徐道知，歐陽玲

（1. 中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽 110004； 2. 沈陽醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院普外科，沈陽 110035）

地西他濱抑制A431細(xì)胞生物學(xué)功能的機制

徐道知1，2，歐陽玲1

（1. 中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽 110004； 2. 沈陽醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院普外科，沈陽 110035）

目的檢測地西他濱對A431細(xì)胞生物學(xué)功能的影響并初步探討其機制。方法將0、5、10和20 μ mol/L的地西他濱分別作用于A431細(xì)胞，通過MTT法觀察地西他濱對細(xì)胞增殖的影響，通過Western blotting和實時PCR檢測地西他濱作用于A431細(xì)胞后細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Cyclin B1、PCNA和CDC2的改變。通過Hoechst 33258染色檢測0、5和10 μ mol/L地西他濱對A431細(xì)胞凋亡狀態(tài)的影響，采用Western blotting和實時PCR檢測地西他濱對A431細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2的影響。采用transwell實驗檢測細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移情況，并通過Western blotting和實時PCR檢測0、5和10 μ mol/L的地西他濱對侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP2的影響。結(jié)果MTT檢測發(fā)現(xiàn)，5、10和20 μ mol/L的地西他濱作用于A431細(xì)胞24 h后對細(xì)胞增殖的抑制率分別為 （43.81±1.53） %、（48.64±4.65） %和 （50.69±4.99） %，隨著藥物的濃度增加，對A431細(xì)胞的增殖抑制率顯著增加 （P ＜ 0.05） 。Hoechst 33258染色發(fā)現(xiàn)，地西他濱可以顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡，transwell實驗也證明地西他濱可以明顯抑制A431細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。Western blotting和實時PCR結(jié)果顯示，地西他濱影響A431細(xì)胞中Cyclin B1、CDC2、PCNA、Bax、Bcl-2和MMP2蛋白及mRNA水平，地西他濱處理組與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 （P ＜ 0.05） 。結(jié)論地西他濱對外陰鱗狀細(xì)胞癌的生物學(xué)功能有很強的抑制作用，可以作為治療外陰鱗狀細(xì)胞癌的化療藥物。

地西他濱； A431； 增殖； 凋亡； 轉(zhuǎn)移

外陰鱗狀細(xì)胞癌的預(yù)后相對不良，目前的治療方式一般以手術(shù)為主，并且配合放化療的使用［1-2］，但是由于放化療藥物的不良反應(yīng)明顯以及根治性手術(shù)經(jīng)常導(dǎo)致嚴(yán)重術(shù)后并發(fā)癥、局部畸形及功能障礙，顯著降低了患者的生存質(zhì)量。因此，有必要尋找一種更好的化療藥物或者化療輔助藥物。地西他濱是一種2’-脫氧胞苷類似物，具有極強的抗腫瘤活性，而且不同劑量作用機制不盡相同，高濃度地西他濱具有較強的細(xì)胞毒性作用，低濃度時具有去甲基化作用［3］。地西他濱通常作用于細(xì)胞的G2/M期，將細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖［4］。地西他濱的去甲基化作用可以在體內(nèi)、體外通過抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶使抑癌基因恢復(fù)正常的去甲基狀態(tài)，重新激活那些由于DNA過度甲基化而失活的基因，使細(xì)胞恢復(fù)正常終末分化、衰老或凋亡［5-7］。目前地西他濱主要用于白血病的治療，對腸癌和乳腺癌等實體瘤也有一定的抗腫瘤效果［8］。很多研究證實，地西他濱可以抑制肺癌、膀胱癌和胃癌等多種腫瘤細(xì)胞的生長與侵襲，但是關(guān)于地西他濱對外陰鱗狀細(xì)胞癌的作用研究較少［9］。

本研究以人外陰鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系A(chǔ)431為研究對象，探討地西他濱對A431細(xì)胞生長與轉(zhuǎn)移功能的抑制作用，進(jìn)一步初步探索其抑制機制，為臨床上尋找更好的外陰鱗狀細(xì)胞癌治療方案提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人外陰鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系A(chǔ)431 （實驗室凍存） ，DMEM培養(yǎng)基 （美國Hyclone） ，胎牛血清 （天津灝洋），地西他濱 （江蘇豪森） ，四甲基偶氮唑藍(lán)、DMSO （美國Sigma） ，臺盼藍(lán) （上海碧云天） 。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組：將A431細(xì)胞接種于含體積分?jǐn)?shù)10%滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 MTT實驗：將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞消化傳代，以1×104/mL濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，終體積200 μ L。將細(xì)胞分為對照組（ 0 μ mol/L地西他濱）、5 μ mol/L地西他濱組、10 μ mol/L地西他濱組和20 μ mol/L地西他濱組。處理后的細(xì)胞于0、12、24、36、48 h和60 h（ 每個濃度每個時間點分別設(shè)3個副孔） 分別加入5 mg/mL MTT溶液10 μ L，置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，棄上清，每孔中加入200 μ L DMSO，震蕩10 min后在490 nm處記錄吸光（ optical density，OD） 值。藥物對細(xì)胞抑制率計算方法：細(xì)胞生長抑制率（ %） =（ 對照組OD值-藥物組OD值） /對照組OD值×100。

