李新鳴，孫冶 ，肖純凌

（1. 沈陽醫(yī)學院基礎醫(yī)學院病原生物學教研室，沈陽 110034； 2. 遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)重點實驗室，沈陽 110034）

表達人源SOD的畢赤酵母重組子的構建

李新鳴1，2，孫冶1，2，肖純凌2

（1. 沈陽醫(yī)學院基礎醫(yī)學院病原生物學教研室，沈陽 110034； 2. 遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)重點實驗室，沈陽 110034）

目的研究在畢赤酵母重組子中高表達有活性人源超氧化物歧化酶 （SOD） 方法。方法在畢赤酵母構建表達重組人源SOD，對培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基中銅離子濃度和甲醇誘導條件進行優(yōu)化，并初步純化SOD。結果獲得了5個穩(wěn)定表達人源SOD的畢赤酵母重組子。色譜層析方法分離純化重組子培養(yǎng)上清中的SOD。在培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)基中銅離子濃度0.5%、甲醇誘導濃度1%時上清中SOD分泌量多，同時活力最好。結論建立畢赤酵母表達可溶性人源SOD的有效方法，實現(xiàn)了在畢赤酵母系統(tǒng)高效表達有活性人源SOD。為發(fā)酵生產人源SOD提供了研究基礎。

畢赤酵母； 重組子； 人源超氧化物歧化酶

超氧化物歧化酶 （superoxide dismutase，SOD） 是一種能夠催化有害的超氧化物通過歧化反應轉化為氧氣和過氧化氫的酶。1938年MANN和KEILIN［1］首次從牛紅細胞中分離出一種藍色的含銅蛋白質，直到1969年MCCORD及FRIDOVICH［2］發(fā)現(xiàn)該蛋白有發(fā)生歧化反應的功能。SOD是生物體內重要的抗氧化酶，廣泛分布在動物、植物、微生物等體內。SOD具有特殊的生理活性，是生物體內清除自由基的首要物質，它能夠平衡機體的氧自由基，從而避免體內超氧陰離子自由基濃度過高時引起的不良反應［2-3］?，F(xiàn)代生活壓力、環(huán)境污染、各種輻射和超量運動都會造成氧自由基大量形成?，F(xiàn)已證實，由氧自由基引發(fā)的疾病多達60多種［3-5］。SOD可對抗與阻斷氧自由基對細胞造成的損害，及時修復受損細胞，是一種很有用途的藥用酶。

SOD根據含金屬輔基的不同分為3種：Cu，Zn-SOD，Mn-SOD和Fe-SOD。哺乳類動物體內僅含有Cu，Zn-SOD與Mn-SOD。由于Cu，Zn-SOD的穩(wěn)定性高于Mn-SOD，并且在哺乳動物中含量遠高于Mn-SOD，因此Cu，Zn-SOD在臨床應用上更受重視［6-7］。SOD的獲得方法有3種：動物血、植物和基因工程菌中提取。從動物血液中可以大規(guī)模提取SOD，但是原材料有限，產品質量不穩(wěn)定，產品活力純度較低，而且動物源血液制品風險大，容易造成環(huán)境污染及安全性問題。從植物提取資源充足，不污染環(huán)境，但缺點是提取率較低、耗費大。同時來源于動植物的SOD均存在免疫原性等安全隱患。歐洲已從1999年禁止動物源性SOD用于人類［8］。從基因工程菌中獲得重組人源SOD則可以克服上述缺點。美國、日本及一些西歐國家已開發(fā)重組人源SOD藥物，有的研究已經進行了Ⅱ期和Ⅲ期臨床試驗［9-10］。 我國除開展直接從人血中提取SOD外，近年來也開展重組人源SOD的研究，包括在大腸桿菌、釀酒酵母、昆蟲細胞、馬鈴薯中表達重組SOD［11-13］?，F(xiàn)有國內市場上使用的SOD基本是動物血中提取的，而且天然來源的SOD穩(wěn)定性差。采用基因重組法生產人源SOD不僅可以降低其他來源SOD導致的免疫原性等安全問題，還可以解決人源SOD的來源有限問題。本研究利用基因工程技術，在畢赤酵母 （Pichia pastoris，P. pastoris）系統(tǒng)構建表達重組人源SOD，獲得純化、有活性的人源SOD；同時通過優(yōu)化在P. pastoris培養(yǎng)上清液中大量獲得可溶性人源SOD。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

