范煥芳 單保恩 黃 茂 王 玲 韓長輝 (河北省中醫(yī)院腫瘤二科，河北 石家莊 0500)

化濁潤燥降氣方對食管癌前病變模型小鼠NDRG1蛋白和基因表達(dá)的影響

范煥芳 單保恩1黃 茂2王 玲1韓長輝3(河北省中醫(yī)院腫瘤二科，河北 石家莊 050011)

目的觀察化濁潤燥降氣方對小鼠食管癌前病變組織分化相關(guān)基因NDRG1蛋白及基因表達(dá)的影響。方法將130只小鼠分為正常組、模型組、陽性對照組、中藥預(yù)防組(預(yù)防組)、中藥治療組(治療組)，采用4-硝基喹啉-氧化物(4-NQO)制備小鼠食管癌前病變模型，采用Western印跡、RT-PCR方法觀察各組食管組織中NDRG1蛋白及基因表達(dá)。結(jié)果14 w末食管癌前病變模型成功，24 w末實(shí)驗(yàn)結(jié)束。24 w末模型組小鼠NDRG1蛋白及基因表達(dá)水平與正常組相比明顯升高(P<0.05)；陽性對照組、預(yù)防組、治療組分別與模型組相比明顯降低(P<0.05)；預(yù)防組、治療組明顯高于陽性對照組(P<0.05)；預(yù)防組較治療組明顯降低(P<0.05)。結(jié)論4-NQO是制備小鼠食管癌前病變模型的有效藥物?；瘽釢櫾锝禋夥侥軠p少食管組織NDRG1蛋白及基因的表達(dá)，延緩小鼠食管癌前病變到食管癌的進(jìn)程，中藥預(yù)防用藥更具一定優(yōu)勢。

食管癌前病變；化濁潤燥降氣方；4-硝基喹啉一氧化物；NDRG1

研究表明，分化相關(guān)基因NDRG1參與細(xì)胞的生長、發(fā)育及胚胎發(fā)育，抑制腫瘤細(xì)胞的生長和侵襲轉(zhuǎn)移，是影響惡性腫瘤預(yù)后的新指標(biāo)〔1，2〕。NDRG1與食管腫瘤細(xì)胞的分化有關(guān)〔3〕。本實(shí)驗(yàn)通過建立小鼠食管鱗狀上皮癌前病變動(dòng)物模型，選取具有化濁解毒、潤燥降氣作用的免煎中藥顆?；瘽釢櫾锝禋夥阶鳛檠芯繉ο?，采用Western印跡、RT-PCR方法，觀察模型小鼠食管組織NDRG1的表達(dá)及化濁潤燥降氣方的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 選取清潔級健康SPF級C57BL/6小鼠130只，雌雄各半，4周齡，體重17～20 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2012-0001。

1.2藥物 造模藥物4-硝基喹啉一氧化物(4-NQO)(購自Sigma公司)：將1 g 4-NQO溶于50 ml蒸餾水，配成濃度為2%的稀釋液，4℃冰箱避光保存。使用時(shí)取0.5 ml 2%原液加入100 ml飲用水中，配成100 μg/ml濃度。每100 g小鼠每日用4-NQO 2 500 μg，即口服25 ml含有4-NQO的飲用水。陽性對照藥物ATRA(購自Sigma 公司)：使用時(shí)將30 mg ATRA 溶于20 ml稀釋后的甲基纖維素中，每20 g小鼠每次灌胃劑量為0.15 mg，每周3次?；瘽釢櫾锝禋夥剑褐兴幟饧孱w?；瘽釢櫾锝禋夥?藥物組成：丹參、沙參、郁金、砂仁、荷葉、茯苓、浙貝母、藿香、佩蘭、冬凌草、全蝎)。由河北省中醫(yī)院藥學(xué)部提供，每付中藥生藥含量131 g，免煎顆粒為13.7 g，小鼠用量與人用量的比例為0.002 6∶1(即成人70 kg的用量乘以系數(shù)0.002 6就是20 g小鼠的灌胃量)，每20 g小鼠服用0.2 ml含有中藥的水溶液。

1.3主要試劑 山羊抗NDRG1多克隆抗體(美國SANTA CRUZ生物公司)；蛋白濃度檢測試劑盒(南京建成生物技術(shù)公司)；蛋白印跡PVDF膜(美國Milipore公司)；蛋白質(zhì)Marker(美國PIERCE公司產(chǎn)品)；PCR引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)；RT-PCR二步法試劑盒(美國Promega公司)。

