xiàn)為抑制，但相同濃度的七氟烷則可促進(jìn)卵巢癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[8，9]。此外，七氟烷對(duì)白血病干/祖細(xì)胞呈濃度依賴性的抑制作用[10]，而2.0%七氟烷能夠明顯促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)干細(xì)胞的生長[11]。2017年5月～2019年2月，我們觀察了不同濃度七氟烷對(duì)人骨肉瘤saos2細(xì)胞增殖、遷移能力的影響，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人骨肉瘤saos2細(xì)胞由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所提供。七氟烷由恒瑞醫(yī)藥有限公司提供。胎牛血清購自BIOSHARP公司，RPMI1640培養(yǎng)基、CCK-8試劑盒購自南京建成生物工程研究所。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司，傷口愈合實(shí)驗(yàn)使用ibidi遷移插件。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 向細(xì)胞中加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。取對(duì)數(shù)期生長細(xì)胞，配制成1×106/mL的細(xì)胞懸液，接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，分別標(biāo)記為對(duì)照組、1.7%七氟烷組、3.4%七氟烷組、5.1%七氟烷組。

1.3 細(xì)胞增殖能力觀察 采用CCK-8法。向細(xì)胞中加入0.25%胰酶消化，制備細(xì)胞懸液，按2.5×103/孔接種至96孔板內(nèi)，過夜培養(yǎng)后，將1.7%七氟烷組、3.4%七氟烷組、5.1%七氟烷組分別置于特制無菌密閉容器中，容器進(jìn)氣口與七氟烷麻醉機(jī)連接，出氣口與氣體分析儀連接。在達(dá)到相應(yīng)的七氟烷濃度后，同時(shí)夾閉進(jìn)氣口和出氣口，使細(xì)胞在七氟烷中暴露2 h。處理完畢后，從密閉容器中取出細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h。對(duì)照組不進(jìn)行七氟烷氣體暴露，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔加入10 μL CCK-8試劑孵育2 h，上酶標(biāo)儀，于450 nm波長下檢測吸光度A值。細(xì)胞增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4 細(xì)胞遷移能力觀察 采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。向細(xì)胞中加入0.25%胰酶消化，制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×104/mL。向ibidi插件的左右孔中各加入100 μL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至融合度達(dá)90%～100%。用鑷子將傷口愈合插件拔出，PBS清洗。按照1.3的方法，將1.7%七氟烷組、3.4%七氟烷組、5.1%七氟烷組在不同濃度的七氟烷中暴露2 h，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；對(duì)照組則不進(jìn)行七氟烷氣體暴露，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。記錄0、12 h傷口愈合情況。采用Image J圖像分析軟件計(jì)算劃痕愈合率。劃痕愈合率=(0 h劃痕面積-24 h劃痕面積)/0 h劃痕面積×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5 細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)蛋白及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法檢測細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白E型鈣黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)及MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)表達(dá)。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，按1×105/孔接種于6孔板。待細(xì)胞貼壁，按照1.3的方法，將1.7%七氟烷組、3.4%七氟烷組、5.1%七氟烷組在不同濃度的七氟烷中暴露2 h，對(duì)照組則不進(jìn)行七氟烷氣體暴露，然后在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h；取各組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。配制SDS-PAGE電泳液，電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉，4 ℃搖床過夜。棄封閉液，清洗，加入TBST溶液1∶1 000稀釋的一抗，4 ℃孵育過夜。加入5%脫脂奶粉TBST溶液1∶2 000稀釋的抗兔抗體，室溫?fù)u床2 h。TBST洗滌后，加入適量顯影劑，觀察圖像并拍照，采用Image J軟件對(duì)條帶的灰度值進(jìn)行分析。以GAPDH作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖抑制率比較 對(duì)照組、1.7%七氟烷組、3.4%七氟烷組、5.1%七氟烷組的細(xì)胞增殖抑制率分別為0、9.35%±1.23%、14.36%±2.46%、19.26%±3.71%，不同濃度七氟烷組細(xì)胞增殖抑制率均高于對(duì)照組，5.1%七氟烷組增殖抑制率高于1.7%、3.4%七氟烷組，3.4%七氟烷組高于1.7%七氟烷組(P均<0.05)。

2.2 各組細(xì)胞遷移能力比較 對(duì)照組、1.7%七氟烷組、3.4%七氟烷組、5.1%七氟烷組劃痕愈合率分別為86.27%±4.56%、59.71%±2.34%、56.10%±2.81%、23.42%±7.13%。七氟烷組劃痕愈合率低于對(duì)照組，5.1%七氟烷組劃痕愈合率低于1.7%、3.4%七氟烷組(P均<0.05)。

2.3 各組細(xì)胞E-cadherin、Vimentin、TGF-β1、MMP-2蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組相比，七氟烷組Ecadherin蛋白表達(dá)升高，Vimentin、TGF-β1、MMP-2表達(dá)降低(P<0.05)。5.1%七氟烷組E-cadherin蛋白表達(dá)較1.7%、3.4%七氟烷組升高，Vimentin、TGF-β1、MMP-2表達(dá)較1.7%、3.4%七氟烷組降低(P均<0.05)。1.7%七氟烷組與3.4%七氟烷組比較亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均<0.05)。見表1。