超微量紫外可見光分光光度計、軌道式搖床（美國Termo公司） ；全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)（Tanon 2500R） ；細菌搖床（ 蘇州威爾公司） ；Whatman 3 MM濾紙（ Whatman 公司） ；硝酸纖維素膜（ 北京鼎國生物技術發(fā)展中心） ；Wstern blotting 試劑盒ECL系統(tǒng)（ 美國solarbio公司） ；Rabbit Anti-SOD 單克隆抗體（ 南京凱基生物公司） ；BMGY培養(yǎng)基（ 酵母粉1.0 g，蛋白胨2.0 g，YNB培養(yǎng)基1.34 g，0.1 mol/L pH6.0磷酸緩沖液，甘油1.0 mL，加蒸餾水到100 mL YP培養(yǎng)基） ；YNB培養(yǎng)基、YP瓊脂培養(yǎng)基（ 青島海博生物公司） ；瓊脂糖和低熔點瓊脂糖（ 南京生興生物公司） ；甲醇（ 沈陽國藥集團化學試劑公司）；10×CIP緩沖液、酚/氯仿、3 mol/L乙酸鈉、100%乙醇、80%乙 醇、Geneticin?抗 生 素、人 銅 鋅SOD（ Cu，Zn-SOD）酶聯(lián)免疫分析（ ELISA） 試劑盒。P. pastoris X33 /pPICZαA系統(tǒng)。Geneticin?抗生素（ 美國Gibco 公司）；人銅鋅SOD（ Cu，Zn-SOD） 酶聯(lián)免疫分析（ ELISA） 試劑盒（ 南京凱基生物公司） 。

1.2 P. pastoris系統(tǒng)表達重組人源SOD構建

1.2.1 pPICZa-Cu，Zn-SOD重組質粒構建：對照GeneBank查找獲得人源Cu，Zn-SOD基因序列，選擇酵母菌喜好的密碼子，優(yōu)化人源SOD基因DNA序列，PCR擴增合成可翻譯人源Cu，Zn-SOD的基因片段。按照pPICZa載體試劑盒說明，將合成SOD基因片段連接到載體上，并完成pPICZa-Cu，Zn-SOD重組質粒構建及陽性克隆篩選；于-20 ℃保持重組質粒備用。

1.2.2 P. pastoris X33/ pPICZa-Cu，Zn-SOD重組子構建及篩選：按照pPICZa載體試劑盒說明，完成pPICZa-Cu，Zn-SOD重組質粒轉化，挑選轉化菌株提取基因組DNA，PCR特異性擴增SOD基因片段，篩選出整合有SOD基因的P. pastoris X33轉化子。提取轉化菌株培養(yǎng)上清，Western blotting檢測分泌表達可溶性SOD產物的轉化菌克隆株，選擇分泌表達SOD較高的克隆株保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 P. pastoris重組子穩(wěn)定性測定：將上述篩選獲得P. pastoris X33/ pPICZa-Cu，Zn-SOD陽性克隆株培養(yǎng)48 h后，收集培養(yǎng)上清液經 Western blotting分析目的蛋白表達，將上述篩選獲得的陽性克隆株連續(xù)傳代30代，每傳代10次分別提取基因組DNA，PCR擴增鑒定轉化酵母菌株基因組是否穩(wěn)定整合SOD基因。

1.3 重組人源SOD的純化及活性檢測

離子交換柱層析Phenyl-HP Column純化目的蛋白重組人源SOD。 樣品，100 mL P.pastoris X33/pPICZa-SOD陽性克隆培養(yǎng)上清液；平衡緩沖液，20 mmol/L 磷 酸 鹽 緩 沖 液（ phosphate buffer，PB） ，3 mol/L（ NH4）2SO4，pH 7.4；洗脫液，20 mmol/L PB，2.5 mol/L、2 mol/L、1.5 mol/L、1 mol/L、0.5 mol/L 梯度（NH4）2SO4，pH 7.4。純化產物總SOD經ELISA試劑盒檢測。

1.4 P. pastoris系統(tǒng)表達重組人源SOD優(yōu)化

1.4.1 P. pastoris種子液制備：挑取單菌落于裝有100 mL BMGY培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，30 ℃、220 r/min離心培養(yǎng)24 h，備用。