1.2.3 Hoechst 33258染色：將對數(shù)生長期的細(xì)胞制成1×106/L濃度的細(xì)胞懸液接種于6孔板中，貼壁培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞分為對照組（ 0 μ mol/L地西他濱） 、5 μ mol/L地西他濱組和10 μ mol/L地西他濱組。藥物作用24 h后，每孔加入100 μ L Hoechst 33258孵育染色15 min，PBS洗凈后，用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.2.4 transwell實驗：取對數(shù)生長期細(xì)胞以1×105/mL濃度接種于上室中，終體積200 μ L，下室加入600 μ L雙無培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)12 h后更換培養(yǎng)基，將細(xì)胞分為對照組（ 0 μ mol/L地西他濱） 、5 μ mol/L地西他濱組和10 μ mol/L地西他濱組，各組均設(shè)3個副孔。24 h后取出小室，棉簽擦去上層細(xì)胞，PBS清洗后95%乙醇固定20 min，4%臺盼藍(lán)染色20 min，200倍顯微鏡下觀察。藥物對細(xì)胞的抑制率計算公式：抑制率（%） =1-（ 劑量組平均細(xì)胞數(shù)/對照組平均細(xì)胞數(shù)） ×100。

1.2.5 Western blotting：實驗所用細(xì)胞分為對照組（ 0 μ mol/L地西他濱） 、5 μ mol/L地西他濱組和10 μ mol/L地西他濱組，藥物作用24 h后，使用RIPA裂解液搜集并裂解細(xì)胞，提取蛋白，通過G250定量后。取30 μ g蛋白進(jìn)行電泳（ 80～120 V） 、轉(zhuǎn)膜（ 100 V，1 h） 后，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。一抗4 ℃過夜后TBST清洗3次。二抗室溫1 h后TBST清洗3次。Cyclin B1、CDC2、PCNA、Bax、Bcl-2、MMP2和GAPDH抗體及二抗均購置美國Santa公司。

1.2.6 實時PCR：實驗用細(xì)胞分為對照組（ 0 μ mol/L地西他濱）、5 μ mol/L地西他濱組和10 μ mol/L地西他濱組，藥物作用24 h后，Trizol法提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行實時PCR反應(yīng)。所用引物：Cyclin B1，正 向5’-CATTATTGATCGGTTCATGC-3’， 反 向5’-CTAGTGCAGAATTCAGCTGTGGTA-3’；CDC2，正 向5’-GAAGATTATACCAAAATAGAGA-3’，反 向5’-CTACATCTTCTTAATCTCTGATTGTCC-3’；Bcl-2，正向5’-GGTGAACTGGGGGAGGATTG-3’，反向5’-G GCAGGCATGTTGACTTCAC-3’； Bax，正向5’-AGCT GAGCGAGTGTCTCAAG-3’，反向5’-GTCCAATGTCC AGCCCATGA-3’；MMP2，正向5’-CGCATCTGGGGCT TTAAACAT-3’；反向5’-TCAGCACAAACAGGTTGCA G-3’；PCNA，正向5’-TTTGAGGCACGCCTGATC-3’；反向5’-GATCAGGCGTGCCTCAAA-3’；GAPDH，正向5’-GGCAAATTCAACGGCACAGT-3’；反向5’-TAGG GCCTCTCTTGCTCAGT-3’。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較采用非配對 t 檢驗分析，P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 地西他濱對A431細(xì)胞增殖的影響

不同濃度的地西他濱作用于A431細(xì)胞0 、12、24、36、48和60 h后，顯著抑制A431細(xì)胞的增殖，與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異 （P ＜ 0.05） ，且地西他濱對細(xì)胞增殖的抑制作用隨著濃度的增加而增加。見表1。

2.2 不同濃度地西他濱對A431細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白的影響

不同濃度地西他濱對Cyclin B1、PCNA和CDC2蛋白及mRNA水平均有一定程度的抑制作用，隨著藥物濃度的升高抑制作用增強。5 μ mol/L和10 μ mol/L地西他濱作用后，Cyclin B1、CDC2、PCNA蛋白和mRNA水平均顯著下調(diào)，與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P ＜ 0.05），10 μ mol/L地西他濱組與5 μ mol/L地西他濱組比較，Cyclin B1、CDC2和PCNA蛋白和mRNA水平的差異也有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05）。見圖1。

