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(1.皖南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科，安徽 蕪湖 241000；2.皖南醫(yī)學(xué)院 病理生理學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

·臨床醫(yī)學(xué)·

沙利度胺抑制卵巢癌細(xì)胞SKOV-3體外生長(zhǎng)的研究

張玲1，高紅亮2，吳超2，程倩2，虞樂(lè)2，李曙2

(1.皖南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科，安徽 蕪湖 241000；2.皖南醫(yī)學(xué)院 病理生理學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

目的：探討沙利度胺對(duì)卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3的增殖抑制以及凋亡的影響，為后續(xù)臨床治療及基礎(chǔ)研究提供依據(jù)。方法采用MTT法測(cè)定不同濃度沙利度胺作用于SKOV-3細(xì)胞株24 h后的吸光度，測(cè)定其對(duì)SKOV-3的增殖抑制率，Tunel染色法鑒定細(xì)胞凋亡，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Q-PCR法檢測(cè)caspase3 mRNA表達(dá)水平，Western Blot法檢測(cè)caspase3蛋白表達(dá)水平。結(jié)果沙利度胺的濃度從31 μg/mL增加至500 μg/mL時(shí)，對(duì)于SKOV-3的增殖抑制率從6.22%上升至86%；300 μg/mL沙利度胺處理SKOV-3 24 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其凋亡率上升為52.66%，明顯高于空白對(duì)照(P<0.01)。Tunel法在熒光顯微鏡下觀察，沙利度胺組可見(jiàn)大片綠色熒光。同時(shí)，沙利度胺處理后的SKOV-3的caspase3 mRNA及蛋白表達(dá)量與空白對(duì)照組相比也明顯上升(P<0.01)。結(jié)論沙利度胺能夠抑制卵巢癌細(xì)胞SKOV-3的增殖并且能夠誘導(dǎo)其凋亡。

沙利度胺；卵巢癌細(xì)胞；凋亡

卵巢癌作為一種惡性的生殖腫瘤，已經(jīng)成為發(fā)達(dá)國(guó)家婦女腫瘤致死率第五的疾病。在過(guò)去的40年，對(duì)于卵巢癌的治愈率并沒(méi)有顯著的改善[1]。目前的治療手段主要以手術(shù)及化療為主[2-3]。沙利度胺是一種消旋體谷氨酸衍生物，具有鎮(zhèn)靜、止吐作用，起初用于治療妊娠嘔吐，因嚴(yán)重致畸事件在1961年被禁用[4-5]。目前，歐洲藥品管理局(European Medicines Agency，EMA)批準(zhǔn)其適應(yīng)證僅限于治療多發(fā)性骨髓瘤，中國(guó)SFDA所批準(zhǔn)的適應(yīng)證僅限于控制瘤型麻風(fēng)反應(yīng)癥。但臨床實(shí)踐中沙利度胺的應(yīng)用范圍已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了FDA、EMA、SFDA所批準(zhǔn)的適應(yīng)證，在如腎癌、惡性黑素瘤、膠質(zhì)瘤、淋巴瘤、結(jié)直腸癌、肝癌、前列腺癌等實(shí)體瘤中的治療中有一定效果[6-7]。同時(shí)，近年的研究發(fā)現(xiàn)，沙利度胺具有調(diào)節(jié)免疫及抗血管生成等作用[8]。這使得沙利度胺再次成為研究的熱點(diǎn)。本研究希望通過(guò)分子生物學(xué)手段來(lái)觀察沙利度胺對(duì)于卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3增殖凋亡的影響。