1.4.2 不同濃度甲醇下P. pastoris重組子表達SOD活力測定：在各重組P. pastoris克隆株分泌表達SOD過程中，分別在其培養(yǎng)液中添加甲醇至終濃度分別為0.5%、1%、2%，于30 ℃、225 r/min離心培養(yǎng)48 h，測定SOD活力。

1.4.3 不同時間各濃度銅離子處理P. pastoris重組子表達SOD活力測定：在各重組P. pastoris克隆株分泌表達SOD過程中，分別在其培養(yǎng)液中添加硫酸銅至終濃度分別為0%、0.2%、0.5%、1%，于30 ℃、225 r/min離心培養(yǎng)24、48 、72 h，測定SOD活力。各培養(yǎng)基于30 ℃ 170 r/min過夜培養(yǎng)至對數(shù)期。

1.4.4 P. pastoris重組子表達SOD的Western blotting測定：將P. pastoris發(fā)酵液上清20 μ L與5×樣品緩沖液（ 20 μ L＋5 μ L） 在Eppendorf管中混合。放入100 ℃加熱 5～10 min，提取總蛋白。經SDS-PAGE電泳，轉膜，用50 g/L脫脂奶粉封閉1 h后，一抗為鼠抗人SOD抗體，二抗為辣根過氧化物標記的山羊抗鼠抗體（ 1∶5 000） ，ECL顯色液處理，成像目的條帶。

1.5 SOD活力測定

1.5.1 SOD標準曲線測定：在酶標包被板上設標準品濃度分別為72、48、24、12、6 U/mL，重復3次，于450 nm 波長依序測量各孔的吸光度 （optical density，OD）值。

1.5.2 樣品SOD活力測定：分別設空白孔和待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中加樣品稀釋（稀釋5倍） ，37 ℃溫育30 min，滌液靜置30 s后棄去，如此重復5 次，每孔加入酶標試劑50 μ L （空白孔除外） ，溫育30 min，加入顯色劑A50 μ L，加入終止液終止。450 nm 波長依序測量各孔OD 值。

1.6 統(tǒng)計學分析

SOD活力標測定的線性標準曲線建立采用最小二乘法，線性方程檢驗方法采用線性回歸方程的方差分析。不同濃度甲醇誘導下對6株不同重組子P. pastoris表達SOD活力差異采用單因素方差分析，不同時間、不同濃度銅離子處理重組P. pastoris表達SOD活力差異的檢驗采用重復測量資料的方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 P. pastoris系統(tǒng)表達重組人源SOD構建

選擇酵母菌喜好的密碼子，優(yōu)化人源SOD基因DNA序列；完成人SOD基因-pPICZa載體構建及陽性克隆篩選；目前保存有pPICZa-Cu，Zn-SOD重組質粒。完成pPICZa-Cu，Zn-SOD重組質粒轉化并整合到P. pastoris X33基因組；篩選獲得重組子陽性克隆6株，PCR擴增鑒定轉化酵母菌株基因組整合有SOD基因 （圖1） ，保存其中5個整合有SOD基因的重組P. pastoris克隆株。隨機挑取3個克隆株，經Western blotting測定表達人源SOD （圖2） 。

2.2 P. pastoris重組子穩(wěn)定性測定

圖1 PCR擴增鑒定P.Pastoris X33/ pPICZa-Cu，Zn-SOD陽性克隆Fig.1 Identification of P. pastoris X33/pPICZa-Cu，Zn-SOD-positive clones by PCR amplification

圖2 P. pastoris X33/ pPICZa-SOD陽性克隆上清中SOD表達Fig.2 Expression of SOD in culture supernatants of P. pastoris X33/pPICZa-SOD-positive clones

測定2、4、5# 3個克隆，培養(yǎng)傳代后是否能維持基因組整合人SOD基因的穩(wěn)定。在YPD平板上連續(xù)傳代30代，分別取單菌落，提取酵母菌基因組DNA，PCR均可擴增出人SOD基因片段，測定其DNA序列，證實該3個克隆株能穩(wěn)定攜帶SOD基因。見圖3。

2.3 重組人源SOD的純化及其活性測定

圖3 P. pastoris重組子穩(wěn)定性測定Fig.3 Stable insertion of the SOD gene in P. pastoris recombinants