表1 不同劑量的地西他濱對A431細(xì)胞增殖的抑制率 （%）Tab.1 Inhibition of the proliferation of A431 cells treated with different decitabine concentrations（%）

2.3 不同濃度地西他濱對A431細(xì)胞凋亡的影響

圖1 不同濃度地西他濱作用下A431細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白的變化Fig.1 Proteins related to the proliferation of A431 cells treated with different decitabine concentrations

Hoechst 33258染色 （圖2） 結(jié)果顯示，地西他濱可以促進(jìn)A431細(xì)胞的凋亡，隨著藥物濃度的增加，凋亡細(xì)胞明顯增加。不同濃度地西他濱對Bax和Bcl-2蛋白和mRNA水平均有一定程度的影響，隨著藥物濃度的升高作用增強。5 μ mol/L和10 μ mol/L地西他濱作用后Bax蛋白和mRNA水平均顯著上調(diào)，Bcl-2蛋白和mRNA水平均顯著下調(diào)，與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P ＜ 0.05），10 μ mol/L地西他濱組與5 μ mol/L地西他濱組比較，Bax和Bcl-2蛋白和mRNA水平的差異也有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05）。見圖3。

2.4 不同濃度地西他濱對A431細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響

圖2 不同劑量地西他濱作用下A431細(xì)胞的凋亡情況Fig.2 Apoptosis of A431 cells treated with different decitabine concentrations

圖3 不同濃度地西他濱作用下A431細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的變化Fig.3 Proteins related to the apoptosis of A431 cells treated with different decitabine concentrations

臺盼藍(lán)染色 （圖4） 結(jié)果顯示，地西他濱可以抑制A431細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。對照組、5 μ mol/L地西他濱組、10 μ mol/L地西他濱組的轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)分別為153.76±4.63、121.24±14.92、79.37±24.35，隨著藥物濃度的增加，轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)目減少，5 μ mol/L地西他濱組、10 μ mol/L地西他濱組與對照組比較，10 μ mol/L地西他濱組與5 μ mol/L地西他濱組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 （P ＜ 0.05） 。

圖4 不同濃度的地西他濱作用下A431細(xì)胞的轉(zhuǎn)移情況Fig.4 Migration of A431 cells treated with different decitabine concentrations

不同濃度地西他濱對MMP2有一定程度的抑制作用，隨著藥物濃度的升高抑制作用增強，5 μ mol/L地西他濱組、10 μ mol/L地西他濱組與對照組比較，10 μ mol/L地西他濱組與5 μ mol/L地西他濱組比較，MMP2蛋白和mRNA水平的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05） 。見圖5。

3 討論

圖5 不同濃度地西他濱作用下A431細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白的變化Fig.5 Proteins related to the migration of A431 cells treated with different decitabine concentrations

地西他濱作為一種治療原發(fā)性和繼發(fā)性骨髓增生異常的化療藥物，目前被很多研究人員用于實體腫瘤實驗中［10］，地西他濱目前對實體腫瘤的治療仍處于臨床試驗階段。地西他濱可以通過活化腫瘤細(xì)胞中異常甲基化的細(xì)胞周期相關(guān)基因來激活腫瘤內(nèi)抑癌基因的表達(dá)［11］，地西他濱還可以恢復(fù)腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性［12］。研究［13］表明，地西他濱單獨應(yīng)用時對腫瘤的增殖抑制作用可能并不明顯，但是可以顯著增加腫瘤細(xì)胞對順鉑、卡鉑、表柔比星等多種抗腫瘤藥物的敏感性。地西他濱在體外可以明顯逆轉(zhuǎn)胃癌順鉑耐藥細(xì)胞株，抑制其抑癌基因的甲基化狀態(tài)來恢復(fù)抑癌基因的表達(dá)。也有報道指出，地西他濱可以通過調(diào)節(jié)p21等蛋白的表達(dá)，明顯將細(xì)胞周期抑制在G2/M期。地西他濱也可以顯著增加細(xì)胞的凋亡來抑制腫瘤細(xì)胞的生長。