1 材料和方法

1．1 材料 人卵巢癌細(xì)胞SKOV-3購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)。沙利度胺購(gòu)于常州制藥廠，為純品原料藥，溶于二甲基亞砜(DMSO)后得終濃度為50mg/mL的溶液。四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑盒，TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于碧云天生物有限公司。凋亡試劑盒購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。caspase3一抗購(gòu)于CST公司，二抗購(gòu)于碧云天生物有限公司。caspase3引物購(gòu)于上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SKOV-3細(xì)胞株于含有10%小牛血清的RPMI-1640的培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)，同時(shí)加入雙抗(1%青霉素和鏈霉素)，置于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 增殖抑制率檢測(cè) 采用MTT 法檢測(cè)不同濃度沙利度胺處理SKOV-3 24 h后的增殖抑制率。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV-3細(xì)胞消化，種于96孔板中，保持細(xì)胞濃度5×103/孔，培養(yǎng)24 h后，換液，加入沙利度胺終濃度分別為500 μg/mL、250 μg/mL、125 μg/mL、62 μg/mL、31 μg/mL的無(wú)血清培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)副孔，培養(yǎng)24 h，加入MTT( 5g /L) 各20 μL，4 h 后，吸出培養(yǎng)液，再在每孔加入DMSO150 μL，避光輕微振蕩5min使結(jié)晶充分溶解，在酶標(biāo)儀570 nm 波長(zhǎng)下測(cè)吸光度(C)值。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(對(duì)照組C值-實(shí)驗(yàn)組C值)/對(duì)照組C值×100%。并計(jì)算出沙利度胺的IC50。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡率 運(yùn)用Annexin V- FITC /PI 雙染檢測(cè)沙利度胺作用于SKOV-3 24 h的凋亡率，沙利度胺作用SKOV-3，24 h后，PBS洗兩遍，收集上清液離心，然后用0.25%不含EDTA的胰酶消化，制備單細(xì)胞懸液濃度1×106個(gè)細(xì)胞 /mL，離心2000 r/min，5min，PBS洗滌兩次，收集細(xì)胞，用200 μL緩沖液重懸，分別加入5 μL FITC和10 μL PI，4℃避光孵育15min。用PBS將懸液補(bǔ)充至700 μL，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.4 Tunel檢測(cè)細(xì)胞凋亡 采用一步法Tunel細(xì)胞凋亡試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡，取用處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的SKOV-3細(xì)胞，消化，種于6孔板中，貼壁培養(yǎng)24 h后，加入沙利度胺作用24 h后，按照試劑盒使用說(shuō)明完成檢測(cè)。

1.2.5 Q-pcr檢測(cè)caspase3表達(dá)水平 用300 μg/mL沙利度胺作用處理SKOV-3 24 h，后用Trizol提取藥物組與正常對(duì)照組細(xì)胞RNA。將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，條件為：25℃ 10 min, 50℃ 30 min, 85℃5 min。以cDNA作為模板完成實(shí)時(shí)熒光定量PCR?；虻囊锊捎肞rimer5.0軟件設(shè)計(jì)。caspase3的上游引物：5′-GCAAACCTCAGGGAAACATT-3′;下游引物：5′-ACCTGGACAACTGGACTTTT-3′。β-actin：的上游引物：5′-GATTACTGCTCTGGCTCCTAGC-3′;下游引物：5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGC-3′。

1.2.6 Western blot檢測(cè)caspase3蛋白表達(dá)水平 沙利度胺處理SKOV-3 24 h后，用含有蛋白酶抑制劑的RIPA 1640強(qiáng)裂解液來(lái)提取細(xì)胞總蛋白。采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，并將蛋白于-80℃冰箱保存。運(yùn)用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離所提蛋白，并將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%BSA封閉2 h后，孵以一抗，4℃搖床過(guò)夜。次日，TBST清洗3次，每次5 min。二抗孵育2 h。用冷CCD成像系統(tǒng)觀察蛋白表達(dá)。結(jié)果運(yùn)用Image J軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 沙利度胺處理后增殖抑制率的比較 通過(guò)計(jì)算得出沙利度胺的IC50約為300 μg/mL 。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：通過(guò)與空白組比較，沙利度胺處理后的SKOV-3的增殖能力減弱，并呈濃度依賴(lài)關(guān)系，其中200 μg/mL與500 μg/mL沙利度胺處理組與空白對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。說(shuō)明沙利度胺能夠有效抑制SKOV-3的增殖，見(jiàn)表1。