表1 各組細(xì)胞E-cadherin、Vimentin、TGF-β1、MMP-2蛋白表達(dá)比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與1.7%七氟烷組比較，#P<0.05；與3.4%七氟烷組比較，△P<0.05。

3 討論

對(duì)于早、中期實(shí)體腫瘤，手術(shù)切除可顯著延長患者壽命、提高患者生存質(zhì)量，但手術(shù)及創(chuàng)傷也能促進(jìn)新的腫瘤轉(zhuǎn)移灶形成和加快微小病灶的發(fā)展。對(duì)于腫瘤手術(shù)患者而言，麻醉方式及方法的不同可能會(huì)影響腫瘤生長，一定程度上也影響到患者預(yù)后。七氟烷因其誘導(dǎo)迅速、可控性高等優(yōu)點(diǎn)而廣泛用于手術(shù)麻醉。有研究證實(shí)，七氟烷除麻醉作用外，還可通過減少心肌細(xì)胞、神經(jīng)元或腎小管上皮細(xì)胞凋亡，對(duì)心、腦、肺、腎等重要器官的缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，從而降低宿主器官損傷。七氟烷影響腫瘤生長的可能機(jī)制主要包括血小板活化[12]、誘導(dǎo)凋亡小體產(chǎn)生[13]以及Ras/ERK、TGF/Smad3和PI3K/AKT等信號(hào)通路的激活[14]等。

多項(xiàng)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，七氟烷可通過多種機(jī)制促進(jìn)或抑制腫瘤增殖。本研究結(jié)果顯示，不同濃度七氟烷組細(xì)胞增殖抑制率均高于對(duì)照組，以5.1%七氟烷的抑制作用最強(qiáng)，3.4%七氟烷組次之。表明不同濃度的七氟烷均能夠抑制saos2細(xì)胞增殖，且濃度越高，作用越強(qiáng)。Ciechanowicz等[15]報(bào)道，肺癌A549細(xì)胞在3.6%七氟烷暴露2 h后，其增殖活力受到明顯抑制，同時(shí)還能增加順鉑化療敏感性，其機(jī)制與上調(diào)TGF-β1信號(hào)通路中的下游分子Smad3的核內(nèi)水平有關(guān)；但相同濃度的七氟烷在腎癌Rcc4細(xì)胞中的作用相反，可使Rcc4細(xì)胞增殖增強(qiáng)，促進(jìn)腎癌轉(zhuǎn)移的潛能。本研究結(jié)果顯示，1.7%、3.4%、5.1%的七氟烷均能降低saos2細(xì)胞TGF-β1表達(dá)，從而達(dá)到抑制其惡性潛能的作用。

腫瘤的轉(zhuǎn)移能力與腫瘤細(xì)胞的遷移能力密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，不同濃度七氟烷組劃痕愈合率均低于對(duì)照組，5.1%七氟烷組低于1.7%、3.4%七氟烷組，表明1.7%、3.4%、5.1%七氟烷均能夠抑制saos2細(xì)胞遷移，而5.1%七氟烷的抑制作用最強(qiáng)。Fan等[16]報(bào)道，1%～4%七氟烷均能夠抑制結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞和HCT116細(xì)胞的侵襲和遷移能力，其機(jī)制是通過上調(diào)miR-203而起到調(diào)節(jié)ERK/MMP-9信號(hào)通路的作用。本研究中也同樣驗(yàn)證了七氟烷對(duì)骨肉瘤saos2細(xì)胞中MMP家族中的MMP-2有抑制作用。

EMT是腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移過程及腫瘤產(chǎn)生耐藥性的關(guān)鍵步驟，腫瘤的惡性程度直接由腫瘤細(xì)胞EMT的程度所決定[17]。E-cadherin是一種細(xì)胞膜黏附蛋白，當(dāng)惡性腫瘤細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)下調(diào)時(shí)，細(xì)胞極性會(huì)消失，從而使腫瘤細(xì)胞獲得侵襲轉(zhuǎn)移的能力；當(dāng)腫瘤細(xì)胞Vimentin蛋白表達(dá)上調(diào)時(shí)，則提示其由上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細(xì)胞表型[18]。本研究結(jié)果顯示，不同濃度七氟烷處理saos2細(xì)胞后，E-cadherin蛋白上調(diào)、Vimentin蛋白下調(diào)，表明七氟烷能有效抑制saos2細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)。

綜上所述，1.7%、3.4%、5.1%的七氟烷均能夠抑制人骨肉瘤saos2細(xì)胞的增殖和遷移能力，其中以5.1%七氟烷作用最強(qiáng)；其機(jī)制可能與抑制細(xì)胞EMT以及下調(diào)MAPK信號(hào)通路活性有關(guān)。但體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)與臨床實(shí)際存在很大差距，關(guān)于七氟烷對(duì)人體骨肉瘤的影響仍需動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究進(jìn)一步闡明。