本研究通過將不同濃度的地西他濱作用于A431細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)地西他濱可以明顯抑制A431細(xì)胞的增殖。進(jìn)一步實驗發(fā)現(xiàn)地西他濱可以顯著下調(diào)A431細(xì)胞中Cyclin B1與CDC2蛋白的表達(dá)。高等真核生物通過長期進(jìn)化過程逐漸形成了多層次的細(xì)胞周期調(diào)控通路，這些調(diào)控通路都集中在細(xì)胞周期依賴蛋白激酶的調(diào)節(jié)上。其中Cyclin B1的合成、降解以及亞細(xì)胞定位均對有絲分裂的調(diào)控起著重要作用，Cyclin B1參與細(xì)胞周期監(jiān)測點的調(diào)控，也維持基因組的穩(wěn)定性［14］。很多報道指出，Cyclin B1的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移以及預(yù)后密切相關(guān)。在調(diào)節(jié)G2/M期進(jìn)程時，Cyclin B1通過與CDC2蛋白結(jié)合共同發(fā)揮作用，PCNA本身與細(xì)胞的甲基化水平密切相關(guān)，也與細(xì)胞增殖關(guān)系密切［15-16］。有研究指出，地西他濱可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的G2/M期。本研究也發(fā)現(xiàn)地西他濱可以抑制A431細(xì)胞的增殖，進(jìn)一步檢測地西他濱對Cyclin B1、CDC2蛋白的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)地西他濱可以通過抑制Cyclin B1、PCNA與CDC2蛋白的表達(dá)來抑制A431細(xì)胞的增殖。

本研究發(fā)現(xiàn)地西他濱可以促進(jìn)A431細(xì)胞的凋亡，通過檢測凋亡相關(guān)的經(jīng)典蛋白Bax與Bcl-2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)地西他濱可以通過調(diào)節(jié)其活性來促進(jìn)A431細(xì)胞的凋亡，進(jìn)一步加強了地西他濱抑制A431細(xì)胞生長的水平。

臨床觀察表明，腫瘤患者大多死于腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，因此腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移是眾多研究人員的關(guān)注熱點。目前的研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶家族可以有效地降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，破壞基底膜，為腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移提供了便利。MMP2是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中的重要成員［17-18］。本研究通過transwell實驗檢測發(fā)現(xiàn)，地西他濱對A431細(xì)胞的轉(zhuǎn)移功能有一定的抑制作用，進(jìn)而檢測了地西他濱對MMP2蛋白的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)地西他濱可以顯著抑制MMP2的表達(dá)。

綜上所述，地西他濱可以通過抑制A431細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡來抑制A431細(xì)胞的生長，地西他濱也可以抑制A431細(xì)胞的轉(zhuǎn)移功能。由此可見，地西他濱可以成為治療外陰鱗狀細(xì)胞癌的潛在藥物。

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Mechanism of the Inhibition of Decitabine in A431 Cells

XU Daozhi1，2，OUYANG Ling1
（1. Department of Obstetrics and Gynecology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China； 2. Department of General Surgery，The Second Hospital of Shenyang Medical College，Shenyang 110035，China）

ObjectiveTo investigate the effect of decitabine on the biological function of A431 cells and examine its mechanism.MethodsDifferent concentrations （5，10，and 20 μ mol/L） of decitabine were used to treat A431 cells. The effect of decitabine on cell proliferation was observed on MTT . Hoechst 33258 staining was used to detect A431 cell apoptosis after the administration of decitabine. The metastasis of A431 cells was detected via transwell assay. The expressions of the proteins related to cell proliferation，apoptosis，invasion，and metastasis were detected using Western blotting and real-time polymerase chain reaction （PCR） .ResultsThe MTT assay revealed that after treatment with 5，10，and 20 μ mol/L decitabine，the inhibition rates of cell proliferation were 43.81% ± 1.53%，48.64% ± 4.65%，and 50.69% ± 4.99%. With the increase in drug concentration，the rate of inhibition of A431 cell proliferation increased significantly （P＜ 0.05） . Hoechst 33258 staining showed that this treatment could promote apoptosis significantly. The transwell experiments showed that decitabine significantly inhibited the metastasis of A431 cells. Western blotting and real-time PCR showed that the expressions of Cyclin B1，CDC2，Bax，Bcl-2 and MMP2 protein and mRNA in A431 cells were significantly affected by decitabine （P ＜ 0.05） .ConclusionDecitabine has a strong inhibitory effect on the biological function of vulvar squamous cell carcinoma and can be used as a chemotherapeutic agent for vulvar squamous cell carcinoma.

decitabine； A431； proliferation； apoptosis； metastasis

R737.35

A

0258-4646 （2017） 12-1105-06

http://kns.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20171130.1810.020.html

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.12.011

沈陽市科學(xué)技術(shù)計劃 （F15-199-1-34）

徐道知 （1987-） ，男，醫(yī)師，碩士研究生.

歐陽玲，E-mail：ouyang1964@163.com

2016-07-13

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2017-11-30 18:10

（編輯 陳 姜）