表1 沙利度胺不同濃度組細(xì)胞增殖抑制率的比較

組別OD值(x±s)抑制率/%沙利度胺組 500μg/mL0.1880±0.05544*86 250μg/mL0.7882±0.11743*42.5 125μg/mL1.1616±0.14238*15.2 62μg/mL1.2696±0.118747.42 31μg/mL1.2860±1.178316.22空白對(duì)照組1.3714±0.081330.00F68.406P<0.001

*為與空白對(duì)照組比較，P<0.05。

2.2 沙利度胺處理后對(duì)SKOV-3細(xì)胞凋亡的影響 采用一步法Tunel凋亡染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)沙利度胺處理后的SKOV-3的凋亡率。在熒光顯微鏡下觀察，沙利度胺處理組在鏡下可見(jiàn)大量綠色熒光，說(shuō)明凋亡率增加(圖1A)。結(jié)果顯現(xiàn)沙利度胺處理24 h后的凋亡率可達(dá)到52.66%，高于空白對(duì)照組(圖1B)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

A.空白對(duì)照與沙利度胺處理組Tunel法凋亡檢測(cè)的比較;B、C.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)空白對(duì)照與沙利度胺處理組的凋亡率。*P<0.01vscontrol。

圖1 沙利度胺處理后對(duì)SKOV-3細(xì)胞凋亡的影響

2.3 沙利度胺處理后caspase3表達(dá)水平的比較 采用Q-PCR法分析沙利度胺處理組與空白對(duì)照組之間caspase3 mRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)沙利度胺處理組的SKOV-3細(xì)胞的caspase3的表達(dá)水平要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常細(xì)胞(圖2A)。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。沙利度胺處理組與空白對(duì)照組的caspase3表達(dá)量，通過(guò)Western Blot結(jié)果顯示，沙利度胺處理組的caspase3的表達(dá)量明顯高于空白對(duì)照組(圖2B、C)。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。說(shuō)明沙利度胺能夠促進(jìn)SKOV-3的凋亡。

A.沙利度胺處理組與空白對(duì)照組caspase3 mRNA表達(dá)水平的比較;B、C.沙利度胺處理組與空白對(duì)照組caspase3蛋白表達(dá)水平的比較。