1.4動(dòng)物喂養(yǎng) 將130只小鼠于恒溫18℃～25℃、濕度保持為30%～50%環(huán)境中，用經(jīng)高壓滅菌的清潔級動(dòng)物飼料和水適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，開始實(shí)驗(yàn)。

1.5分組及模型制備 采用隨機(jī)分組的方法將130只小鼠分為正常組、模型組、陽性對照組、中藥預(yù)防組(預(yù)防組)、中藥治療組(治療組)，正常組、陽性對照組各20只，其余每組30只。各組雌雄小鼠數(shù)無明顯差異，雌雄分籠。正常組常規(guī)飼養(yǎng)，不做特殊處理。其余110只小鼠，每日飲用100 μg/ml的4-NQO水溶液，正常喂養(yǎng)飼料。預(yù)防組在開始造模同時(shí)給予化濁潤燥降氣方灌胃，每周3次，劑量為20 g小鼠服用0.2 ml濃縮中藥免煎顆粒。各組小鼠在給藥期間每周測體重一次，根據(jù)體重調(diào)整給藥劑量。14 w末癌前病變模型成功。小鼠停用4-NQO水溶液。之后模型組常規(guī)飼養(yǎng)；陽性對照組小鼠開始給予ATRA，劑量為每20 g每次灌胃劑量為0.15 mg，每周3次；預(yù)防組小鼠繼續(xù)給予化濁潤燥降氣方灌胃，劑量如前；治療組小鼠在模型制備成功時(shí)開始給予化濁潤燥降氣方灌胃，用量同預(yù)防組。24 w末模型組5只小鼠食管上皮均有癌變，遂全部處死小鼠，取食管標(biāo)本，進(jìn)行各組指標(biāo)檢測。

1.6Western印跡法檢測NDRG1蛋白表達(dá) 從食管上皮組織提取蛋白，測定總蛋白含量，配制12%SDS-PAGE分離膠，進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉。將蛋白印跡PVDF膜放入1∶200稀釋的一抗(山羊抗NDRG1、GAPDH多克隆抗體)，4℃反應(yīng)過夜。PVDF膜于TTBS振蕩沖洗3遍。加入用TTBS 1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗兔IgG，室溫孵育1 h。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，用數(shù)碼相機(jī)照相并保存結(jié)果，結(jié)果應(yīng)用Quantity one軟件進(jìn)行分析，計(jì)算目的蛋白與GAPDH的光密度比值。

1.7RT-PCR法檢測NDRG1 mRNA表達(dá) 提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用FOTODYNE凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果，顯示出清晰的28S和18S兩條rRNA帶，且28S與18S的亮度比與寬度比接近2∶1，提示RNA完整性好。NDRG1 mRNA引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，其上游引物序列為5′-GTCCCGAGAGCTACATGACG-3′；下游引物序列為5′-AGCACGAGACCCTCTACCAT-3′，擴(kuò)增基因片段長度483 bp。以GAPDH作為內(nèi)參。GAPDH上游引物序列為5′-CTCTGCTCCTCCCTGTTCCAG-3′；下游引物序列為5′-TGATGTTAGTGGGGTCTCGC-3 ′。擴(kuò)增基因片段長度為319 bp。以cDNA為模板，在1.5 ml的離心管中加入上下游引物、cDNA、 Taq 10倍緩沖液、MgCl2、dNTP、TaqDNA聚合酶，建立NDRG1和 GAPDH的PCR反應(yīng)體系，將反應(yīng)管置于PCR擴(kuò)增儀中，循環(huán)反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃3 min預(yù)變性，然后94℃變性40 s，退火55℃50 s，延長72℃90 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，使反應(yīng)更徹底。取每個(gè)標(biāo)本的擴(kuò)增產(chǎn)物6 μl于1%的含GV核酸染料的瓊脂糖凝膠電泳，以DNA Marker(DL2000)作為標(biāo)準(zhǔn)片段標(biāo)記，電泳后于紫外透射儀觀察，并用數(shù)碼相機(jī)照相，輸入微機(jī)應(yīng)用Quantity One凝膠圖像分析軟件對目的電泳條帶進(jìn)行分析，以相應(yīng)的內(nèi)參電泳條帶作為參照，各組NDRG1 mRNA表達(dá)用目的基因擴(kuò)增片段的積分吸光度與GAPDH擴(kuò)增片段的積分吸光度的比值表示。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，方差齊時(shí)用SNK-q檢驗(yàn)作兩兩比較。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠上皮組織NDRG1蛋白表達(dá) 正常組NDRG1表達(dá)水平為0.400±0.055，模型組為0.845±0.088，模型組較正常組明顯升高(P<0.05)；陽性對照組、預(yù)防組、治療組NDRG1蛋白表達(dá)水平分別為0.493±0.021；0.549±0.033；0.649±0.023，三組均較模型組明顯降低(P<0.05)；預(yù)防組、治療組明顯高于陽性對照組(P<0.05)，預(yù)防組較治療組明顯降低(P<0.05)。見圖1。