結果顯示，有效純化來自于P. pastoris培養(yǎng)上清液中表達的人源SOD蛋白。純化的SOD蛋白保持活性，為295 U/mg，洗脫峰的電泳結果見圖4、圖5。

2.4 P. pastoris系統(tǒng)表達重組人源SOD的優(yōu)化

圖4 Phenyl-HP 柱層析純化培養(yǎng)上清液中SOD分析Fig.4 Analysis of SOD in culture supernatants by Phenyl-HP column chromatography

選取2#、4#、5# 3個克隆株，相同甲醇濃度 （1%）誘導和相同培養(yǎng)溫度（30 ℃），于不同培養(yǎng)時間取培養(yǎng)上清測定SOD表達。3個克隆株呈現(xiàn)不同的SOD表達動態(tài)變化。2#和4#克隆株在培養(yǎng)48 h后，上清中SOD表達增多。見圖6。

2.5 SOD標準品曲線確定

將不同酶活力的SOD標準品及各濃度下測得的OD值，做線性標準曲線，獲得SOD酶活力與吸光度值線性關系，見圖7。

2.6 不同濃度甲醇誘導P. pastoris表達SOD活力測定

改變甲醇的誘導濃度，對5株P. pastoris重組克隆株表達SOD酶活力的影響明顯不同。4#克隆株對甲醇誘導濃度變化敏感，當甲醇增加至1%濃度時，培養(yǎng)上清中表達SOD活力明顯提高，可達12 U/mL，顯著高于其他誘導濃度，差異具有統(tǒng)計學意義（ P ＜0.05） ，見圖8。

2.7 不同時間各濃度銅離子處理P. pastoris表達SOD活力測定

在1%甲醇誘導條件下，進一步優(yōu)化4#克隆株表達高活力SOD的培養(yǎng)條件。在發(fā)酵培養(yǎng)基中存在低濃度Cu2（+0%和0.2%） 和高濃度的Cu2（+1%） 時，均不影響表達SOD的酶活力；而在中濃度Cu2+（ 0.5%） 條件下可以顯著提高表達的SOD酶活力（ P ＜ 0.05） 。

圖5 純化的SOD產物15% SDS-PAGE分析Fig.5 Analysis of purified SOD products using 15% SDS-PAGE

圖6 不同培養(yǎng)時間不同克隆株SOD表達動態(tài)變化Fig.6 Dynamic changes in secretion of SOD expressed in P. pastoris recombinants at different times during culture

圖7 SOD標準品曲線Fig.7 SOD standard curve

此外，在低、中濃度Cu2+作用下，隨著發(fā)酵時間的持續(xù)，4#克隆株表達SOD活力呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，在發(fā)酵時間48 h時表達SOD活力達到最大值，為18.1 U/mL。但是，在高濃度Cu2+作用下，隨著發(fā)酵時間的持續(xù)，4#克隆株表達的SOD活力呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢，在發(fā)酵24 h時，SOD活力最大，為18.3 U/mL。見圖9。

3 討論

目前國內多報道利用大腸桿菌，釀酒酵母克隆來表達人Cu，Zn-SOD［12-13］。大腸桿菌由于是原核生物不能正確折疊成天然的蛋白質結構，而且表達產物多為非分泌表達的SOD，需要復性等方法才可以得到有活性的目的蛋白。而且背景雜蛋白較多，純化比較麻煩，以及存在內毒素難以去除等弊端［14］。釀酒酵母是真核生物，可以正確折疊和加工蛋白質，可分泌SOD到培養(yǎng)基中，還可以克服大腸桿菌系統(tǒng)可能導致的內毒素污染問題。但是釀酒酵母分泌效率低；大規(guī)模發(fā)酵生產時，產生的乙醇會影響菌體本身生長，難以進行高密度發(fā)酵生產［12-13，15］。

圖8 不同濃度甲醇下誘導P. pastoris重組子表達SOD活力Fig.8 Activity of SOD expressed in P. pastoris recombinants using different concentrations of methanol for induction

圖9 不同時間內各濃度銅離子處理P. pastoris重組子表達SOD活力Fig.9 Activity of SOD expressed in P. pastoris recombinants treated with copper ions at different incubation times