*P<0.01vscontrol。

圖2 沙利度胺處理后caspase3表達(dá)水平的比較

3 討論

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率位居所有生殖器官惡性腫瘤的第三位。早期卵巢癌無(wú)明顯典型癥狀，發(fā)現(xiàn)時(shí)，基本已屬晚期，對(duì)婦女的生命健康造成了巨大的威脅[9-10]。沙利度胺最初作為鎮(zhèn)靜劑治療妊娠嘔吐，因有致畸作用(嬰兒海豹肢)而被禁用。腫瘤患者多有免疫機(jī)能的異常, 正常情況下腫瘤與宿主的免疫防御之間處于動(dòng)態(tài)平衡。這種平衡遭到破壞，可使腫瘤處于優(yōu)勢(shì)地位而得以發(fā)生增殖、擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移。研究顯示，沙利度胺對(duì)淋巴細(xì)胞有調(diào)節(jié)作用，能誘導(dǎo)細(xì)胞毒T 細(xì)胞的增殖，降低CD4+和CD8+細(xì)胞的比例，從而增加IFN-γ和IL-2 的分泌，IFN-γ和IL-2 本身具有直接抗腫瘤的作用。此外，通過(guò)增強(qiáng)NK 細(xì)胞活性還可以達(dá)到間接抗腫瘤的效果。另一方面，臨床前和臨床的證據(jù)顯示，沙利度胺能夠誘導(dǎo)T 淋巴細(xì)胞分泌IL-2 和IFN-γ，它們又會(huì)反饋刺激T 細(xì)胞增殖，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫作用[11-13]。故我們希望通過(guò)了解沙利度胺在處理卵巢癌細(xì)胞SKOV-3后對(duì)其的增殖與凋亡的影響，從而為沙利度胺更好地用于臨床抗腫瘤應(yīng)用以及基礎(chǔ)研究提供依據(jù)。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，沙利度胺處理SKOV-3 24 h后,細(xì)胞的增殖抑制率隨沙利度胺濃度的上升而上升，在沙利度胺的濃度達(dá)到250 μg/mL時(shí)，增殖抑制率即可達(dá)到42%，說(shuō)明沙利度胺對(duì)SKOV-3細(xì)胞的增殖具有一定的抑制作用。另外通過(guò)流式檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)沙利度胺處理后的SKOV-3的凋亡率與空白對(duì)照組比較明顯上升。表明沙利度胺能夠有效地誘導(dǎo)SKOV-3的凋亡。經(jīng)典的凋亡途徑分為兩條，分別為胞外途徑以及胞內(nèi)途徑，死亡受體與配體的結(jié)合最終導(dǎo)致死亡信號(hào)的傳遞，死亡受體的死亡結(jié)構(gòu)域(death domain,DD)與信號(hào)傳導(dǎo)分子結(jié)合，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物，最終導(dǎo)致了caspase3及下游的caspase的活化。同時(shí)有大量研究表明，在多種細(xì)胞及各種因素的刺激下，caspase3是凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者。故我們通過(guò)Western Blot及Q-PCR檢測(cè)caspase3在沙利度胺處理組中的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)沙利度胺處理后的SKOV-3，caspase3的表達(dá)量明顯升高，說(shuō)明通過(guò)沙利度胺的處理，能有效地激活caspase3，引起SKOV-3的凋亡。但是其中具體的分子機(jī)制尚不清楚，有待于后續(xù)研究證實(shí)。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，希望能夠?yàn)橐院笊忱劝犯玫貞?yīng)用于臨床提供研究基礎(chǔ)。

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InvitroinhibitingtheproliferationofhumanovarycancercelllineSKOV-3usingthalidomide

ZHANGLing,GAOHongliang,WUChao,CHENGQian,YULe,LIShu

Department of Gynecology & Obstetrics, The Second Affiliated Hospital of Wannan Medical College, Wuhu 241000, China

Objective：To investigate the effects of thalidomide on inhibiting proliferation and promoting apoptosis of human ovarian cancer cell line SKOV-3 for evidence in clinical use and fundamental research of this drug.Methods: MTT assay was performed to detect the absorbance value of different concentration of thalidomide acting on SKOV-3 24 h after administration for measurement of the inhibition rate. TTUNEL apoptosis detecting kit and flow cytometry were used to detect the cell apoptosis, and Q-PCR to detect the level of caspase-3 mRNA expression. Caspase-3 protein level was determined using Western blot.Results: MTT results showed that the inhibition rate rose up to 86% from 6.22% with thalidomide concentration of 500 μg/mL from 31 μg/mL. Apoptosis rate of SKOV-3 was up to 52.66% after thalidomide treatment by final concentration of 300 μg/mL, which was significantly higher compared to the control group(P<0.05). Large areas of the green fluorescence were observed under fluorescent microscope, and the mRNA and protein levels of caspase-3 in SKOV-3 after thalidomide administration were significantly increased as compared with the blank control group(P<0.01).Conclusion: Thalidomide is able to inhibit the proliferation and promote apoptosis of ovarian cancer cell line SKOV-3.

thalidomide; ovarian cancer; cell apoptosis

1002-0217(2017)05-0433-04

安徽省高校優(yōu)秀青年人才支持計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(gxyqZD2016172)；大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃(201510368038； 201610368116 )

2017-06-02

張 玲(1978-)，女，主治醫(yī)師，(電話)13855308893，(電子信箱)71926023@qq.com；李 曙，男，副教授，(電子信箱) yxx2003@126.com，通信作者。

R 737.31

A

10.3969/j.issn.1002-0217.2017.05.007