2.2各組小鼠上皮組織 NDRG1 mRNA表達(dá)變化 正常組小鼠食管上皮組織中NDRG1 mRNA表達(dá)為0.313±0.017，明顯低于模型組(0.720±0.019，P<0.05)；陽性對照組、預(yù)防組、治療組NDRG1 mRNA分別為0.372±0.025；0.440±0.019；0.474±0.031，均較模型組明顯降低(P<0.05)；預(yù)防組、治療組明顯高于陽性對照組(P<0.05)，預(yù)防組較治療組明顯降低(P<0.05)。見圖2。

A～E：正常組、模型組、陽性對照組、預(yù)防組、治療組，下圖同圖1 各組小鼠上皮組織NDRG1蛋白表達(dá)

圖2 各組小鼠上皮組織NDRG1 mRNA表達(dá)

3 討 論

研究表明，NDRG1主要存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，極少量存在于細(xì)胞核〔4〕，主要表達(dá)于前列腺、卵巢、結(jié)腸及腎臟中，與宮頸癌的發(fā)生也密切相關(guān)〔5，6〕。 賀付成等〔3〕對NDRG1 mRNA和蛋白在食管癌組織中的表達(dá)進(jìn)行研究，結(jié)果表明，在正常食管黏膜組織中NDRG1蛋白呈強(qiáng)陽性表達(dá)，而在癌旁不典型增生及食管鱗癌組織中NDRG1蛋白呈弱陽性或不表達(dá)。張蕾等〔7〕采用不同濃度的誘導(dǎo)分化劑佛波酯、維甲酸、丁酸鈉和維生素D3分別作用于食管癌EC9706 細(xì)胞，進(jìn)行體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，觀察誘導(dǎo)分化劑對食管癌細(xì)胞NDRG1 mRNA及蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果表明以上誘導(dǎo)分化劑可明顯上調(diào)食管癌細(xì)胞NDRG1 mRNA及蛋白的表達(dá)水平。紀(jì)曉花等〔8〕研究表明，連花參加方可以抑制食管癌前病變小鼠β-catenin蛋白的聚積，推測這可能是抑制小鼠食管癌變發(fā)生與發(fā)展的機(jī)制之一。食管癌前病變屬噎膈范疇，為噎膈早期病證〔9〕。啟膈散，出自清代醫(yī)家程鐘齡(國彭)所著之《醫(yī)學(xué)心悟》一書，是為治療“噎膈”所設(shè)?；瘽釢櫾锝禋夥绞窃诿絾㈦跎⒌幕A(chǔ)上加化濁通絡(luò)解毒之品藿香、 佩蘭、冬凌草、天龍、全蝎而成。藿香、佩蘭與砂仁合用，芳香化濁，消濕濁；冬凌草甘涼，入肺、胃經(jīng)，具有清熱解毒之效；天龍、全蝎攻毒散結(jié)，通絡(luò)止痛，與啟膈散合用，全方共奏化濁解毒、化痰解郁、通絡(luò)散結(jié)之效。本研究表明，食管癌前病變小鼠食管組織中存在NDRG1的高表達(dá)，隨著食管癌前病變向食管癌發(fā)展，NDRG1的表達(dá)升高，化濁潤燥降氣方能減少食管癌前病變小鼠食管組織NDRG1蛋白和基因表達(dá)，預(yù)防用藥在抑制NDRG1蛋白和基因表達(dá)方面具有一定優(yōu)勢。

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R735.1

A

1005-9202(2017)24-6027-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.010

河北省高層次人才資助項(xiàng)目(No.B2012003007)

1 河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心

2 河北省中醫(yī)院兒科 3 河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院

單保恩(1962-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事惡性腫瘤基礎(chǔ)及臨床研究。

范煥芳(1970-)，女，主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事惡性腫瘤臨床及基礎(chǔ)研究。

〔2016-12-16修回〕

(編輯 曹夢園)