P. pastoris表達系統(tǒng)自建立以來，很多在其他系統(tǒng)難以表達的蛋白都在此得到了表達［16-17］。表達外源蛋白方面的優(yōu)勢是：表達系統(tǒng)安全無毒、不致病；高表達，表達水平在毫克級，比其他系統(tǒng)高出10～100倍；穩(wěn)定性高，整合的外源蛋白基因不易丟失；高分泌性；外源蛋白可進行多種修飾加工，更接近自然結構；該表達系統(tǒng)可以進行高密度發(fā)酵，產品容易純化［17］。本研究利用基因工程技術，在P.pastoris表達系統(tǒng)構建表達重組人源SOD，并獲得了5個穩(wěn)定整合SOD基因并表達分泌型SOD的克隆株。

通過對培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基中銅離子濃度和甲醇誘導條件的優(yōu)化，探討了P.pastoris表達人源Cu，Zn-SOD的有效方法。本研究中發(fā)現(xiàn)2#和4#克隆株培養(yǎng)48 h以后，發(fā)酵液上清中SOD含量開始增多，大量表達可溶性SOD。因為既要保證目的蛋白SOD在P. pastoris重組子的培養(yǎng)上清中有較高表達量，又需要表達的SOD維持較高的酶活力，才能發(fā)揮其抗氧化生物活性作用。因此，選取培養(yǎng)時間為48 h，通過不同濃度甲醇誘導SOD表達，不同的克隆株經誘導表達的SOD活力明顯不同。4#克隆株對甲醇誘導敏感，經1%甲醇誘導可表達高活力的可溶性SOD，表達的活力較其他條件所表達的活力顯著增加。選取4#克隆株進一步優(yōu)化，因為銅離子是Cu，Zn-SOD具有抗氧化酶活力重要的因素，所以在培養(yǎng)液中添加不同濃度銅離子來檢測SOD活力。銅離子濃度為0%～1.0%，隨著時間增加SOD活力呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，然而在高濃度銅離子條件下，隨著時間的增加SOD活力呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢。通過對培養(yǎng)條件優(yōu)化，明確了在培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)基中銅離子濃度為0.5%、甲醇誘導濃度1%時上清發(fā)酵液SOD分泌量多，同時活力最好。

綜上所述，本研究利用基因工程獲得有活性人源SOD，實現(xiàn)在P. pastoris系統(tǒng)高表達重組人源SOD，并通過優(yōu)化培養(yǎng)條件提高SOD活力，為其規(guī)模化生產提供研究基礎。同時，通過色譜層析方法，初步獲得了重組人源Cu，Zn-SOD的簡便、有效的分離純化方法，可以用于制備高純度、有活性的重組人源Cu，Zn-SOD。

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Construction of Recombinant Pichia pastoris Expressing Human SOD

LI Xinming1，2，SUN Ye1，2，XIAO Chunling2
（1. Department of Pathogenic Biology，College of Basic Medical Sciences，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China； 2. Liaoning Province Key Lab of Environment Pollution and Microecology，Shenyang 110034，China）

ObjectiveTo optimize the expression of active human Cu，Zn-superoxide dismutase （SOD） in recombinant Pichia pastoris（P.pastoris）.MethodsA recombinant human SOD expression construct was generated and expressed in P. pastoris. The culture time，concentration of copper ions in the medium，and conditions for methanol induction were optimized，and SOD was preliminarily purified.ResultsFive P. pastoris recombinants that stably expressed human SOD were obtained. SOD could be purified from the culture supernatants of the recombinant strains by chromatography. The amount of SOD secreted into the supernatant was high with optimal activity，when the incubation time was 48 h，copper ion concentration in the medium was 0.5%，and methanol concentration was 1%.ConclusionAn effective method for the expression of soluble human Cu，Zn-SOD in P. pastoris was established，and the enzyme produced using this method exhibited high activity. This method provides a foundation for further research on the production of human SOD by fermentation.

Pichia pastoris； recombinant； human superoxide dismutase

Q93-335

B

0258-4646 （2017） 12-1117-07

http://kns.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20171130.1810.024.html

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.12.013

沈陽市科學技術計劃 （F15-199-1-29）

李新鳴 （1973-） ，女，副教授，博士.

肖純凌，E-mail：xiaochunling@symc.edu.cn

2017-07-06

網絡出版時間：2017-11-30 18:10

（編輯 武玉欣）